Notice1.上課請關手機（或調成振動，接電話到室外）。2.選修課自愿選擇，試聽一次，下次課班長提交選修課學生名單(包括email)。3.學分問題⑴平時表現(xiàn)如：紀律、問答、作業(yè)。⑵結課測驗?⑶對本課程的意見和建議；組織病理學制片技術

Histopathologic

technology生命科學研究中心邢立強2目的和要求

AimsandRequirements了解生物組織的特點及取材的注意事項；熟悉切片的原理、一般要求及注意事項；掌握石蠟切片制作技術；病理學常用的觀察手段

Thecommonsurveymeansinpathology1、大體標本觀察：主要用肉眼、量尺及各種衡器等輔助工具，對所檢標本的大小、形狀、色澤、重量、表面及切面、病灶特點進行觀察及測量。2、組織切片的觀察：取正常或病變組織進行切片、染色(HE染色最常用)在顯微鏡下進行觀察。病理學標本的種類

Typesofpathologicsamples1、活體組織檢查(Biopsy)：簡稱活檢，從患者活體局部切取、鉗咬、細針吸取和摘取等手術方法獲取病變組織進行病理檢查。2、脫落細胞學檢查(Exfoliativecytologicalexam)：對患者痰液、胸腹水、尿液以及陰道刮片、食管拉網(wǎng)、纖維胃/支氣管鏡所取得的材料進行涂片，以檢查脫落細胞，是早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的好方法。3、尸體解剖(Autopsy)：通過尸檢可查出病因和病變，及時發(fā)現(xiàn)和確診某些傳染病、新發(fā)現(xiàn)的疾病，積累經(jīng)驗，提高診療水平。4、動物實驗(Animalexperiment)：根據(jù)研究需要，在動物身上復制人類某些疾病的模型、進行觀察研究，了解疾病的病因、發(fā)病機制及藥物療效等。5、組織/細胞培養(yǎng)(TissueandCellculture)：將某種組織或單細胞在適宜的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，來研究各種病因作用下組織、細胞的病理變化及治療效果。病理技術的應用Applicationofpathologictechnique幫助臨床查明死因(尸檢);手術后病變標本，明確診斷(臨床活檢);為教學、科研提供資料;取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脫水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蠟(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一節(jié)組織處理

Tissueprocessing

1.人為因素

2.標本大小

3.取材時間

4.包埋方向

5.邊緣標記一、取材(Samplescollection)6.小標本的處理方法

7.特殊情況取材

8.取材數(shù)量

9.清除多余成分10.重復取材11.核對取材12.剩余組織存放二、固固定(Fixation)固定就就是用用物理理或化化學方方法，，阻止止組織織細胞胞離體體或培培養(yǎng)細細胞脫脫離生生存環(huán)環(huán)境后后發(fā)生生形態(tài)態(tài)學變變化。。(一)固定的的目的的1.迅速阻阻斷組組織細細胞離離體后后的自自溶性性變化化，防防止腐腐敗，，盡量量保持持組織織細胞胞生活活狀態(tài)態(tài)下的的形態(tài)態(tài)結構構。2.使細胞胞內的的蛋白白質、、脂肪肪、糖糖、酶酶等成成分轉轉變成成不溶溶性物物質，，并保保持原原有的的空間間位置置。3.固定劑劑有硬硬化作作用,增加組組織的的硬度度,便于制制片。。4.組織中中的各各種物物質經(jīng)經(jīng)固定定后產(chǎn)產(chǎn)生對對染料料的親親和力力，利利于染染色和和觀察察。（二））常用用的固固定方方法1.浸泡固固定法法2.灌注固固定法法3.細胞涂涂片的的固定定方法法4.微波固固定法法5.蒸氣固固定法法（三））常用用的固固定液液1.單純固固定液液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸酸(picricacid)(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)2.混合固固定液液(1)Bouin液：：用于于結締締組織織及脂脂肪染染色；；(2)Zenker液：常常用于于三色色染色色；(3)4%多聚甲甲醛-磷酸二二氫鈉鈉-氫氧化化鈉液液；（四））固定定后的的處理理1.一般固固定液液(甲醛等等)固定組組織后后，用用流水水沖洗洗以清清除組組織內的的固定定液終終止固固定。。2.含有乙乙醇、、乙酸酸及苦苦味酸酸的固固定液液，組組織固固定后后不需需要或或不能能用水水沖洗洗。3.含有鉻鉻酸、、重鉻鉻酸鉀鉀和鋨鋨酸的的固定定液，，組織織固定定后應應充分分水洗洗，一一般為為12~24h。4.用含汞汞的固固定液液固定定組織織后，，要進進行脫脫汞處處理，，可在在組織織脫水水前或或切片片染色色前進進行，，一般般多在在染色色前脫脫汞。。其方方法為為切片片脫蠟蠟入水水后，，入0.5%碘乙醇醇5~10min，水洗洗后再再入3%~5%硫代硫硫酸鈉鈉或95%乙醇1~2min，再充分水水洗，蒸餾餾水洗后進進行染色。。（五）固定定時的注意意事項1.標本應應新鮮并及及時取材，，快速放入入固定液中中。特殊標標本應單獨獨固定和存存放。2.固定液的用用量一一般固定液液用量為組組織塊體積積的10~20倍，貴重的的固定液不不少于3~5倍。避免組組織緊貼容容器底部，，影響固定定效果。對對于特殊染染色的組織織(如神經(jīng)染色色及酶組織織化學染色色等)固定時應考考慮組織塊塊的大小、、固定液種種類、固定定時間和溫溫度等。酶酶組織化學學染色組織織的固定應應置于冰箱箱4℃固定。3.防止組織變變形柔柔軟或較薄薄的組織先先平鋪在吸吸水紙上，，再投入固固定劑中；；含氣或脂脂肪多的組組織易浮于于液面，可可在組織表表面覆蓋棉棉花以達到到充分固定定。4.固定液的穿穿透性一一般固定定液在24h內不能穿透透厚度大于于2~3mm的實體組織織或5mm的多孔疏松松組織，故故取材組織織塊的厚度度原則上不不應超過3~4mm。5.固定時間固固定的的時間與固固定液的種種類、組織織類型、塊塊大小、溫溫度等有關關。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的組織織塊,固定時間為為12~24h。6.固定溫度大大多數(shù)數(shù)可在室溫溫(25℃)固定，在低低溫(如4℃)固定時，固固定時間要要相應延長長。三、脫水(Dehydration)組織經(jīng)固定定和水洗后后含大量水水分，水與與石蠟不能能混溶。因因此在浸蠟蠟和包埋前前，必須進進行脫水。。常見的脫水水劑有乙醇醇、正丁醇醇、丙酮等等。為防止水份份丟失過快快，造成組組織變形，，一般采用用梯度脫水水法。也就就是使脫水水劑的濃度度逐漸升高高，脫水過過程盡量緩緩和，減少少組織變形形。四、透明(Transparentizing)常用的透明明劑有二甲甲苯、苯、、甲苯、氯氯仿、環(huán)己己酮、苯甲甲酸甲酯、、香柏油、、冬青油和和苯胺油等等。目前也有用用環(huán)己酮作作為透明劑劑，環(huán)己酮酮為無色無無毒液體，，可與苯、、二甲苯和和酒精等相相混合，也也可溶解石石蠟。而且且脫水時組組織不收縮縮變硬，用用于快速石石蠟切片效效果較好。。五、浸蠟(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切切片石蠟逐逐漸替換組組織中二甲甲苯的過程程。六、組織的的包埋和包包埋方法(Embedding)（一）常規(guī)規(guī)石蠟包埋埋（二）脫落落細胞標本本的包埋（三）微小小標本的包包埋第二節(jié)組組織切片片法(Tissuesectioning)組織切片法法包括石蠟蠟切片法、、冰凍切片片法、火棉棉膠切片法法、樹脂包包埋薄切片片法和大組組織石蠟切切片法等。。常用的切切片工具包包括組織切切片機、切切片刀和自自動磨刀機機等。一、組織切切片機和切切片刀1.石蠟切片機機2.火棉膠切片片機3.恒冷箱切片片機4.震動切片機機石蠟切片機震動切片機恒冷箱切片機切片刀切片刀是切切片機的重重要部件，，常見的有有兩種：一種為可重重復使用的的鋼刀，一一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根據(jù)切切片刀的形形態(tài)，有平平凹型、深深平凹型、、平楔型、、雙凹型。。另一種為一一次性鋼刀刀片，是一一種薄型切切片刀片，，用于普通通石蠟切片片。使用時時固定在特特制的刀架架上。各種切片刀刀的剖面圖圖a平凹形b深平凹形c平楔形d雙凹形石蠟切片機機用一次性性鋼刀片二、組織切切片(Tissuesectioning)石蠟切片仍仍是目前各各種切片制制作方法中中最常用、、最普遍的的一種方法法。(一)切片前的準準備1.備齊常用器器具,如玻片、毛毛筆和鉛筆筆或刻字筆筆。2.檢查切片機機的工作狀狀態(tài),將固件都擰擰緊，檢查查切片刀是是否鋒利,切片刀質量量是保證切切片的關鍵鍵。如果使使用一次性性刀片,應根據(jù)切片片情況及時時調整刀刃刃位置。3.清潔玻片的的方法（1）新載玻片片的處理：：先用清潔液液浸泡12~24h,流水充分沖沖洗后,用蒸餾水洗洗3~5遍,95%酒精浸泡2h,用綢布擦干干或用烘箱箱烤干備用用。清潔液液是用重鉻鉻酸鉀和濃濃硫酸按比比例配成的的洗液。常用的有以以下幾種配配方：①重鉻酸鉀鉀(g):濃硫酸(ml):蒸餾水(ml)=1:1:10;②重鉻酸鉀鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:3:25;③重鉻酸鉀鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:5:15。（2）蓋玻片的的處理：蓋蓋玻片可按按以上方法法處理，但但因蓋玻片片很薄，以以上處理程程序應縮短短。清潔液液浸泡2h，流水沖洗洗。也可用用以下方法法清洗:蓋玻片立排排于臥式染染缸(排2行，中間隔隔以載玻片片)。松緊度以以玻片可輕輕松轉動為為好，以下下步驟應保保持液體進進入每個玻玻片間隙，，玻片之間間不能有氣氣泡。用1%鹽酸酒精浸浸泡2h，然后流水水沖洗干凈凈，再用蒸蒸餾水沖洗洗數(shù)次。入入95%酒精浸泡2~3h，無水酒精精浸泡20min，倒掉酒精精放60℃烘箱烤干備備用。（二）切片片制作過程程1.蠟塊在冰箱箱中預冷，，然后固定定在切片機機上。將切切片刀裝在在刀架上。。調整蠟塊塊與刀的位位置，使蠟蠟塊切面與與刀刃接近近。2.切片機多為為輪轉式，，使用時左左手執(zhí)毛筆筆，右手旋旋轉切片機機轉輪。先先修出標本本，直到組組織全部暴暴露于切面面為止，標標本過小時時修塊應多多加注意，，大標本要要切全。切切出蠟帶后后，用毛筆筆輕輕挑起起一端，用用鑷子夾起起另一端，，正面向上上放入展片片水槽中(水溫一般低低于蠟熔點點10~12℃)，待切片展展平后，即即可進行撈撈片。3.切片時刀是是由下向上上運動，為為得到完整整的切片，，防止組織織出現(xiàn)刀紋紋裂縫，應應將組織硬硬脆難切的的部分放在在上端(如皮膚組織織的表皮部部分，胃腸腸等組織的的漿膜面等等)。4.撈片時注意意組織片的的擺放位置置，盡量整整齊美觀。。要留出貼貼標簽的空空間，5.撈片時注意意在切片和和玻片之間間不要留有有氣泡。撈撈好的切片片應在60℃左右烤箱內內烤至少30min。以防染色色時脫片。。（三）石蠟蠟切片制作作時的注意意事項(Attentions)1.組織的取材材和固定；；2.組織脫水、、透明和浸浸蠟；3.切片組織塊塊固定不牢牢時；4.切片刀和切切片機；；5.特殊要求切切片的制作作。第三節(jié)冰冰凍切片法法(Frozensectioning)冰凍切片可可用于新鮮鮮組織、甲甲醛固定的的組織和低低溫冰箱冷冷藏的組織織塊等。已已固定的組組織塊經(jīng)流流水沖洗后后再進行切切片。一、冰凍切切片法（一）恒冷冷箱切片機機提前開機預預冷，一般般工作溫度度設定在-22℃左右。待刀刀臺、樣品品臺和箱內內達到設置置溫度后即即可切片。。順序如下下：①將組組織用OCT粘在樣品托托后放置在在速凍臺上上；②組織織凍結后，，將樣品托托固定到樣樣品臺上；；③調整組組織切面與與刀刃位置置，初步修修出組織切切面后，放放下防卷板板，關閉觀觀察窗，開開始切片。。④切出的的切片粘貼貼到載玻片片上，直接接凍存或吹吹干固定。。（二）半導導體制冷切切片機二、冰凍組組織的取材材及保存方方法（一）取材材負責診斷的的醫(yī)師應親親自檢查大大體標本，，做多切面面詳細檢查查，必要時時可在解剖剖鏡下觀察察。選取最最具代表性性的組織制制片，必要要時應多點點取材。如如切面有特特殊要求，，應向技術術人員說明明。取材和和切片的剩剩余組織須須進一步做做石蠟切片片進行對照照，有利于于病理醫(yī)師師對照閱片片，不斷提提高觀察冰冰凍切片的的水平。（二）保存存方法組織速凍的的方法很多多，常用方方法為液氮氮和干冰~丙酮法。1.液氮法：將將組織塊平平放于瓶蓋蓋或標本盒盒等適當容容器內，緩緩慢放入盛盛有液氮的的容器內。。當組織塊塊凍結后，，取出用鋁鋁箔包好，，做好標記記后入液氮氮罐或-70℃低溫冰箱保保存。可保保存數(shù)月至至數(shù)年。如如短期內使使用，可保保存于-30℃冰箱。2.干冰-丙酮法：將將組織塊放放入盛有OCT包埋劑的標標本盒內，，使組織塊塊完全浸沒沒。將丙酮酮倒入盛有有10g干冰的保溫溫杯調成糊糊狀。將裝裝有組織塊塊的標本盒盒放入保溫溫杯，待包包埋劑成白白色凍塊時時，取出如如上法保存存。此法組組織速凍快快，組織結結構保存好好。3.異戊烷-液氮法：此此法的優(yōu)點點可防止冰冰晶破壞組組織細胞的的形態(tài)結構構，對含水水較多的組組織適宜用用此法進行行速凍。先先用甲基纖纖維素包埋埋組織塊。。將盛有異異戊烷的小小燒杯放入入裝有液氮氮的大保溫溫杯或冰壺壺內，攪拌拌異戊烷待待杯底出現(xiàn)現(xiàn)一層白色色糊狀物時時，放入包包埋好的組組織塊，數(shù)數(shù)秒鐘即可可取出，按按上述方法法保存。（三）注意意事項1.液氮速凍時時，標本盒盒不能直接接浸入液氮氮，以免組組織膨脹破破碎。2.速凍的包埋埋劑應適量量。3.新鮮組織不不能放入-10℃冰箱內緩慢慢冷卻，否否則組織內內水分可逐逐漸析出形形成冰晶，，造成組織織結構破壞壞。4.冷凍后的組組織塊應密密封保存，，防止失水水。5.在組織塊復復溫時，應應在37℃加溫速融，，自然復溫溫將造成組組織結構破破壞。第四節(jié)脫脫落細胞胞制片技術術PreparationofExfoliativecytologicsamples脫落細胞標標本包括：：胸水、腹腹水、尿液液、腦脊液液穿刺液和和一些涂片片、刷片及及印片的細細胞，在臨臨床上具有有非常重要要的診斷價價值。一、細胞標本本的取材細胞標本取材材和制片方法法一般有印片片法、穿刺法法、沉淀法和和活細胞標本本的制備等。。(一)印片法常用于活檢和和手術標本，，新鮮標本沿沿病灶中心剖剖開，將載片片輕壓于切面面上，吹干后后立即浸入固固定液內5~l0min，取出自然干干燥，低溫儲儲存。優(yōu)點是是操作簡單，，細胞抗原保保存好。(二)穿刺液沉淀法法常用于淋巴結結、軟組織、、肝、腎和肺肺等，穿剌液液少，可直接接涂片，細胞胞盡量涂均勻勻。穿刺液多多，細胞豐富富，可置離心心管內，以500rpm低速離心5~l0min，棄上清，將將沉淀制成細細胞懸液(2×105細胞/ml)。涂片鏡檢,以細胞較密不不重疊為好。。干燥后固定定。胸水、腹腹水、尿液和和腦脊液等如如細胞較少時時，也可用此此方法制片。。此法細胞保保存好，操作作簡單。注意意涂片時，盡盡量涂均勻。。(三)單核細胞分離離法主要用于外周周血和胸腹水水中淋巴細胞胞的分離。如如為血性胸腹腹水，經(jīng)上述述方法分離淋淋巴細胞然后后在37℃培養(yǎng)30min，離心沉淀取取上清，制成成濃度為2×106細胞/ml的細胞懸液，，吸50μl涂片，略干后后固定l0min。2023/1/156宮頸脫落細胞胞涂片見分化不良細細胞體積大、、核深染；正正常上皮細胞胞核小、胞漿漿豐富。二、血涂片的的制作血涂片的顯微微檢查是血液液細胞學檢查查的基本方法法，臨床上應應用極為廣泛泛，制備厚薄薄適宜、分布布均勻、染色色良好的血涂涂片是血液學學檢查的基本本技術之一。。(一)操作步驟1.消毒：先按摩摩取血部位，，使血流通暢暢；再用酒精精消毒采血針針和取血部位位(如指尖)。2.取血：待酒精精干后，刺破破皮膚，使血血自然流出，，勿擠。取干干凈載片，讓讓血滴在離載載片一端中4~5mm處，注意手指指持握載片的的邊緣，勿觸觸及其表面。。不能使載片片接觸取血部部位的皮膚。。3.推片：取一張張邊緣光滑的的載片。將其其一端置于血血滴前方，向向后移動到接接觸血滴，使使血液均勻分分散在推片與與載片的接觸觸處。然后使使推片與載片片呈30°~40°角，向另一端端平穩(wěn)地推出出。涂片推好好后，通過搖搖擺使之快速速干燥。4.染色：用特種種玻璃鉛筆在在血膜兩側畫畫兩條線，防防止染液外溢溢。再將瑞氏氏染液(伊紅-亞甲基藍)滴在血膜上，，至染液淹沒沒全部血膜，，染半分鐘。。加等量蒸餾餾水(或緩沖液)與染液混合再再染5分鐘。最后用用蒸餾水把染染液沖掉，用用吸水紙吸干干，自然干燥燥后，即可觀觀察。（二）注意事事項活細胞標本制制備中玻片的的清洗：新玻玻片常有游離離堿,因此應用清洗洗液或10%鹽酸浸泡24h,然后再徹底清清洗。用過的的玻片可放入入適量肥皂水水或合成洗滌滌劑的清水中中煮沸20min,再用熱水將肥肥皂和血膜洗洗去，用自來來水反復沖洗洗,必要時再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或或烤干備用。。一張良好的的血片，要求求厚薄適宜，，頭體尾分明明，分布均勻勻，邊緣整齊齊，兩側留有有空隙。血片片制好后最好好立即固定染染色，以免細細胞溶解和發(fā)發(fā)生退行性變變。三、活細胞標標本的制備多用于科研，，用于常規(guī)病病理診斷的較較少。標本主主要來源于建建株的培養(yǎng)細細胞，短期培培養(yǎng)細胞和外外周血等。細細胞可直接培培養(yǎng)在蓋玻片片上，固定后后即可進行染染色觀察或進進行免疫組織織化學染色或或掃描電鏡標標本制備。也也可培養(yǎng)于培培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)養(yǎng)板內，制成成細胞懸液，，收集一定的的細胞還可進進行涂片。可可以經(jīng)離心后后，進行透射射電鏡標本制制備。謝謝大家！2023/1/162脫落細胞學學檢查采集病變處處脫落細胞胞固定、涂涂片染色后后進行觀察察。如：子子宮頸癌、、食管癌、、鼻咽癌—直接采集，，肺癌—自然分泌物物(痰)7.圖象分析技技術病理學形態(tài)態(tài)觀察的一一種更為精精確的定量量標準和方方法。主要應用于核形態(tài)參參數(shù)的測定定(如核直徑、、周長、面面積、體積積、形態(tài)因因子等)。也用于區(qū)別腫瘤的良惡惡性、區(qū)別癌前病變和和癌、腫瘤瘤的組織病病理分級和和判斷預后后等。還可用于DNA倍體的測定定和顯色反反應(如免疫組織織化學)的定量等方方面。632023/1/12023/1/1643、組組織織化化學學和和細細胞胞化化學學的的觀觀察察：：一般般稱稱為為特殊殊染染色色，通通過過應應用用某某些些能能與與組組織織細細胞胞化化學學成成分分特特異異性性結結合合的的顯顯色色試試劑劑，，顯顯示示病病變變組組織織細細胞胞的的化化學學成成分分(如蛋蛋白白質質、、核核酸酸、、脂脂類類、、糖糖類類等等)。4、免免疫疫組組織織化化學學觀觀察察：：利用用抗抗原原與與抗抗體體的的特特異異性性結結合合反反應應來來檢檢測測組組織織中中未未知知的的抗抗原原或或抗抗體體，，借借以以判判斷斷腫腫瘤瘤的的組組織織來來源源與與分分化化方方向向。。9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黃葉葉樹，燈下下白頭人。。。14:04:4814:04:4814:041/1/20232:04:48PM11、以以我我獨獨沈沈久久，，愧愧君君相相見見頻頻。。。。1月月-2314:04:4814:04Jan-2301-Jan-2312、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。14:04:4814:04:4814:04Sunday,January1,202313、乍見翻疑夢夢，相悲各問問年。。1月-231月-2314:04:4814:04:48January1,202314、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。01一月月20232:04:48下下午14:04:481月-2315、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。一月232:04下午午1月-2314:04January1,202316、行動出成成果，工作作出財富。17、做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。。7:40:33上午7:40上午07:40:331月-239、沒有失敗，只有暫時停止成功！。1月-231月-23Thursday,January19,202310、很多事情努力了未必有結果，但是不努力卻什么改變也沒有。。07