會計學1DNA抽提和質粒DNA制備核酸分子抽提的技術設計核酸的釋放：

破裂細胞釋放核酸機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應用最廣泛的方法）核酸的分離與純化：

將含有核酸分子復雜復合物中，將核酸與其他物質分離非核酸的大分子污染物（蛋白質、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液第1頁/共94頁第2頁/共94頁第3頁/共94頁核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌第4頁/共94頁鑒定與保存（一）核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定第5頁/共94頁濃度鑒定1紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計算DNA濃度A260×稀釋倍數×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。第6頁/共94頁2熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。第7頁/共94頁純度鑒定1紫外分光光度法：在260nm和280nm處測定DAN溶液的光吸收，A260與A280之比應在1.80。低于此值表明制備物中留有蛋白質成份。高于此值表明有RNA的殘留量。A260/A280比值是純度檢測的重要指標。第8頁/共94頁2熒光光度法核酸電泳結果進行評定。第9頁/共94頁完整性鑒定凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發生降解，可出現電泳圖譜脫尾現象；總RNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNA降解；如加樣槽中存在條帶，可能是DNA污染。第10頁/共94頁第11頁/共94頁

第12頁/共94頁核酸的貯存——DNA保存

1

短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。2長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。第13頁/共94頁核酸的貯存——RNA保存RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸水，在-70℃保存。RNA可溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可在-20℃保存。第14頁/共94頁基因組DNA的分離與純化第15頁/共94頁第16頁/共94頁DNA樣品準備

常見的標本：血液、尿液、唾液、組織及培養細胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應貯存－70℃或液氮第17頁/共94頁DNA提取1酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎細胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。第18頁/共94頁主要試劑的作用：

EDTA：1二價金屬螯合劑，抑制核酸酶；2降低細胞膜的穩定性第19頁/共94頁SDS的作用：1溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂；2溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；3對RNA、DNA酶有抑制作用；4與蛋白質形成R-O-SO3….R蛋白質復合物，使蛋白質變性。第20頁/共94頁蛋白酶K：水解蛋白質的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用。第21頁/共94頁酚可以使蛋白質變性沉淀、抑制DNA酶活性。PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA進入水相，減少在蛋白質層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產生，而且利于分相，保持分相的穩定性。第22頁/共94頁2甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質與DNA的復合物，可以使蛋白質變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA200kb左右。第23頁/共94頁3玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。第24頁/共94頁4異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）。5表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。第25頁/共94頁DNA樣品的純化：透析、層析、電泳及選擇性沉淀。電泳法簡單、快速，是DNA樣品純化最重要的方法。瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺電泳。PAGE分辨率高，適用于5-500bp大小的片段。第26頁/共94頁

瓊脂糖含量％（W/V）

線性DNA分離范圍（Kb）0.3

5-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1–2第27頁/共94頁DNA的濃縮

1、

固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。2、

丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復幾次可顯著減少DNA體積。第28頁/共94頁

DNA的檢測

溴乙錠染色：在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ngDNA。銀染法：Ag+與DNA形成復合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。第29頁/共94頁DNA分析

通常與已知分子量的標準DNA片段一起電泳，經比較可獲知DNA標本大小，如條帶拖尾，系加入DNA量太多或凝膠未制好，如分子量小或一片糊狀，表示DNA有降解。第30頁/共94頁DNA回收

主要是從電泳中分離回收DNA片段。回收原則：盡量提高回收率去除回收DNA樣品中的污染物第31頁/共94頁電泳到DEAE-纖維素膜：

DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負電荷的DNA分子。

在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過10kb和單鏈DNA。

第32頁/共94頁透析袋電洗脫：

切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內，加緩沖液后繼續電泳，DNA出膠后進行抽提DNA回收。第33頁/共94頁低熔點瓊脂糖凝膠：切下膠，加熱到65℃熔化膠，然后抽提回收DNA。

方法：有機溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。第34頁/共94頁玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結合DNA，經分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。第35頁/共94頁瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA第36頁/共94頁問題從細胞或組織中分離DNA時，常用蔗糖，目的是（）

A抑制核酸酶

B保護DNA，防止斷裂

C加速蛋白質變性

D有利于細胞破碎第37頁/共94頁用SDS-酚抽提DNA時，SDS濃度十分重要，當SDS濃度為0.1%時，（）A只能將DNA抽提到水相B只能將RNA抽提到水相C可將DNA、RNA一起抽提到水相DDNA和RNA都不能進入水相第38頁/共94頁異戊醇的作用是（）A使蛋白質脫水B使DNA進入水相C幫助DNA進入水相D減少氣泡，促進分相第39頁/共94頁變色的酚中含有氧化物，這種酚不能用于DNA分離，原因主要是（）A氧化物可使DNA磷酸二酯鍵斷裂B氧化物會改變PH值C氧化物同DNA形成復合物D氧化物在DNA分離后不易除去第40頁/共94頁酚抽提蛋白質時，離心后，為什么蛋白質總是會停留在水相和酚相之間？

酚使蛋白質分子間脫水而變性，變性的蛋白的密度比水大，但比酚小，故停留在兩者之間。第41頁/共94頁為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？苯酚在空氣中經常被氧化生成醌，它能夠產生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調節至中性。另外使用飽和酚減少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的損失率。第42頁/共94頁第43頁/共94頁質粒DNA制備

第44頁/共94頁質粒簡介

質粒是細菌內獨立于染色體并能自我復制的小環狀DNA分子

其大小范圍從lkb至200kb以上不等。

已經在形形色色的細菌類群中發現質粒.這些質粒都是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。

第45頁/共94頁第46頁/共94頁第47頁/共94頁

由質粒產生的表型包括對抗生素的抗性、降解復雜有機化合物，以及產生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等等。

第48頁/共94頁質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，而質粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術．第49頁/共94頁質粒依賴于宿主編碼的酶和蛋白質來進行復制和轉錄。質粒含有編碼某些酶的基因，在一定的環境下對細菌宿主有利。第50頁/共94頁質粒特性

1.分子相對小2.含有高效的自主復制成分3.不相容性4.轉移性5.選擇的標記6.限制性內切酶單一切口第51頁/共94頁常用質粒載體

pBR322

pBR322是一種使用最廣泛的質粒，全長為4363bp，由3種野生型質粒成分組成，ampr基因來自pRSF2124，tetr來自pSCl01，復制起始點來自pM9。核苷酸的序次號，以EcoRI序列GAATTC的第一個T為第一個核苷酸。第52頁/共94頁第53頁/共94頁

pUC系統

l

如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和復制子，以及大腸桿菌部分1acZ基因和一個多種限制性內切酶單一位點的接頭構成，全長2666bp，pUCl8和pUCl9所含多位點接頭的方向正好相反。

第54頁/共94頁第55頁/共94頁表達載體

載體含有tac啟動子、Lac操縱基因、SD序列、LacI阻遏蛋白基因等

第56頁/共94頁四、質粒DNA的提取和純化

1．細菌的培養l

先分離單個菌落，接種到含少量適當抗生素的培養基中擴增，隨著細菌的生長，質粒DNA也在自主復制。第57頁/共94頁對于松弛型質粒，由于它的復制在一定程度上不受到宿主細胞的控制，故在細菌對數生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質的合成和染色體DNA的復制。質粒DNA的復制不受影響而大量擴增。第58頁/共94頁l

所以使用氯霉素的主要目的，是在不減低質粒產量的前提下，減少細菌的培養體積和細菌的數量．

有時質粒在細菌中的擴增狀況很差，常是由于質粒攜帶外源基因或質粒分子量過大所致。第59頁/共94頁2．細菌的收集與裂解

細胞生長過程中，排出大量代謝產物，為了提高質粒DNA的純度，離心棄上清，細菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應該仔細去除干凈。

第60頁/共94頁細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據質粒性質、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。

第61頁/共94頁3質粒DNA的抽提第62頁/共94頁

質粒DNA的小量制備2-5ml質粒DNA的大量制備500ml堿裂解法

方法煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法第63頁/共94頁（三）質粒DNA提取方法的選擇

l

常用的煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果．至于有人采用堿法提取小量細菌培養物的質粒，用煮沸法或SDS法進行質粒DNA的大量分離，只是各個實驗室的習慣問題.第64頁/共94頁l

選擇哪種方法制備質粒DNA，應考慮以下因素：1．菌株類型2．質粒的大小3．細菌染色體DNA變性條件強弱的控制4．細菌的培養與收集第65頁/共94頁（四）堿裂解法原理：

在pHl2.0-12.6堿性環境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(CC)質粒DNA仍為自然狀態。

第66頁/共94頁

將pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構。大部分DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而CC質粒DNA仍然為可溶狀態。

第67頁/共94頁通過離心，可去除大部分細胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。第68頁/共94頁（二）煮沸裂解法利用溶菌酶和TritonX-100破壞細胞壁，在將裂解液煮沸。原理：加熱可使蛋白質和染色體DNA變性，但環狀質粒DNA結構緊密而不會解鏈，溫度下降后，質粒DNA又重新恢復超螺旋結構。通過離心去除變性的蛋白質和染色體DNA，回收上清液中質粒DNA第69頁/共94頁煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質粒。對于會釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。第70頁/共94頁（三）SDS裂解法比較溫和的抽提方法。將細菌懸浮在等滲的蔗糖溶液中，以溶菌酶和EDTA裂解酚-氯仿抽提。適合于大于15kb的質粒DNA的抽提，但產率不高。第71頁/共94頁第72頁/共94頁第73頁/共94頁第74頁/共94頁4．質粒DNA純化

l

質粒從細菌中分離出來以后，為滿足有些實驗的要求還應進一步純化。CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質粒的可靠經典方法。

但是由于此法費用昂貴及流程長，近年來，發展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質量的質粒DNA。第75頁/共94頁l

轉基因動物，真核細胞轉染及DNA外切酶酶切缺失等實驗，對閉合環狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質粒。

對于DNA片段酶切回收，內切酶圖譜分析、細菌轉化、亞克隆及探針放射性標記等實驗，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。第76頁/共94頁1CsCl-EB法超速離心將介質CsCl形成一連續的密度梯度，在過量EB存在下，蛋白質的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結構的DNA與EB結合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環、閉環的DNA區分開。第77頁/共94頁2聚乙二醇沉淀法分級沉淀，首先利用LiCl沉淀大分子RNA，用Rnase酶消化小分子RNA；在利用乙二醇選擇性沉淀大質粒DNA，再利用酚-氯仿抽提。

方法簡單實用，但是不能區分環狀