BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥基因工程制藥GeneEngineeringforPharmaceutics

（五）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥1.簡述大腸桿菌基因表達產物的分離純化。2.基因工程藥物分離純化的一般流程。3.分離純化目的產物的四類色譜分離技術的原理及選擇原則。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥第七節基因工程藥物的質量控制一、原材料的質量控制

確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩定，以保證產品質量的安全性和一致性。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥一、原材料的質量控制（1）明確目的基因的來源、克隆經過，并以限制性內切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證；（2）提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及其各組成部分（如啟動子、復制子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標志物；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（3）提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性；（4）闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內的狀態，如是否整合到染色體內及在其中的拷貝數，并證明宿主細胞與載體結合后的遺傳穩定性；一、原材料的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（5）提供插入基因與表達載體兩側端控制區的核苷酸序列，詳細敘述在生產過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。一、原材料的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩定；在培養過程中，要求工程菌所含的質粒穩定，始終無突變；在重復生產發酵中，工程菌表達穩定；始終能排除外源微生物污染。二、培養過程的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（1）生產基因工程產品應有種子批系統，并證明種子批不含致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產用工作細胞庫；（2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統的穩定性；二、培養過程的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（3）對生產種子，應詳細敘述細胞生長與產品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培養生產濃度與產量恒定性數據，依據宿主細胞-載體系統穩定性，確定最高允許傳種代數；二、培養過程的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（5）培養過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養后的基因型特征；以宿主細胞-載體穩定性與產品恒定性，規定持續培養時間，并定期評價細胞系統和產品；二、培養過程的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（6）培養周期結束時，應檢測宿主宿主細胞載體系統的特性，如質粒拷貝數、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。二、培養過程的質量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥三、純化工藝中的質量控制1、產品要有足夠的生理和生物學試驗數據，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質、DNA與熱原質都控制在規定限度以下。

2、在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質、核算、糖類、病毒、培養基成分及精制工序本身引入的化學物質，并有檢測方法。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥四、目標產品的質量控制

電泳方法：SDS,等電聚焦，免疫電泳免疫學方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting

受體結合實驗（ReceptorBinding）各種高效液相分析法（HPLC）肽圖分析法

EdmanN末端序列分析法圓二色譜（CD）

NMR1、產品的鑒別表3重組蛋白質藥物產品常用的鑒別方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥（1）肽圖分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15個氨基酸（4）重組蛋白質的濃度測定和相對分子質量測定（5）蛋白質二硫鍵分析1、產品的鑒別BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥2、純度分析（1）目的蛋白質含量測定（2）雜質：分蛋白類雜質和非蛋白類雜質。3、生物化學測定4、穩定性考察5、產品一致性的保證1、產品的鑒別BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥

雜質和污染物檢測方法

內毒素鱟試劑、家兔熱源法宿主細胞蛋白免疫分析、SD、CE

其他蛋白雜質（如培養基）SDS、HPLC、CE、免疫分析殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE

甲酰基甲硫氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE表4基因工程產物中常見雜質和污染物及其檢測方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥

甲硫氨酸氧化肽譜、氨基酸分析、HPLC、質譜、Edman分析產物變性或聚合脫氨基SDS、凝膠排阻色譜、

IEF、HPLC、

Edman分析、CE

親和配基脫落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、CE、

Edman分析、質譜微生物（細菌、酵母、真菌）微生物學檢查支原體微生物學檢查病毒微生物學檢查表4基因工程產物中常見雜質和污染物及其檢測方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥五、產品的保存⒈液態保存

⑴低溫保存：液態蛋白質樣品在-10~-20℃以下冰凍保存。

⑵在穩定pH下保存：蛋白質較穩定的pH一般在等電點，且多數蛋白質只有在很窄的pH范圍內才穩定。因此對保存液態蛋白質樣品時小心調到其穩定的pH范圍內。

⑶高濃度保存：一般蛋白質在高濃度時比較穩定，因為液態蛋白質容易受水化作用的影響，濃度太低易引起亞基解離和表面變性。

⑷加保護劑保存：2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、多元醇、有機溶劑等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥五、產品的保存⒉固態保存（干粉或結晶）長期保存蛋白質的最好方法是制成干粉或結晶。在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于干燥器中在（內裝有干燥劑），保存在0~4℃冰箱即可。為了取樣方便和避免取樣時吸潮和被污染，可先將樣品分裝成小瓶，每次用時只取出一小瓶。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥基因工程藥物制造實例Question1：生物藥物按功能用途分哪幾類？本實例為熒光免疫親和試劑。Question2：在微生物學中，SPA指的是什么？有什么生物學特性？Question3：用作基因表達的微生物宿主細胞有哪些？本實例既是利用基因工程技術，將SPA與綠色熒光蛋白基因重組，利用E.coli表達系統分泌表達該融合蛋白。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥Vector:BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥TargetgeneQuestion4：怎樣獲得目的基因？PCR方式獲得BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥陽性克隆的篩選BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥目的蛋白的分離純化Question5：你了解哪些關于基因工程藥物的分離純化方法？BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制藥思考題1.對由基因重組技術所獲得的蛋白質藥物產品進行鑒定時，常做哪些項目分析？2.生物技術產品如何保存?Biote