EnzymeEngineering

酶工程第三章酶的生產制備

酶的生產方式1.提取法:植物、動物、微生物2.化學合成法生物合成法：利用植物、動物、微生物細胞合成。上個世紀50年代起利用微生物生產酶。1949年細菌發酵生產淀粉酶上個世紀70年代以來利用植物細胞和動物細胞培養技術生產酶。

木瓜細胞培養生產木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶人黑色素瘤細胞培養生產血纖維蛋白溶酶原激活劑動植物細胞培養的特殊性：

1、細胞比微生物細胞大得多，體積大幾千倍，2、對剪切力敏感，動物細胞沒有細胞壁更甚3、生長速率比微生物低，生長倍增時間和發酵周期均更長，4、對營養的要求較微生物復雜，動物細胞往往需要添加血清和其他營養成分3、酶的發酵生產經過預先設計，通過人工操作控制，利用細胞的生命活動，產生人們所需要的酶的過程，稱為酶的發酵生產。

第一節酶的生產菌種一、生產菌種1.細菌芽孢桿菌（蠟狀、枯草、地衣）、大腸桿菌2.霉菌黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌啤酒酵母、假絲酵母4.放線菌鏈霉菌二、產酶菌種的要求（1）不是致病菌及產生有毒物質或其他生理活生物質的微生物，確保酶生產和應用的安全。（2）能在便宜的底物上生長良好，繁殖快，產酶量高，有利于縮短生周期（3）產酶性能穩定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。（4）目標酶的產量要高，性能符合應用需要，產生的酶容易分離純化，最好為胞外酶。（5）除蛋白酶生產菌種外，其他產酶菌種的產蛋白酶活力應該很低，防止目標酶的水解。三.產酶微微生物的分分離和篩選選1)樣品的的采集:從從富含該酶作用底底物的場所采集集樣品2)富集培培養:投投其所好，，取其所抗抗3)分離獲獲得微生物物的純培養養（pureculture）。4)初篩：：選出產酶酶菌種，以以多為主。。5)復篩：：選出產酶酶水平相對對較高的菌菌株，以質質為主。-淀粉酶的的篩選蛋白酶產生生菌的獲得得方法應用含酪蛋蛋白的培養養基第二節酶酶的發酵酵技術一、培養基基C/N:產酶促進劑劑:誘導物表面活性劑劑二、發酵條條件對產酶酶的影響溫度、pH值、通風風量三、發酵方方法1、固體培培養發酵：：培養基以麩麩皮、米糠糠等為主要要原料加入入其它營養養成分，經經滅菌、接接產酶菌株株，在一定定條件下發發酵，目的的獲得淀粉粉酶和蛋白白酶，如酒酒曲生產。。2、液體深深層發酵液體培養基基，在發酵酵容器中，，經滅菌、、冷卻接入入產酶細胞胞，在一定定條件下發發酵，是目目前酶生產產的主要方方法。3、固定化化細胞發酵酵第三節提提高酶產產量的方法法一、、酶酶合合成成的的調調節節機機制制1.操操縱縱子子調節節基基因因：：阻遏遏蛋蛋白白輔阻阻遏遏物物2、、誘誘導導和和阻阻遏遏誘導導：：誘導導物物的的加加入入后后，，酶酶才才大大量量合合成成，，參與與分分解解代代謝謝的的酶酶：：淀淀粉粉酶酶、、纖纖維維素素酶酶阻遏遏：：末端端代代謝謝物物阻阻遏遏：：反饋饋阻阻遏遏，，合合成成代代謝謝中中的的關關鍵鍵酶酶分解解代代謝謝物物阻阻遏遏：：1.酶酶合合成成的的誘誘導導加進進某某種種物物質質，，使使酶酶生生物物合合成成開開始始或或加加速速進進行行。。酶合合成成誘誘導導的的現現象象：：已知知分分解解利利用用乳乳糖糖的的酶酶有有：：-半乳乳糖糖苷苷酶酶；；-半乳乳糖糖苷苷透透過過酶酶；；硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷轉轉乙乙酰酰酶酶。實驗驗：：（1））大大腸腸桿桿菌菌生生長長在在葡葡萄萄糖糖培培養養基基上上時時，，細細胞胞內內無無上上述述三三種種酶酶合合成成；；（2））大大腸腸桿桿菌菌生生長長在在乳乳糖糖培培養養基基上上時時，，細細胞胞內內有有上上述述三三種種酶酶合合成成；；（3））表表明明菌菌體體生生物物合合成成的的經經濟濟原原則則：：需要要時時才才合合成成。調節節基基因因操縱縱基基因因乳糖糖結結構構基基因因PLacZLacYLacamRNA阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））基因關閉啟動動子子ORPLacZLacYLaca調節基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、、乳乳糖糖操操縱縱子子的的結結構構B、、乳乳糖糖酶酶的的誘誘導導乳糖阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））誘導導2.末末端端產產物物阻阻遏遏由某某代代謝謝途途徑徑末末端端產產物物的的過過量量累累積積引引起起的的阻阻遏遏。酶合合成成阻阻遏遏的的現現象象：：實驗：（1）大腸桿菌菌生長在無機機鹽和葡萄糖糖的培養基上上時，檢測測到細胞內有有色氨酸合成成酶的存在；；

（2））在上述培養養基中加入色色氨酸，檢測測發現細胞內內色氨酸合成成酶的活性降降低，直至消消失。（（3）表明色色氨酸的存在在阻止了色氨氨酸合成酶的的合成，體現現了菌體生長長的經濟原則則:不需要就不合合成。色氨酸操縱子子——酶的阻阻遏調節基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能能與操縱基因因結合，結構構基因表達調節基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產物與阻阻遏蛋白結合合，使之構象象發生變化,與操縱基因因結合，結構構基因不能表表達酶的誘導和阻阻遏操縱子模模型B.有活性阻阻遏蛋白加誘誘導劑A.有活性阻阻遏蛋白C.無活性阻阻遏蛋白D.無活性阻阻遏蛋白加輔輔阻遏劑操縱基因啟動基因調節基因結構基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合,結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產物3.分解代謝謝物阻遏指細胞內同時時有兩種分解解底物（碳源源或氮源）存存在時，利用用快的那種分分解底物會阻阻遏利用慢的的底物的有關關酶合成的現現象。分解代謝物的的阻遏作用，，并非由于快快速利用的甲甲碳源本身直直接作用的結結果，而是通通過甲碳源（（或氮源等））在其分解過過程中所產生生的中間代謝謝物所引起的的阻遏作用。。分解代謝物阻阻遏現象：實驗：細菌在含有葡葡萄糖和乳糖糖的培養基上上生長，優先先利用葡萄糖糖。待葡萄糖糖耗盡后才開開始利用乳糖糖，產生了兩兩個對數生長長期中間隔開開一個生長延延滯期的“二二次生長現象象”(diauxie或或biphasicgrowth）。這一現象又稱稱葡萄糖效應應，產生的原原因是由于葡葡萄糖降解物物阻遏了分解解乳糖酶系的的合成。此調節基因的的產物是環腺腺苷酸受體蛋蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部部位RNA聚合酶酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產物腺苷酸環化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解解物基因活化化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態三、提高酶產產量的策略（一）菌種選選育（一勞永永逸）1.誘變育種種(1)使誘導型變為為組成型———選育組成型型突變株(2)使阻遏遏型變為去阻阻遏型選育營養缺陷陷型突變株解除反饋阻遏遏選育結構類似似物抗性突變變株解除分解代謝謝物阻遏———選育抗分解解代謝阻遏突突變株2.基因工程育種種二、提高酶產量量的策略（一）菌種選選育（一勞永永逸）1.誘變育種種(1)使誘導型變為為組成型———選育組成型型突變株(2)使阻遏遏型變為去阻阻遏型選育營養缺陷陷型突變株解除反饋阻遏遏選育結構類似似物抗性突變變株解除分解代謝謝物阻遏———選育抗分解解代謝阻遏突突變株2.基因工程育種種（二）.通過條件控控制提高酶產產量（1）添加誘誘導物選擇適宜的誘誘導物及濃度度:誘導物：酶酶的作用底物物酶作用底物的的前體酶的反應產物物酶的底物類似似物或底物修修飾物等IPTG/乳乳糖纖纖維素素/纖維二糖糖誘導纖維素素酶（2）降低阻阻遏物濃度避免使用過于于豐富的培養養基和易被利利用的碳源，，并設法阻止止效應物的形形成和濃度的的增加。流加和連續培培養（3）.其他促進分泌：添添加表面活性性劑離子型對對細胞有有毒害作用表面活性劑Tween－－80非離子型TritonX－100非離子型增加加細胞通性，添加產酶促進進劑植酸鈣鎂，聚聚乙烯醇等第四節酶酶發酵動動力學細胞生長速度度產物生成速度度基質消耗速度度環境因素的影影響細胞生長動力力學發酵產酶動力力學發酵動力學研研究內容：一、酶生物合合成的模式微生物細胞的的生長歷程按細胞生長和和酶產生的關關系，酶生物物合成具有下下列四種模式式：1、同步合成成型2、延續合成成型3、中期合成成型4、滯后合成成型1.生長偶偶聯型（又稱稱同步合成型型）酶的生物合成成與細胞生長長同步。特點：酶的合成可以以誘導，但不不受分解代謝謝物阻遏和反反應產物阻遏遏。當去除誘導物物、細胞進入入平衡期后，，酶的合成立立即停止，表表明這類酶所所對應的mRNA很不穩穩定。2.生長偶聯型中中的特殊形式式——中期合合成型酶的合成在細細胞生長一段段時間后才開開始，而在細細胞生長進入入平衡期以后后，酶的合成成也隨著停止止。特點：酶的合成受產產物的反饋阻阻遏或分解代代謝物阻遏。。所對應的mRNA是不穩穩定的。枯草桿菌堿性性磷酸酶合成成曲線3.部分生長偶偶聯型（又稱稱延續合成型型）酶的合成在細細胞的生長階階段開始，在在細胞生長進進入平衡期后后，酶還可以以延續合成較較長一段時間間。特點：可受誘導，一一般不受分解解代謝物和產產物阻遏。所對應的mRNA相當穩穩定。黑曲霉聚半乳乳糖醛酸酶合合成曲線4.非生長偶偶聯型（又稱稱滯后合成型型）只有當細胞生生長進入平衡衡期以后，酶酶才開始合成成并大量積累累。許多水解解酶的生物合合成都屬于這這一類型。特點：受分解代謝謝物的阻遏作作用。所對應的mRNA穩定性性高。黑曲霉酸性蛋蛋白酶合成曲曲線總結：影響酶生物合合成模式的主主要因素1）mRNA的穩定性2）培養基中中阻遏物的存存在mRNA的穩穩定性，培養養基中誘導物物，反饋阻遏遏物，分解代代謝物的存在在是影響酶生生物合成模型型的主要因素素。mRNA穩定定性代代謝調調節產產物生成成模型同步合成型(-)誘誘導dP/dt=α·dX/dt延續合成型(+)誘誘導dP/dt=α·dX/dt＋ββ·X中期合成型(-)反反饋阻阻遏dP/dt=α·dX/dt（解除阻遏后后）滯后合成型(+)分分解代謝謝物阻遏dP/dt=β·X酶生產中最理理想的合成模模式：延續合成型（（部分偶聯））：發酵過程中沒沒有生長期和和產酶期的明明顯差別。細細胞開始生長長就有酶的產產生，直至細細胞生長進入入平衡期后，，酶還可以繼繼續生成一段段時間。對于：同步合成型：：提高對應的mRNA的穩穩定性，如降降低發酵溫度。滯后合成型：：盡量減少甚至至解除分解代代謝物阻遏，，使酶的合成提早早開始。中期合成型：：要在提高mRNA穩定性性以及解除阻阻遏兩方面努力。目的：提高產產酶率和縮短短發酵周期最理想的合成成模式：延續續合成型策略措施：①菌種選育：：提高mRNA的穩定性性，解除分解解代謝物阻遏遏和反饋阻遏遏。②發酵代謝調調節：理想誘誘導物的添加加，解除反饋饋阻遏和分解解代謝物阻遏遏（難利用的的碳氮源的使使用，補料發發酵）。③降低產酶溫溫度。二、細胞生長長動力學微生物細胞生生長的動力學學方程：Monod方方程：S－限制性基基質濃度；μm—最大比生長長速率；Ks—Monod常數倒數形式：三、產酶動力力學產酶動力學方方程：X——細胞濃濃度，以每升升發酵液所含含的干細胞重重量表示（gDC/L））固定化微生物物細胞發酵產產酶一、固定化細細胞發酵產酶酶的特點1、提高產酶酶率2、可以反復復使用或連續續使用較長時時間3、基因工程程菌的質粒穩穩定，不易丟丟失4、發酵穩定定性好5、縮短發酵酵周期，提高高設備利用率率6、產品容易易分離純化7、適用于胞胞外酶等胞外外產物的生產產第三章酶酶的生產和制制備第五節酶酶的分離純化化（酶的制備備）酶的提取和分分離純化：將酶從細胞或或培養基中抽抽提出來，獲獲得與使用目目的相適應的的有一定純度度和濃度的酶酶產品的過程程。兩個基本環節節：分離和純純化分離：將酶從從原料中抽提提出來，并盡盡可能少引入入雜質，得到到粗酶液純化：將酶和和雜質中分離離開來，或者者有選擇地將將酶從包含雜雜質中分離出出來，得到一一定純度的酶酶。酶的純化過程程與一般蛋白白質純化過程程相比的特點點：1、特定的一一種酶在細胞胞中的含量較較少，2、酶可以通通過測定活力力的方法加以以跟蹤。前者給純化帶帶來了困難，，而后者卻迅迅速找出純化化過程的關鍵鍵所在。理想的提取和和分離純化方方法：在提高酶的的比活的同時時，要求酶回回收率高，提提取步驟少、、工藝簡單，，成本低一、原原則1.防防止酶酶失活活這一原原則要要貫穿穿純化化工作作的始始終，，在后后期尤尤為重重要。。建建立一一個可可靠和和快速速、易易行的的測定定酶活活方法法物理因因素、、化學學因素素和生生物因因素導導致酶酶失活活2.分分離純純化的的環節節的選選擇（（經濟濟、宜宜行））：純化倍倍數、、酶活活回收收率和和重現現性（（衡量量優劣劣）經濟、、可靠靠，建建立靈靈敏、、快速速、特特異、、精確確的檢檢測（（酶活活和蛋蛋白質質的含含量））手段段。3、分分離步步驟、、方法法和成成本間間的關關系提取、、分離離、純純化、、制劑劑策略：：①酶產產品的的質量量要求求設定目目標：：（用用途：：醫用用、食食品級級、工工業級級或研研究級級）目標酶酶蛋白白與主主要雜雜質的的性質質②提取取過程程的設設計應應盡可可能防防止酶酶的損損失，，減少少處理理步驟驟。③提取取方法法的經經濟性性和可可分析析性盡量減減少添添加劑劑的使使用盡早使使用高高效分分離方方法，，將昂昂貴、、費時時的分分離方方法放放在最最后階階段。。酶活力力、蛋蛋白濃濃度、、純度度測定定方法法可行行性④劑型型（液液體濃濃縮酶酶、粉粉狀酶酶、精精制酶酶、結結晶酶酶等））二、酶活力力（一））酶酶活力力酶活力力activity：酶催化化一定定化學學反應應的能能力。。用酶酶催化化的反反應速速度來來表示示酶活活力，，即用用單位位時間間內，，單位位體積積中底底物的的減少少量或或產物物增加加量來來表示示。轉換頻頻率：：單位時時間轉轉化的的底物物分子子數。。Kcat,單位位1/s（二））酶活活力單單位及及比活活力酶活力力單位位U（activeunit）：是是根據據某種種酶在在最適適條件件下，，單位位時間間內被被酶作作用的的底物物的減減少量量或產產物的的生成成量來來規定定的，，表示示酶活活力高高低。。IU：：umol/minKat：mol/s1Kat=6×107IU酶的比比活力力指每mg酶蛋白白（或或每mg蛋白氨氨）所所含的的酶活活力單單位數數即：：比活活力=活力單單位數數/酶蛋白白（氮氮）mg表示酶酶制劑劑的純純度，，比活活力愈愈高，，酶愈愈純。。一、基基本過過程（一））、材料（（選擇擇）預預處理理及破破碎細細胞1.胞胞內酶酶和胞胞外酶酶2.破破碎細細胞（二））、固液分分離（（離心或或過濾濾）酶的溶溶解性性、穩穩定性性第六節節酶酶分離離純化化的基基本過過程（三））、凈化與與脫色色絮凝劑劑脫脫色色處理理（四））、濃縮（熱量量法、、沉淀淀分離離、膜膜分離離）（五））純化、、結晶晶（干燥燥）二、酶酶分離離純化化方法法三、酶酶分離離純化化中的的一些些數據據（p93）1.總總蛋白白2.總總活力力3.比比活力力4.酶酶濃度度5.純純化倍倍數（（提純純倍數數）6.產產率（（回收收率））第六節節酶酶制制劑一、定定義及及分類類1定義義：從從生物物中提提取的的具有有生物物催化化能力力的酶酶，輔輔以其其他成成分，，用于于加速速加工工過程程和提提高產產品質質量的的產品品。2.分分類（1））形態態上分分:固固體體液液體體（2））用途途：工工業酶酶制劑劑、飼飼料酶酶制劑劑、食食品酶酶制劑劑、醫醫藥酶酶制劑劑和洗洗滌酶酶制劑劑（3））組成成：單單一酶酶制劑劑和復復合酶酶制劑劑（4））含量量：普普通酶酶制劑劑和濃濃縮酶酶制劑劑（5））來源源：（6））生產產加工工方法法：游游離酶酶制劑劑、固固定化化酶制制劑、、酶試試紙、、