蛋白質組學（Proteomics）中山一院檢驗醫學部陳培松Whichistheoriginoflife？一、背景二、基本概念（掌握）三、特點四、內容和技術五、應用——omics？一、產生背景1.20世紀中后期，生命科學研究進入了分子生物學時代。2.隨著人類基因組全序列測定，但基因本身不足以解讀復雜的生命現象。生命科學跨入了后基因組時代。Genome基因組研究是靜態研究，序列信息并不能告訴人們哪些基因在何時何地以何種程度表達，而生命的精確機制很大程度上正是基于這類基因的精確調控。TranscriptomemRNA豐度與蛋白質豐度的相關性差。mRNA自身存在貯存、轉運、降解、翻譯調控及產物的翻譯后加工，難以準確地反映基因的最終產物基因功能的真正執行體——蛋白質的質與量。蛋白質存在復雜的翻譯后修飾（磷酸化、糖基化、乙酰化）。蛋白質的亞細胞定位或遷移、蛋白質－蛋白質相互作用等也無法從mRNA水平來判斷ProteomeDNAmRNAProtein蛋白質組（proteome）是指特定細胞、組織、乃至機體作為一個生命單元中所有蛋白的合集，即生命體中攜帶的基因信息在某一時間段所表達的所有蛋白質。蛋白質組學（proteomics）是對在特定時間和環境下所表達的群體蛋白質研究的一門學問二.概念

蛋白質組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出。同基因組學一樣,蛋白質組學不是一個封閉的、概念化的、穩定的知識體系,而是一個領域。它旨在闡明生物體全部蛋白質的表達模式及功能模式,其內容包括蛋白質的定性鑒定、定量檢測、細胞內定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質功能,是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁。三.蛋白質組學研究的特點（1）整體性生命活動依賴于各種蛋白的協調合作（2）揭示生命的動態性過程同一細胞，在不同時期、不同條件下，蛋白質組也是在不斷改變的。在病理或治療過程中，細胞蛋白質的組成及其變化與正常生理過程的也不同。（3）體現生命現象的復雜性基因表達的精密多層次調控Glucocorticoidreceptor（GR）,

CodingGene：NR3C1四.蛋白質組學的研究內容及技術表達蛋白組學（2-D電泳）結構蛋白組學（晶體結構分析）功能蛋白組學（EMSA,COIP等）五、蛋白質組研究的相關技術（一）蛋白質的分離

1.二維凝膠電泳（twodimensionalelectrophoresis，2-DE）。

2.操作（1）等電聚焦凝膠電泳（2）SDS電泳（3）圖像分析

（二）2-D膠上蛋白質鑒定和測序（1）早期Westernblot鑒定（2）質譜技術MS是樣品分子離子化后，根據不同離子間的質量、電荷比值差異來確定相對分子質量的技術。電噴霧離子化（eletrosprayionozation，ESI）和基質輔助的激光解吸離子化（MALDI）。（3）Edman降解法鑒定（4）蛋白質組信息學WesternBlottingImmunalBlotting印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。→Northern印跡法→Western印跡法免疫標記技術ElisaWesternBlottingImmunohistochemistryInsituhybridization蛋白質轉印十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）固相免疫測定SDS在緩沖液中添加SDS的電泳系統稱為SDS(十二烷基硫酸鈉）膠片電泳SDS是一種離子性的界面活性劑,帶強的負價，可以使蛋白本身帶的電荷忽略不計決定不同蛋白質的泳動速率就只剩下分子大小一項因素轉印/印記蛋白質印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜（NC）或者PVDF膜上三明治封閉印跡首先用蛋白溶液（如10％的BSA/脫脂奶粉）→一抗特異性的結合抗原（一抗孵育）二抗孵育適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。顯色/發光印跡用酶連二抗處理后，再用適當的底物溶液處理，當酶催化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區帶，指示所要研究的蛋白質的位置。比較蛋白的差異性表達（三）蛋白質分子結構分析1.實際測定具體蛋白質的三維結構：X-射線單晶衍射分析（晶體結構分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構術（電子晶體學）。

X-射線單晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。局限性：晶體2.通過氨基酸序列知識去辨識和推引出其決定的三維結構（1）用分子力學、分子動力學的方法，根據理化的基本原理，從理論上計算蛋白質分子的空間結構。（2）通過對已知空間結構的蛋白質進行分析，找出一級結構與空間結構的關系，總結出規律，用于新蛋白質空間結構的預測。

1.研究蛋白質組的高通量方法。分別收集細胞不同區域內蛋白質，然后進行2-D電泳和蛋白質鑒定。2.將胞內特定蛋白質進行熒光標記，然后在熒光顯微鏡下進行觀察蛋白質移位。（四）研究蛋白質胞內分布及移位的方法（1）凝膠滯后實驗（gelretardation）（2）DNAaseI足紋分析（DNAaseIfootprinting）（3）核酸—蛋白質雜交實驗（五）蛋白質—核酸相互作用的研究凝膠滯后實驗（gelretardation）凝膠滯后實驗（gelretardation）DNAaseI足紋分析（DNAaseIfootprinting）核酸—蛋白質雜交實驗（southwesternblot）（六）蛋白質之間的相互作用蛋白質相互作用的基本形式（1）分子和亞基的聚合（2）蛋白分子雜交（3）分子識別（4）分子自我裝備（5）多酶聚合體蛋白質相互作用的檢測方法生化方法

●共純化、共沉淀，在不同基質上進行色譜層析●蛋白質親和色譜

基本原理是將一種蛋白質固定于某種基質上（如Sepharose），當細胞抽提液經過改基質時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來2.免疫的方法免疫共沉淀（COIP）3.酵母雙雜交系統優點：（1）蛋白質不必純化（2）在活體內進行，能真實模擬在體的情況（3）可以檢測短暫或者微弱的相互作用（4）可以用于分析不同功能的蛋白缺點：（1）定位于核內（2）假陽性（3）需要進一步確證蛋白質組學研究的應用1.用于尋找疾病相關的蛋白質：標志物。2.用于微生物蛋白組研究，徹底闡明病原微生物的致病機理并尋找全新的藥物作用靶點。3.蛋白質組數據庫將成為藥物設計的路標。4.對不同生物的蛋白質組進行比較性研究，可以對生物進化途徑提供參考，對多細胞生物的起源提供線索。5.追蹤胞內信號分子的移位，闡明目標蛋白質在信號轉導途徑中的位置。Screenthedifferentiallyexpressedproteins2-DElectrophoresisScreenthedifferentially

expressedproteinspotsproteinextractCollectspecimenscancerNCMBiomarkerfordiagnosistreatmentandprognosisMS(ESI-MS-MS)identificationUnknownknown