第十章

微生物與基因工程微生物與基因工程基因工程概述;基因的分離、合成和定位誘變；重組DNA分子的構建；重組子的擴增及篩選外源基因在細菌中的表達；基因工程的應用1.基因工程概述基因工程（geneticengineering)：把分離到的或合成的基因經過改造,插入載體中;重組子導入宿主細胞內，使其擴增和表達;最終得到大量基因產物，或令生物表現出新的形狀。1.2基因工程大事記1973Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉化大腸桿菌，實現了DNA的分子克隆;1978Genentech公司---人胰島素---世界上第一種基因工程蛋白藥物1982第一個基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準使用1985第一批轉基因家畜（兔、豬和羊），中國轉基因魚1993基因工程西紅柿在美國上市1997英國羅斯林研究所-克隆羊多莉1999.9中國獲準加入人類基因組計劃,負責測定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息1.3、基因工程基本過程1、目的基因的提取分離或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構建重組DNA分子3、重組DNA分子導入細胞；4、目的克隆的篩選與鑒定；5、控制外源基因的表達；控制適當條件，外源DNA表達，獲得表達產物或轉基因動物、轉基因植物。微生物與基因工程的關系基因資源：基因工程載體基因工程工具酶；基因工程宿主基因工程的生物反應器；基因工程理論研究2目的基因的獲得從基因文庫或cDNA文庫中分離目的基因基因的化學合成PCR擴增基因基因的定位誘變2.1從基因文庫或cDNA文庫中分離目的基因一個理想的基因文庫應包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。基因文庫指生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基因組中某一特定的DNA片段。cDNA文庫細胞中的mRNA分子數要比基因組的基因數小得多（大約15%），因而，mRNA逆轉錄為cDNA所構建的cDNA文庫的庫容量相應比基因文庫小。cDNA文庫指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫中的每一個克隆只含一種mRNA信息。具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementaryDNA之縮寫,或此DNA鏈與具有與之互補的堿基序列的DNA鏈所形成的DNA雙鏈。cDNA從基因文庫或cDNA文庫中分離目的基因根據目的基因序列，可利用標記的基因探針、限制性內切酶、聚合酶鏈式反應（PCR）等方法從文庫中篩選出目的基因。如果篩選的是表達文庫，可以通過檢測基因產物來篩選。2.2

基因的化學合成目前化學合成寡核苷酸片段的長度約為

150~200個核苷酸左右。方法基因的化學合成是先合成許多寡核苷酸，彼此交錯互補，然后再將它們連接起來。2.3PCR擴增基因

聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR一種體外擴增特定DNA片段的技術，在該反應中，使用與目的DNA兩端序列互補的寡核苷酸作為引物，進行多輪的DNA合成，每輪反應包括DNA變性，引物退火和在DNA聚合酶催化下的DNA合成。1984年，美國Cetus公司遺傳部Mullis發明；1993年,獲得諾貝爾化學獎。

DNA片段兩端的序列已知，先合成一對寡聚核苷酸引物，它們各自與所需擴增的DNA片段的末端互補。

PCR由3個基本反應組成：PCR擴增技術原理

DNA片段以2的指數增長，重復25~30次循環，擴增的DNA片段拷貝數可增至106-107

倍。

①變性:在高溫下,模板DNA變性,雙鏈被解開成為兩條單鏈;②退火:反應系統降溫，引物與模板DNA兩端的堿基配對；DNA聚合酶使引物3‘端向前延伸，合成與模板互補的DNA新鏈。③延伸:條件：結果：

2.4基因的定位誘變可在基因精確限定的位點引入突變，包括刪除、插入和置換特定的堿基序列，從而得到含突變堿基的突變基因。

體外定位誘變3重組DNA分子的構建克隆載體基因工程工具酶外源基因與載體的體外連接3.1克隆載體指負責將外源基因運送到宿主細胞中并進行復制與擴增的運載工具。常用載體類型：克隆載體：在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件(如啟動子、RBS、終止子等),使目的基因能夠表達的載體。指能在兩種不同的生物中復制的載體.表達載體穿梭載體目前克隆載體種類細菌質粒載體λ噬菌體載體與黏粒載體柯斯質粒載體M13噬菌體載體與噬菌質粒載體真核生物克隆載體及人工染色體。pBR322質粒載體的結構特征環狀雙鏈DNA分子，由4361bp組成;colEⅠ復制起點，外源DNA大小為5kb左右;四環素抗性基因（Tetr）、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）;24單一酶切位點（Tetr中7個，Ampr中3個）。常用工具酶種類

限制性內切酶把DNA長鏈切割為短的片段

DNA連接酶將兩段DNA片段拼接起來

3.2基因工程工具酶3.2.1限制性內切酶是指能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并在識別位點中或其附近切割DNA的一類內切酶。限制性內切酶:II型限制性內切酶的切割方式形成粘性末端（cohesiveend）;形成平末端（bluntend）;

識別序列通常由4～6個堿基對組成,呈回文結構;限制酶作用所產生的DNA片段的形式：3.2.2DNA連接酶催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對的兩條DNA鏈和末端都是平末端的兩條DNA鏈連接酶的作用可以在體外將目的基因與載體共價連接構成重組DNA分子；連接酶的功能大多數DNA連接酶是從T4噬菌體中分離出來的3.3外源基因與載體的體外連接重組DNA分子的構建：在分別獲得外源基因和合適的載體后，在體外將基因與載體進行連接，構建成為一個能在宿主細胞中自主復制的DNA分子。黏性末端連接法4重組子的擴增與篩選體外包裝（將重組DNA分子與λ噬菌體的頭部、尾部以及有關包裝蛋白混合，組裝成具感染力的λ噬菌體粒子）感染宿主。較轉染效率要高出104－105倍。4.1外源DNA導入原核細胞轉化:外源DNA以重組質粒載體形式存在，則可通過轉化導入原核細胞(感受態)；轉染：外源DNA構建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質粒，則可通過轉染方式進入宿主細胞(感受態)。λDNA的侵染4.2重組體的篩選與鑒定載體選擇標記的鑒定目的基因序列的鑒定外源基因表達產物篩選4.2.1載體選擇標記的鑒定(1)抗生素抗性選擇法

(2)插入失活法

(3)β-半乳糖苷酶顯色反應法初步的、大量的篩選鑒定方法(2)插入失活法因外源DNA的插入而導致基因失活的現象，稱為插入失活（insertionalinactivation）基因產物無基因產物抗性基因1.載體2.重組DNA分子抗性基因失活a)pBR322載體四環素抗性基因氨芐抗性基因b)重組DNA分子目的基因抗性插入失活固體平板含T培養基含A培養基插入失活法篩選目的克隆含T培養基4.2.2目的基因序列的鑒定菌落（或噬菌斑）原位雜交內切酶圖譜鑒定DNA序列測定

初步篩選結果的基礎上，進一步鑒定的方法

DNA序列測定最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對重組體的DNA進行序列測定;4.2.3

基因表達產物的鑒定

免疫活性測定生物活性測定氨基酸序列測定表達產物免疫活性測定如果表達產物是一種蛋白質或蛋白質的一部分具有抗原性，則可與其特異抗體發生免疫反應。進而用westernblot進行鑒定。確認目的蛋白成功表達；生物活性測定表達產物是酶可以測定其酶活性的大小;表達產物是酶的抑制劑，可測定其抑制酶活性能力的大小；既可用于初步篩選，又可用于最終鑒定；表達產物氨基酸序列測定測定表達產物的肽譜；或分析表達產物N-末端和C-末端氨基酸序列，對表達產物的鑒定具有重要意義。可用于表達、純化產物的最終鑒定；前提條件必須得到純度高的蛋白；5外源基因在細菌中的表達

所謂表達載體（expressionvector）是指包含宿主細胞基因表達所需調控序列，能使克隆的基因在宿主細胞內轉錄和翻譯的載體；克隆基因可用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、培養的哺乳類動物細胞、以至整體動物進行表達。宿主細胞的類型5.1外源基因的轉錄啟動子轉錄的調節和控制轉錄終止子5.1.1啟動子（promoter）是指RNA聚合酶結合于DNA并起始合成RNA的一段DNA控制序列。為使目的基因高效表達，必須選擇強啟動子。強啟動子包括lac

啟動子、trp

啟動子、tac

啟動子、P(L,R)啟動子、T7噬菌體啟動子。啟動子5.1.2轉錄的調節和控制第一階段使含有外源基因的宿主細胞迅速生長,獲得足夠量的細胞。第二階段,啟動調節開關，使外源基因高效表達，產生大量有價值的基因表達產物。某些有價值的外源蛋白可能對宿主細胞是有毒的，外源蛋白的過量表達必將影響細胞生長；轉錄的調控的必要性轉錄調控的理想狀態基因工程中常用的轉錄調控方式誘導物誘導：如IPTG－乳糖操縱子的啟動子；溫度誘導：P(L,R)啟動子RNA聚合酶調節：T7噬菌體啟動子。溫度誘導當用λPL、PR啟動子構建表達載體時，其溫度敏感突變株cI857ts在30℃培養時，cI基因產生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R轉錄，細菌大量生長；當溫度上升至42℃時，阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，啟動外源基因的高效轉錄。當溫度敏感突變株表達外源基因時，在30℃細胞大量生長。當溫度升到42℃時，打開轉錄開關，啟動外源基因轉錄。調控方式實例5.1.3轉錄終止子轉錄終止子指一段位于基因或操縱子的３‘末端，具有終止轉錄功能的特定DNA序列。高效表達載體應該含有終止子，因為合成的mRNA過長，不僅消耗細胞內的底物和能量，且易使mRNA形成妨礙翻譯的二級結構。5.2外源基因的翻譯核糖體結合位點：SD序列；密碼子的偏愛性：偏愛密碼子、稀有密碼子；終止密碼子：UAA，UAG，UGA，以UAA終止能力最強。5.3外源基因的表達產物非融合蛋白表達：表達產物直接為外源蛋白；融合蛋白表達：外源蛋白與宿主蛋白形成的雜合蛋白；分泌表達：表達蛋白被分泌到周質或胞外；包涵體：5.3.2融合蛋白表達

是指外源蛋白與宿主蛋白形成的雜合蛋白融合蛋白融合蛋白表達載體將原核細胞操縱子的起始部分與外源基因的編碼部分連接，并使其閱讀框架保持一致，確保所轉譯的外源蛋白的正確性。表達載體PSD裂解啟動子P外源基因宿主基因表達融合蛋白的優點

純化不易易于高效表達融合蛋白的N端總是選擇天然的高表達的宿主蛋白質，其mRNA具有較強的翻譯能力；在細胞內穩定性好外源蛋白特別是相對分子量較小的蛋白，通常在宿主細胞內極易被胞內蛋白酶所清除。但是如果構成融合蛋白，就可使外源蛋白不受宿主細胞降解；需要切除來自宿主的多肽鏈，才能得到目的蛋白。5.3.3外源基因的分泌表達分泌型表達載體除具有一般表達載體的基本結構外，還需要具有編碼信號肽的序列。通常信號肽與外源蛋白的N端連接，由于信號肽中含有帶正電荷的氨基酸和疏水氨基酸，故能攜帶表達蛋白越膜分泌到周質或胞外，然后質膜上的信號肽酶將信號肽切除。如果合成的外源蛋白能不斷從細胞分泌出來，不僅可免受宿主細胞中蛋白酶的降解，而且有利于提高外源蛋白的表達水平和對產物的純化。分泌表達的優點分泌型表達載體SD信號肽啟動子P外源基因終止序列5.3.4包涵體

（inclusionbody）形成包涵體有利于外源蛋白的高水平表達和防止蛋白酶對其的降解，也可避免外源蛋白對宿主細胞的毒害。此外也有利于表達產物的分離。但包涵體形式的表達蛋白不具生物學活性，需要體外復性。包涵體當外源蛋白在大腸桿菌高水平表達時，在細胞質內常常聚集了大量難溶的、非正確折疊的、無生物學活性的外源蛋白，稱為包涵體。表達包涵體的優缺點6基因工程的應用基因工程藥物基因治療轉基因動物轉基因植物在微生物研究中應用6.1基因工程藥物胰島素人生長激素干擾素白細胞介素2粒細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子紅細胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體基因工程藥品——胰島素1979年，科學家將動物體內的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內實現了表達。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產的胰島素投入市場，售價降低了30%～50%。胰島素是治療糖尿病的特效藥。傳統的提取方法一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4～5g胰島素。用該方法生產的胰島素產量低，價格昂貴，遠不能滿足社會需要。基因工程胰島素干擾素是病毒侵入細胞后產生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對治療某些癌癥和白血病也有一定療效。基因工程藥品——干擾素1980～1982年，科學家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內獲得了干擾素，是傳統的生產量的12萬倍。1987年上述干擾素大量投放市場。傳統的干擾素生產方法從人血液中的白細胞內提取，每300L血液只能提取出1mg干擾素。基因工程干擾素6.2基因治療1990年9月14日，美國馬里蘭州的Bethesda醫院里，年僅4歲的女孩阿尚蒂(Asshanthi

DeSilva)接受了人類歷史上第一次基因治療臨床試驗。阿尚蒂忠有一種嚴重的復合型免疫功能缺乏癥（SCID），這是一類致命性遺傳性疾病。該疾病如果不加治療，患者在l－2年必死無疑。致命性遺傳性疾病阿尚蒂是由于先天性缺乏腺苷脫氨酶(ADA)而導致SCID的,由于ADA酶的缺陷，人體細胞內脫氧腺苷大量積累，導致T淋巴細胞的中毒死亡；沒有了T淋巴細胞，人體免疫系統就基本上被破壞了，很容易感染死亡。阿尚蒂只有生活在無菌的隔離病房，依賴沒完設了的PEG—ADA酶的體外注射，通過這種外源ADA酶補充體內的不足．ADA酶進入細胞談何容易？低效的治療，頻繁的輸注、昂貴的價格、潛在的病毒危害、免疫反應讓阿尚蒂的生命看不到明天的希望。病理ADA酶的體外注射療法1990年美國政府終于批準了世界上第一例基因治療臨床試驗－－對阿尚蒂實施ADA基因治療。科學家們從阿尚蒂身上抽血，分離出T淋巴細胞，在體外進行生長和擴增，并通過一種反轉錄病毒將正常的ADA基因轉移進去;在取血培養一個半星期后，這種改造過的能夠正常表達ADA的淋巴細胞通過靜脈緩緩輸回到女孩的血液中。基因手術結束后，阿尚蒂一切體征正常。她先后經過11次的細胞回輸，一共回輸了約1011個基因改造的淋巴細胞。基因治療策略1個月后，就發現她體內的正常T細胞數量上升，T細胞已經能夠生產ADA酶，雖然只有正常值的20%，但是已經能夠拯救T細胞死亡的命運了，能夠使T淋巴細胞保持一定的生長并能維持一定的免疫功能。這神奇的效果達到了甚至遠遠超過