第九章基因工程技術(shù)育種第一節(jié)基因工程概述第二節(jié)魚類的基因工程技術(shù)育種

★1、概念：是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。第一節(jié)基因工程概述也稱為DNA重組技術(shù)(DNARecombination)或分子克隆(Molecularcloning)★2、誕生：

1971年，美國Smith,H.O.

等分離出一種限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；

1972年：Ｂerg,P.

等實現(xiàn)不同酶切DNA片段的體外連接；

1973年：Cohen,s.等將體外重組的DNA

轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞并得以表達(dá)。

★３、基本過程：⑴從供體細(xì)胞中分離出目的基因(“切”)

；⑵用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子(“接”)；⑶借助細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞(“轉(zhuǎn)”)；⑷培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子，使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（“增”）；⑸鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得外源基因高效表達(dá)細(xì)胞（“檢”）；基因工程的操作過程可簡化為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢目的基因的分離與鑒定(一)從基因庫中分離基因(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因(三)人工合成基因

★限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionenzymes)：

在細(xì)菌中此酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。

第Ⅱ類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列—回紋對稱序列。載體一個DNA片段只有與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞(hostcell)，并在其中復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。(vector)★作為載載體DNA分子，需具備備四個個條件件：⑴具復(fù)復(fù)制原原點(ori)，能攜帶帶的外外源DNA片段獨獨立地地自我我復(fù)制制；⑵具有有多克克隆位位點，即具有有多種種限制制性酶酶的切切點，用于克克隆外外源DNA片段；；⑶至少少具有有一個個選擇擇標(biāo)記記基因因；⑷易從從宿主主細(xì)胞胞中回回收。1.細(xì)菌質(zhì)質(zhì)粒◆質(zhì)粒是是細(xì)菌菌細(xì)胞胞內(nèi)獨獨立于于細(xì)菌菌染色色體而而自然然存在在的、能自我我復(fù)制制、易分離離和導(dǎo)入的的環(huán)狀狀雙鏈鏈DNA分子。☆這些質(zhì)質(zhì)粒的的適應(yīng)應(yīng)范圍圍廣，，拷貝貝數(shù)多多。進(jìn)進(jìn)入宿宿主細(xì)細(xì)胞復(fù)復(fù)制后后，每每個細(xì)細(xì)胞的的質(zhì)粒粒拷貝貝數(shù)可可高達(dá)達(dá)1000個。2.λλ噬菌體體3.穿梭載載體DNA連接酶酶能催催化雙雙鏈DNA切口處處的5′-磷酸根根和3′-羥基生生成磷磷酸二二酯鍵鍵。這這種反反應(yīng)需需要供供給能能量，，大腸腸桿菌菌和其其他細(xì)細(xì)菌的的DNA連接酶酶以NAD+作為能能量來來源，，動物物細(xì)胞胞和噬噬菌體體的連連接酶酶則以以ATP作為能能量來來源。。DNA連接酶酶(DNAligase)修復(fù)雙雙鏈DNA缺口處處的磷磷酸二二酯鍵鍵連接多多個平平頭雙雙鏈DNA分子：：目的基基因與與載體體的連連接(DNA分子重重組)重組DNA分子導(dǎo)導(dǎo)入宿宿主細(xì)細(xì)胞●轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)質(zhì)粒DNA或以它它為載載體構(gòu)構(gòu)建的的重組組質(zhì)粒粒導(dǎo)入入細(xì)菌菌中的的過程程。●轉(zhuǎn)染(transfection):指病毒毒及其其重組組子導(dǎo)導(dǎo)入受受體細(xì)細(xì)胞的的過程程.●轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌菌體及及其重重組子子導(dǎo)入入受體體細(xì)胞胞的過過程轉(zhuǎn)化(1)氯化鈣鈣法●1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿桿菌經(jīng)經(jīng)過氯氯化鈣鈣適當(dāng)當(dāng)處理理及短短暫熱熱休克克之后后,便能吸吸收λ噬菌體體DNA。1972年美國國斯坦坦福大大學(xué)S.Cohen報道,經(jīng)氯化化鈣處處理大大腸桿桿菌細(xì)細(xì)胞也也能攝攝取質(zhì)質(zhì)粒DNA。(2)電穿孔孔法電穿孔孔法(electroporation):是指在在一個個較大大的電電脈沖沖短暫暫破壞壞細(xì)胞胞膜的的脂質(zhì)質(zhì)雙層層，從從而允允許DNA等分子子通過過細(xì)胞胞膜進(jìn)進(jìn)入細(xì)細(xì)胞，，而后后細(xì)胞胞膜快快速復(fù)復(fù)原，，保持持細(xì)胞胞的完完整。。這種種方法法稱為為電穿穿孔法法。轉(zhuǎn)化子子的鑒鑒定轉(zhuǎn)化子子的外外源基基因表表達(dá)★4.基因工工程的的應(yīng)用用(一)基因工工程工工業(yè)(二)植物基基因工工程(三)轉(zhuǎn)基因因動物物(四)基因治治療◆胰島素素的人人工生生產(chǎn)◆植物基基因工工程根癌農(nóng)農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)導(dǎo)的植植物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化◆植物基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化：：是指指將外外源基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到植物物細(xì)胞胞內(nèi)、、并整整合到到植物物基因因組中中穩(wěn)定定遺傳傳和表表達(dá)的的過程程。◆根癌農(nóng)農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)導(dǎo)的植植物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化◆轉(zhuǎn)基因因動物物與轉(zhuǎn)基基因植植物相相比，轉(zhuǎn)基因因動物物的發(fā)發(fā)展要要慢些些。◆例如，，利用用轉(zhuǎn)基基因羊羊大量量表達(dá)達(dá)人類類的抗抗胰蛋蛋白酶酶。◆將人的的抗胰胰蛋白白酶α-1基因克克隆在在羊奶奶產(chǎn)生生相關(guān)關(guān)基因因啟動子子的下下游，，這種種啟動動子僅僅在乳乳腺細(xì)細(xì)胞中中表達(dá)達(dá)，使使羊奶奶中含含有大大量有有功能能的人人類抗抗胰蛋蛋白酶酶；◆可利用用家禽禽作為為生物反反應(yīng)器器，生產(chǎn)產(chǎn)人類類大量量需要要的重要蛋蛋白質(zhì)質(zhì)。◆基因治治療◆利用基基因工工程技技術(shù)，，將特特異基基因?qū)?dǎo)入并并整合合到具具有遺遺傳缺缺陷的的患者者的基基因組組中，，以治治療遺遺傳疾疾病的的方法法，通通常叫叫做基基因治治療(genetherapy)。◆目前最最常用用的方方法是是利用用病毒毒DNA作載體體，構(gòu)構(gòu)建重重組DNA分子，，用病病毒包包裝物物包裝裝后形形成的的重組組去毒毒病毒毒感染染患者者的細(xì)細(xì)胞，，將正正常基基因整整合到到染色色體上上。第二節(jié)節(jié)魚魚類類基因因工程程以魚類類為研研究對對象，，應(yīng)用用基因因工程程技術(shù)術(shù)于魚魚類遺遺傳育育種和和海水水魚類類資源源開發(fā)發(fā)研究究的一一門應(yīng)應(yīng)用性性，技技術(shù)強(qiáng)強(qiáng)的分分支學(xué)學(xué)科。。本節(jié)以以海洋魚魚類為研究究對象象進(jìn)行行介紹紹。進(jìn)入上上世紀(jì)紀(jì)90年代，，我國國水產(chǎn)產(chǎn)品總總量已已躍居居世界界首位位，水水產(chǎn)養(yǎng)養(yǎng)殖產(chǎn)產(chǎn)量超超過捕捕撈產(chǎn)產(chǎn)量，，水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的的發(fā)展展由捕捕撈型型轉(zhuǎn)向向增養(yǎng)養(yǎng)型。。其中，，海水水養(yǎng)殖殖的發(fā)發(fā)展尤尤為迅迅速。。相比比貝類類和蝦蝦類養(yǎng)養(yǎng)殖，，海水水魚類類的養(yǎng)養(yǎng)殖發(fā)發(fā)展較較慢。。制約因因素較較大的的是越越冬問問題，，多數(shù)數(shù)海水水養(yǎng)殖殖品種種在4℃以上才才能越越冬，，8℃℃以上才才能攝攝食和和維持持緩慢慢生長長。其其次海海水魚魚的遺遺傳育育種和和全人人工繁繁殖育育苗問問題尚尚未徹徹底解解決，，育苗苗成活活率較較低。。根據(jù)目目前研研究現(xiàn)現(xiàn)狀和和發(fā)展展趨勢勢，海海水魚魚類基基因工工程的的研究內(nèi)內(nèi)容主要為為：分離和和克隆隆海水水魚類類中的的有用用基因因;篩選適適用海海水魚魚類基基因克克隆和和表達(dá)達(dá)的載載體及及表達(dá)達(dá)體系系。利用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因技術(shù)術(shù)，將將外源源基因因?qū)肴牒Ｋ~中中，培培育性性狀優(yōu)優(yōu)良的的轉(zhuǎn)基基因海海水魚魚類品品系。。1.海水魚魚類基基因的的分離離和克克隆基因的的分離離包括括構(gòu)建建基因因文庫庫和從從基因因文庫庫中篩篩選分分離目目的基基因兩兩大步步驟。。幾種重重要的的海水水魚類類基因因生長激激素基基因抗凍蛋蛋白基基因催乳素素基因因和生生長催催乳素素基因因抗凍蛋蛋白基基因大多數(shù)數(shù)海水水魚類類的血血清在在-0.6℃℃即凍結(jié)結(jié)，因因此無無法在在溫度度過低低的海海域中中生存存，但但仍有有一些些海水水魚類類可以以生存存在這這些嚴(yán)嚴(yán)寒海海域中中。早在1957年，Scholander等人首首次觀觀察和和研究究了這這些魚魚類的的抗凍凍特性性。他他們發(fā)發(fā)現(xiàn)在在北極極海水水魚的的血清清中存存在一一種生生物大大分子子，它它們起起著降降低血血清凝凝固點點的作作用。。此此后，，DeVries等人從從南極極魚血血清中中分離離和分分析了了這種種生物物大分分子，，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)它們們是一一類有有特殊殊化學(xué)學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)的糖糖蛋白白，稱稱為抗抗凍糖糖蛋白白（AFGP）。上世紀(jì)紀(jì)80年代，，加拿拿大Choy等人發(fā)發(fā)現(xiàn)了了另一一類抗抗凍蛋蛋白。。他們們從產(chǎn)產(chǎn)自北北大西西洋沿沿岸海海域的的美洲洲大綿綿鳚、、冬鰈鰈和杜杜父魚魚中分分離出出3種類型型的抗抗凍蛋蛋白（（AFP）。當(dāng)當(dāng)AFP增至一一定濃濃度，，可以以完全全抑制制冰晶晶的形形成，，因此此即使使在低低于-1.7℃℃的低溫溫條件件下，，含有有一定定濃度度AFP的血清清也不不會凍凍結(jié)，，這就就是極極地和和北大大西洋洋海域域的海海水魚魚能夠夠在嚴(yán)嚴(yán)寒海海水中中生存存的原原因。。用這幾幾種抗抗凍蛋蛋白基基因構(gòu)構(gòu)建的的各種種表達(dá)達(dá)重組組體已已經(jīng)成成功地地應(yīng)用用于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)抗凍凍蛋白白基因因魚類類的研研究和和基因因工程程菌表表達(dá)生生產(chǎn)抗抗凍蛋蛋白的的應(yīng)用用研究究。2.海水魚魚類的的基因因轉(zhuǎn)移移在海水水魚類類基因因工程程育種種研究究方面面，目目前所所開展展的工工作主主要是是應(yīng)用用轉(zhuǎn)基基因技技術(shù)將將外源源目的的基因因?qū)肴胧荏w體魚類類的生生殖系系細(xì)胞胞內(nèi)，，使之之整合合于受受體細(xì)細(xì)胞的的染色色體中中，通通過改改變受受體魚魚遺傳傳物質(zhì)質(zhì)組成成的方方式達(dá)達(dá)到培培育優(yōu)優(yōu)良性性狀的的新品品種的的目的的。魚類轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因技術(shù)術(shù)研究究始于于淡水水魚。。1985年，我我國學(xué)學(xué)者朱朱作言言等人人首次次報道道了轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因魚試試驗成成功。。他們們將小鼠金金屬硫硫蛋白白啟動動子-人生長長激素素基因因組體體（mMT-hGH）導(dǎo)入金金魚受受精卵卵中，，獲得得了第第一批批轉(zhuǎn)基基因魚魚。海海水魚魚類的的轉(zhuǎn)基基因研研究直直到90年代初初才有有報道道，加加拿大大研究究者成成功地地將海水魚魚的生生長激激素基基因和和抗凍凍蛋白白基因因?qū)肴膈q科科魚類類，培育育出個個體較較對照照魚30倍的““超級級魚””和能能夠表表達(dá)抗抗凍蛋蛋白的的轉(zhuǎn)基基因大大西洋洋鮭。。我國國研究究者者在在世世紀(jì)紀(jì)初初也也將將海海水水魚魚生生長長激激素素成成功導(dǎo)導(dǎo)入入我我國國重重要要的的海海水水經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)魚魚類類真真鯛鯛和和牙鲆鲆，，培培育育出出生生長長速速度度明明顯顯加加快快的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因海海魚魚群群體體。。魚類類作作為為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因研研究究的的實實驗驗動動物物，，比比哺哺乳乳動動物物等等具具有有更更多多的的優(yōu)優(yōu)點點：：魚類類懷懷卵卵量量大大，，一一次次可可產(chǎn)產(chǎn)幾幾萬萬個個至至幾幾十十萬萬個個；；大多多數(shù)數(shù)種種魚魚類類的的卵卵子子卵卵徑徑大大，，卵卵質(zhì)質(zhì)透透明明，，便便于于進(jìn)進(jìn)行行顯顯微微注注射射等等遺遺傳傳操操作作；；魚類類是是體體外外受受精精體體外外發(fā)發(fā)育育，，易易于于進(jìn)進(jìn)行行人人工工受受精精和和控控制制胚胚胎胎發(fā)發(fā)育育的的條條件件。。2.1.顯微微注注射射法法顯微微注注射射法法是是目目前前最最常常用用的的方方法法，，導(dǎo)導(dǎo)入入外外源源基基因因的的成成功功率率也也比比較較高高。。主主要要包包括括兩兩種種方方式式：：(1)卵母母細(xì)細(xì)胞胞的的細(xì)細(xì)胞胞核核注注射射；；(2)受精精卵卵的的細(xì)細(xì)胞胞質(zhì)質(zhì)注注射射。。顯微微注注射射法法的的優(yōu)優(yōu)點點是是外外源源基基因因的的導(dǎo)導(dǎo)入入整合合效效率率較較高高，缺缺點點是是需需要要貴貴重重精精密密儀儀器器，，技術(shù)術(shù)操操作作難難度度較較大大，，并并且且外外源源基基因因的的整整合合位位點點和和整整合合的的拷拷貝貝數(shù)數(shù)都都無無法法控控制制，，易易造造成成宿宿主主動動物物基基因因組組的的插插入入突突變變，，引引起起相相應(yīng)應(yīng)的的性性狀狀改改變變，，重重則則致致死死。并并且且，，顯顯微微操操作作處處理理對對魚魚類類卵卵子子有有機(jī)械械損損傷傷，，受受精精卵卵的的成成活活率率受受到到很很大大影影響響。2.2電脈脈沖沖法法外源源DNA在電電脈脈沖沖作作用用下下進(jìn)進(jìn)入入受受精精卵卵。。謝岳岳峰峰等等(1989)以泥泥鰍鰍脫脫膜膜受受精精卵卵為為材材料料，，電電穿穿孔孔轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移外外源源基基因因，，獲獲得得了了10%的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因泥泥鰍鰍。。Powers(1992)采用用電電穿穿孔孔法法和和顯顯微微注注射射法法，，將將線線性性化化DNA導(dǎo)入入斑斑馬馬魚魚、、斑斑鲴鲴和和鯉鯉受受精精卵卵。。電電穿穿孔孔法法產(chǎn)產(chǎn)生生的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因魚魚數(shù)數(shù)量量比比顯顯微微法法的的多多。。Zhao(1993)證明明電電穿穿孔孔導(dǎo)導(dǎo)入入的的GH基因因不不僅僅能能表表達(dá)達(dá)，，而而且且還還能能遺遺傳傳。。Powers(1992)采用用電電穿穿孔孔法法獲獲得得的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因斑斑馬馬魚魚和和鯉鯉的的子子一一代代約約一一半半攜攜帶帶外外源源基基因因并并能能有有效效表表達(dá)達(dá)。。缺點優(yōu)點操作作比比較較簡簡單單，，是是處處理理大大量量的的受受精精卵卵的的理理想想方方法法。缺點點是是導(dǎo)導(dǎo)入入無無定定向向性性，，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移率率較較低低，，針針對對不不同同種種魚魚需需要要建建立立相相應(yīng)應(yīng)的的電電脈脈沖沖條條件件(脈沖沖電電壓壓、、脈脈沖沖時時間間、、脈脈沖沖次次數(shù)數(shù)、、間間隔隔時時間間、、脈脈沖沖介介質(zhì)質(zhì))等。。2.3精子子載載體體導(dǎo)導(dǎo)入入法法利用用精精子子作作為為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因載載體體，，借借助助受受精精作作用用把把外外源源基基因因?qū)?dǎo)入入受受精精卵卵，，整整合合到到受受精精卵卵的的基基因因組組中中，，是是構(gòu)構(gòu)建建轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因動動物物的的一一種種新新的的嘗嘗試試。。目前魚類類的成功功報道有有6種。Khoo等(1992)將斑馬魚魚精子與與pUSVCAT質(zhì)粒在PBS中22℃保育30~40min，得到23.3%(環(huán)狀質(zhì)粒粒DNA)和37.5%(線狀質(zhì)粒粒DNA)的陽性率率。Sin等(1993)將大鱗大大麻哈魚魚的精子子與外源源基因混混合，經(jīng)經(jīng)電脈沖沖處理后后再受精精，獲得得5％～10%的轉(zhuǎn)基因因陽性率率。于健康等等(1994)將金魚精精子與AFP基因在Niu——Twitty液中4℃保溫30min后，再與與卵子受受精，經(jīng)經(jīng)PCR法和Southernblot分子雜交交法檢查查，陽性性率為26%。該法較簡簡單、方方便，依依靠生理理受精過過程，免免去了對對原核的的損傷。。通過此此法獲得得的精卵卵受精和和受精卵卵成活率率幾乎不不會受到到影響。。但精子子攜帶基基因轉(zhuǎn)移移法仍存存在轉(zhuǎn)基基因陽性性率低、、轉(zhuǎn)移率率不穩(wěn)定定等缺點點。2.4染色體片片段顯微微注入法法這是一種種超大型型外源DNA轉(zhuǎn)移獲得得轉(zhuǎn)移染染色體魚魚的方法法。就是是從染色色體上顯顯微切割割特定的的染色體體片段，，然后注注入受體體動物受受精卵中中。3.外源基因因整合的