免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門(mén)新技術(shù)，也稱(chēng)超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)。目的：將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細(xì)胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，用以闡明細(xì)胞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞

免疫電鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測(cè)某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。

免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)

目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則1、取材與固定取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標(biāo)本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。

（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則1、取材與固定

2．通過(guò)冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。冰凍切片8μm，震動(dòng)切片20～80μm。3．漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記染色。4．DAB顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。5.如果確定待測(cè)抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。

2．通過(guò)冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色，然后再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。優(yōu)點(diǎn)：（1）切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對(duì)抗原性破壞較小。（2）可在定位后再進(jìn)行超薄切片，提高陽(yáng)性檢出率.（3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。優(yōu)點(diǎn)：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免2.免疫染色①直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。②間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標(biāo)記的特異性抗體即第一抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。2.免疫染色①直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)

結(jié)果判定在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。

結(jié)果判定

（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)

利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。

（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)2、膠體金的特性

①顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時(shí)為紅色，95nm是為藍(lán)色，用于免疫細(xì)胞化學(xué)的膠體金呈紅葡萄酒色。

②影響膠體金穩(wěn)定的因素：

a.電解質(zhì)：少量有促進(jìn)穩(wěn)定的作用，過(guò)量則破壞。

b.膠體金的濃度：濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。

c.溫度：長(zhǎng)時(shí)間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。2、膠體金的特性

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系0.01%氯化金1%檸檬酸三鈉膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51001.041.01000.671.5（1）膠體金的制備①檸檬酸三鈉還原法（15nm）②鞣酸-檸檬酸鈉還原法（6nm）

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系100

鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去離子雙蒸水膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方優(yōu)點(diǎn)：①膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。②金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。優(yōu)點(diǎn)：

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對(duì)細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。④膠體金標(biāo)記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。⑤根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對(duì)

（2）電鏡包埋前免疫金染色①新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育組織塊30min。

（2）電鏡包埋前免疫金染色

⑥第一抗體4℃孵育過(guò)夜后室溫繼續(xù)放置2h。⑦TBS漂洗，5min×3次，⑧室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育60min。⑨TBS漂洗，3min×3次，后再用雙蒸水漂洗切片。⑩2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定30～60min，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。

⑥第一抗體4℃孵育過(guò)夜后室溫繼續(xù)放置2h。（3）電鏡包埋后免疫金染色法

①超薄切片50～70nm，置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。②1%H2O2蝕刻，使試劑能穿透標(biāo)本。EPON包埋的組織蝕刻時(shí)間約10min，而LRWhite、LRGold包埋的組織蝕刻時(shí)間則常小于5min.（3）電鏡包埋后免疫金染色法①超薄切片50～70nm，置

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。④1%牛血清孵育切片15min。⑤載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育1～2h或4℃18～24h。⑥TBS漂洗，3min×3次。⑦室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育30～60min。⑧TBS漂洗，3min×3次，后在用雙蒸水漂洗切片。⑨醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。2.電鏡免疫金染色用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。染色方法也有直接法和間接法。2.電鏡免疫金染色

(5)染色結(jié)果判斷假陽(yáng)性染色和假陰性染色可以通過(guò)調(diào)整固定液種類(lèi)、濃度、固定時(shí)間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減少假陽(yáng)性和假陰性染色。

(5)染色結(jié)果判斷雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm圖7-11血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗×9000圖7-11血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗×9000鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

鐵蛋白標(biāo)記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)。鐵蛋白作為電鏡觀察的標(biāo)記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于細(xì)胞膜表面抗原的準(zhǔn)確定位。所以，雖然40年后的今天已發(fā)展了多種免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，但鐵蛋白標(biāo)記法仍然是一種基本技術(shù)。鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鐵蛋白標(biāo)記抗基本原理：

鐵蛋白是一種直徑10～12nm的球形的蛋白質(zhì)（分子量450kD）,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm），該核心含2000～5000個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過(guò)低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體-鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時(shí)因?yàn)殍F蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察。基本原理：

病毒免疫電鏡技術(shù)病毒免疫電鏡技術(shù)5.影響因素：1）樣品的純度：負(fù)染色樣品純度要求不是很高，最好進(jìn)行適當(dāng)純化；樣品雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)⑻穷?lèi)、各種鹽類(lèi)結(jié)晶均會(huì)干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度：被檢查的樣品要有適當(dāng)?shù)臐舛取Ｌ珴馓【绊戨婄R觀察。5.影響因素：1）樣品的純度：

3）樣品與染液的均勻分散度為促進(jìn)樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑

4）懸液與染液的酸堿度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）為宜。

5）染色時(shí)機(jī)的把握吸去過(guò)多樣品懸液后盡快滴加負(fù)染色液

3）樣品與染液的均勻分散度為促進(jìn)樣品與染料的均1、標(biāo)本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷鎢酸染液等量混合用毛細(xì)管滴到有膜的載網(wǎng)上（吸去過(guò)多的病毒－染液混合物），待干后進(jìn)行電鏡觀察。一般認(rèn)為病毒濃度在105以上時(shí)不難發(fā)現(xiàn)病毒。1、標(biāo)本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷鎢酸染液等量混合

2、瓊脂擴(kuò)散技術(shù)：

檢測(cè)的材料中病毒含量不足時(shí)，為了達(dá)到濃縮病毒的目的，并去除材料中所含鹽分，可采用瓊脂擴(kuò)散法。

用0.8%瓊脂鋪好的瓊脂塊，把含病毒的懸液滴到瓊脂塊上，然后把載網(wǎng)倒懸在這滴懸液上。瓊脂塊把水分吸收，濃縮的病毒沾附在載網(wǎng)上，再經(jīng)過(guò)負(fù)染色后進(jìn)行電鏡觀察。

2、瓊脂擴(kuò)散技術(shù)：

檢測(cè)的材料中病毒含量3、假?gòu)?fù)型技術(shù)：瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假?gòu)?fù)型的形式轉(zhuǎn)移到火棉膠膜上或Formvar膜上。此種方法：能去除標(biāo)本中的鹽分、濃縮病毒；減少不必要的雜質(zhì)；比較費(fèi)時(shí)。3、假?gòu)?fù)型技術(shù)：瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假?gòu)?fù)型的方法：1）將20%的瓊脂糖塊放到載玻片上，滴上含病毒的懸液，將它放到紫外燈下照射消毒，直到懸液被瓊脂吸干。2）在瓊脂塊的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用濾紙片吸走。3）用刀片將瓊脂塊的邊緣切除（為便于剝離）輕輕將載有瓊脂塊的載玻片浸入PTA或醋酸鈾溶液中，并把Formvar膜剝離和漂浮到染液水面上。

4）將銅網(wǎng)放到剝離到水面上的Formvar膜上。5）用不銹鋼小柱把銅網(wǎng)膜同F(xiàn)ormvar膜一起打撈出來(lái)，即可進(jìn)行電鏡觀察。方法：1）將20%的瓊脂糖塊放到載玻片上，滴上含病毒的懸液，4免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件

4、病毒顆粒免疫電鏡技術(shù)：病毒顆粒與其外周相伴隨的結(jié)構(gòu)成分雜質(zhì)或人工損傷產(chǎn)物混淆不清。特別是腸道病毒與糞便中成分難以分辨。這種情況需要借助特異性的抗血清（抗體），把病毒顆粒包被、凝聚起來(lái)。病毒顆粒經(jīng)過(guò)特異性的抗體結(jié)合并凝聚成團(tuán)之后，在負(fù)染色下顯示出病毒結(jié)構(gòu)，或包被在病毒顆粒表面的抗體，形成抗體橋，這種電鏡技術(shù)稱(chēng)作免疫電鏡技術(shù)。

4、病毒顆粒免疫電鏡技術(shù)：病毒顆粒與其外周相伴隨的結(jié)構(gòu)成分樣品制備步驟：

取0.9ml病毒懸液加0.1ml1：10稀釋的恢復(fù)期病人血清充分混勻

↓

37℃1小時(shí)后，置4℃冰箱過(guò)夜↓然后用瓊脂擴(kuò)散法或假?gòu)?fù)型法制作電鏡標(biāo)本↓負(fù)染色后，電鏡檢查樣品制備步驟：取0.9ml病毒懸液加0.1ml根據(jù)抗體凝聚的病毒顆粒的多少和程度以（+）表示。如果檢查不到抗體包被的病毒顆粒，可離心，將沉淀重懸浮于1-2滴蒸餾水中，再用同樣方法滴膜、負(fù)染。利用免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定了許多重要的病毒。根據(jù)抗體凝聚的病毒顆粒的多少和程度以（+）表示。4免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件

免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門(mén)新技術(shù)，也稱(chēng)超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)。目的：將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細(xì)胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，用以闡明細(xì)胞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細(xì)胞

免疫電鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度的標(biāo)記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測(cè)某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。

免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)

目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標(biāo)記技術(shù)和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標(biāo)記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價(jià)。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標(biāo)技術(shù)中最常用的標(biāo)記酶是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則1、取材與固定取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標(biāo)本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時(shí)固定隊(duì)抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。

（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本處理原則1、取材與固定

2．通過(guò)冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。冰凍切片8μm，震動(dòng)切片20～80μm。3．漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進(jìn)行標(biāo)記染色。4．DAB顯色后再進(jìn)行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。5.如果確定待測(cè)抗原的抗原性不會(huì)由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色。

2．通過(guò)冰凍切片或震動(dòng)切片獲得厚切片。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免疫染色，然后再進(jìn)行脫水包埋超薄切片。優(yōu)點(diǎn)：（1）切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對(duì)抗原性破壞較小。（2）可在定位后再進(jìn)行超薄切片，提高陽(yáng)性檢出率.（3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上進(jìn)行免疫染色。優(yōu)點(diǎn)：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進(jìn)行免2.免疫染色①直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進(jìn)行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。②間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標(biāo)記的特異性抗體即第一抗體，后者與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)。然后使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。2.免疫染色①直接法：用酶標(biāo)抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)

結(jié)果判定在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。

結(jié)果判定

（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)

利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標(biāo)記。再以金標(biāo)記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。

（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)2、膠體金的特性

①顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時(shí)為紅色，95nm是為藍(lán)色，用于免疫細(xì)胞化學(xué)的膠體金呈紅葡萄酒色。

②影響膠體金穩(wěn)定的因素：

a.電解質(zhì)：少量有促進(jìn)穩(wěn)定的作用，過(guò)量則破壞。

b.膠體金的濃度：濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。

c.溫度：長(zhǎng)時(shí)間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。2、膠體金的特性

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系0.01%氯化金1%檸檬酸三鈉膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51001.041.01000.671.5（1）膠體金的制備①檸檬酸三鈉還原法（15nm）②鞣酸-檸檬酸鈉還原法（6nm）

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系100

鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去離子雙蒸水膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方優(yōu)點(diǎn)：①膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。②金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。優(yōu)點(diǎn)：

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對(duì)細(xì)胞表面的抗原、受體進(jìn)行標(biāo)記定位觀察。④膠體金標(biāo)記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進(jìn)行免疫電鏡的雙重標(biāo)記。⑤根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量研究。

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對(duì)

（2）電鏡包埋前免疫金染色①新鮮組織經(jīng)適當(dāng)固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育組織塊30min。

（2）電鏡包埋前免疫金染色

⑥第一抗體4℃孵育過(guò)夜后室溫繼續(xù)放置2h。⑦TBS漂洗，5min×3次，⑧室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育60min。⑨TBS漂洗，3min×3次，后再用雙蒸水漂洗切片。⑩2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定30～60min，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。

⑥第一抗體4℃孵育過(guò)夜后室溫繼續(xù)放置2h。（3）電鏡包埋后免疫金染色法

①超薄切片50～70nm，置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。②1%H2O2蝕刻，使試劑能穿透標(biāo)本。EPON包埋的組織蝕刻時(shí)間約10min，而LRWhite、LRGold包埋的組織蝕刻時(shí)間則常小于5min.（3）電鏡包埋后免疫金染色法①超薄切片50～70nm，置

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。④1%牛血清孵育切片15min。⑤載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育1～2h或4℃18～24h。⑥TBS漂洗，3min×3次。⑦室溫下適當(dāng)稀釋度的膠體金標(biāo)記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育30～60min。⑧TBS漂洗，3min×3次，后在用雙蒸水漂洗切片。⑨醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。2.電鏡免疫金染色用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。染色方法也有直接法和間接法。2.電鏡免疫金染色

(5)染色結(jié)果判斷假陽(yáng)性染色和假陰性染色可以通過(guò)調(diào)整固定液種類(lèi)、濃度、固定時(shí)間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時(shí)間、溫度等減少假陽(yáng)性和假陰性染色。

(5)染色結(jié)果判斷雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm雙標(biāo)記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm圖7-11血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗×9000圖7-11血小板表面膠體金標(biāo)記GPIb單抗×9000鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

鐵蛋白標(biāo)記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)。鐵蛋白作為電鏡觀察的標(biāo)記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于細(xì)胞膜表面抗原的準(zhǔn)確定位。所以，雖然40年后的今天已發(fā)展了多種免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，但鐵蛋白標(biāo)記法仍然是一種基本技術(shù)。鐵蛋白標(biāo)記電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鐵蛋白標(biāo)記抗基本原理：

鐵蛋白是一種直徑10～12nm的球形的蛋白質(zhì)（分子量450kD）,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm），該核心含2000～5000個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過(guò)低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體-鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時(shí)因?yàn)殍F蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察。基本原理：

病毒免疫電鏡技術(shù)病毒免疫電鏡技術(shù)5.影響因素：1）樣品的純度：負(fù)染色樣品純度要求不是很高，最好進(jìn)行適當(dāng)純化；樣品雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)⑻穷?lèi)、各種鹽類(lèi)結(jié)晶均會(huì)干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度：被檢查的樣品要有適當(dāng)?shù)臐舛取Ｌ珴馓【绊戨婄R觀察。5.影響因素：1）樣品的純度：

3）樣品與染液的均勻分散度為促進(jìn)樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑

4）懸液與染液的酸堿度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）為宜。

5）染色時(shí)機(jī)的把握吸去過(guò)多樣品懸液后盡快滴加負(fù)染色液

3）樣品與染液的均勻分散度為促進(jìn)樣品與染料的均1、標(biāo)本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷