免疫電鏡細胞化學技術免疫電鏡細胞化學技術電鏡細胞化學技術

電鏡細胞化學技術是電鏡技術與細胞化學技術相結合產生的一門新技術，也稱超微結構細胞化學。目的：將化學研究與形態觀察相統一，要求在細胞超微結構水平上研究細胞內各種生化物質（蛋白質、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質在細胞內的動態變化，用以闡明細胞、細胞器結構與功能的相互關系。電鏡細胞化學技術電鏡細胞化學技術是電鏡技術與細胞

免疫電鏡技術

免疫電鏡技術是免疫化學技術與電鏡技術結合的產物，根據抗原抗體的高度特異性結合原理，用高電子密度的標記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結構水平上檢測某些抗原性物質的定位、定性、半定量的一種方法。

免疫電鏡技術免疫電鏡技術是免疫化學技術

目前免疫電鏡技術主要包括酶免疫電鏡技術，免疫鐵蛋白技術和免疫膠體金技術，此外還有抗體雜交技術、凝集素電鏡標記技術和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復合物技術。用以標記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強、穩定、可溶性好、敏感、廉價。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標技術中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP）目前免疫電鏡技術主要包括酶免疫電鏡技術，免疫鐵蛋白電鏡免疫細胞化學技術的標本處理原則1、取材與固定取材原則與常規電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞的超微結構。低濃度的甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超微結構保存又受影響。

（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛電鏡免疫細胞化學技術的標本處理原則1、取材與固定

2．通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。冰凍切片8μm，震動切片20～80μm。3．漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標記染色。4．DAB顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。5.如果確定待測抗原的抗原性不會由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標記染色。

2．通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經包埋的預切厚片上先進行免疫染色，然后再進行脫水包埋超薄切片。優點：（1）切片染色前未經四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對抗原性破壞較小。（2）可在定位后再進行超薄切片，提高陽性檢出率.（3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結構的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上進行免疫染色。優點：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經包埋的預切厚片上先進行免2.免疫染色①直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應結合，爾后進行酶與底物反應，終產物沉淀在抗原抗體反應部位。②間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的特異性抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應。然后使用過氧化物酶標記第二抗體，最后酶與底物反應，生產沉淀。2.免疫染色①直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應

結果判定在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。

結果判定

（二）膠體金免疫電鏡技術

利用膠體金在堿性環境中帶負電荷的性質，使其與抗體相互吸引從而將抗體標記。再以金標記的抗體與待檢抗原相互結合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。

（二）膠體金免疫電鏡技術2、膠體金的特性

①顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關，5-60nm時為紅色，95nm是為藍色，用于免疫細胞化學的膠體金呈紅葡萄酒色。

②影響膠體金穩定的因素：

a.電解質：少量有促進穩定的作用，過量則破壞。

b.膠體金的濃度：濃度越高容易導致膠體金凝集。

c.溫度：長時間加熱可使穩定性有所下降。2、膠體金的特性

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關系0.01%氯化金1%檸檬酸三鈉膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51001.041.01000.671.5（1）膠體金的制備①檸檬酸三鈉還原法（15nm）②鞣酸-檸檬酸鈉還原法（6nm）

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關系100

鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去離子雙蒸水膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方優點：①膠體金能穩定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發生明顯的變化。②金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。優點：

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。④膠體金標記物易于制備，而且可以根據需要制備不同大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標記。⑤根據抗原抗體反應部分結合金顆粒數量的多少，可進行粗略的免疫細胞化學定量研究。

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對

（2）電鏡包埋前免疫金染色①新鮮組織經適當固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育組織塊30min。

（2）電鏡包埋前免疫金染色

⑥第一抗體4℃孵育過夜后室溫繼續放置2h。⑦TBS漂洗，5min×3次，⑧室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育60min。⑨TBS漂洗，3min×3次，后再用雙蒸水漂洗切片。⑩2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定30～60min，常規脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。

⑥第一抗體4℃孵育過夜后室溫繼續放置2h。（3）電鏡包埋后免疫金染色法

①超薄切片50～70nm，置于鎳網或金網中。②1%H2O2蝕刻，使試劑能穿透標本。EPON包埋的組織蝕刻時間約10min，而LRWhite、LRGold包埋的組織蝕刻時間則常小于5min.（3）電鏡包埋后免疫金染色法①超薄切片50～70nm，置

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。④1%牛血清孵育切片15min。⑤載網不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育1～2h或4℃18～24h。⑥TBS漂洗，3min×3次。⑦室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育30～60min。⑧TBS漂洗，3min×3次，后在用雙蒸水漂洗切片。⑨醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。2.電鏡免疫金染色用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據抗原的性質加以選擇。染色方法也有直接法和間接法。2.電鏡免疫金染色

(5)染色結果判斷假陽性染色和假陰性染色可以通過調整固定液種類、濃度、固定時間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時間、溫度等減少假陽性和假陰性染色。

(5)染色結果判斷雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm圖7-11血小板表面膠體金標記GPIb單抗×9000圖7-11血小板表面膠體金標記GPIb單抗×9000鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學技術

鐵蛋白標記抗體是由Singer（1959）首創的一種免疫細胞化學技術。這技術曾廣泛應用于病毒和細胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強的特點，可用于細胞膜表面抗原的準確定位。所以，雖然40年后的今天已發展了多種免疫電鏡細胞化學技術，但鐵蛋白標記法仍然是一種基本技術。鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學技術鐵蛋白標記抗基本原理：

鐵蛋白是一種直徑10～12nm的球形的蛋白質（分子量450kD）,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm），該核心含2000～5000個鐵原子，分布于四個區域，形成四個圓形致密區，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過低分子量的偶聯劑形成抗體-鐵蛋白復合物，此復合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察?；驹恚?/p>

病毒免疫電鏡技術病毒免疫電鏡技術5.影響因素：1）樣品的純度：負染色樣品純度要求不是很高，最好進行適當純化；樣品雜質太多，如大量的細胞碎片、培養基殘渣、糖類、各種鹽類結晶均會干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度：被檢查的樣品要有適當的濃度。太濃太稀均影響電鏡觀察。5.影響因素：1）樣品的純度：

3）樣品與染液的均勻分散度為促進樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑

4）懸液與染液的酸堿度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）為宜。

5）染色時機的把握吸去過多樣品懸液后盡快滴加負染色液

3）樣品與染液的均勻分散度為促進樣品與染料的均1、標本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷鎢酸染液等量混合用毛細管滴到有膜的載網上（吸去過多的病毒－染液混合物），待干后進行電鏡觀察。一般認為病毒濃度在105以上時不難發現病毒。1、標本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷鎢酸染液等量混合

2、瓊脂擴散技術：

檢測的材料中病毒含量不足時，為了達到濃縮病毒的目的，并去除材料中所含鹽分，可采用瓊脂擴散法。

用0.8%瓊脂鋪好的瓊脂塊，把含病毒的懸液滴到瓊脂塊上，然后把載網倒懸在這滴懸液上。瓊脂塊把水分吸收，濃縮的病毒沾附在載網上，再經過負染色后進行電鏡觀察。

2、瓊脂擴散技術：

檢測的材料中病毒含量3、假復型技術：瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假復型的形式轉移到火棉膠膜上或Formvar膜上。此種方法：能去除標本中的鹽分、濃縮病毒；減少不必要的雜質；比較費時。3、假復型技術：瓊脂或瓊脂糖表面上粘附的病毒顆粒，以假復型的方法：1）將20%的瓊脂糖塊放到載玻片上，滴上含病毒的懸液，將它放到紫外燈下照射消毒，直到懸液被瓊脂吸干。2）在瓊脂塊的表面加一滴0.5%Formvar溶液，把多余的Formvar用濾紙片吸走。3）用刀片將瓊脂塊的邊緣切除（為便于剝離）輕輕將載有瓊脂塊的載玻片浸入PTA或醋酸鈾溶液中，并把Formvar膜剝離和漂浮到染液水面上。

4）將銅網放到剝離到水面上的Formvar膜上。5）用不銹鋼小柱把銅網膜同Formvar膜一起打撈出來，即可進行電鏡觀察。方法：1）將20%的瓊脂糖塊放到載玻片上，滴上含病毒的懸液，4免疫電鏡細胞化學技術課件

4、病毒顆粒免疫電鏡技術：病毒顆粒與其外周相伴隨的結構成分雜質或人工損傷產物混淆不清。特別是腸道病毒與糞便中成分難以分辨。這種情況需要借助特異性的抗血清（抗體），把病毒顆粒包被、凝聚起來。病毒顆粒經過特異性的抗體結合并凝聚成團之后，在負染色下顯示出病毒結構，或包被在病毒顆粒表面的抗體，形成抗體橋，這種電鏡技術稱作免疫電鏡技術。

4、病毒顆粒免疫電鏡技術：病毒顆粒與其外周相伴隨的結構成分樣品制備步驟：

取0.9ml病毒懸液加0.1ml1：10稀釋的恢復期病人血清充分混勻

↓

37℃1小時后，置4℃冰箱過夜↓然后用瓊脂擴散法或假復型法制作電鏡標本↓負染色后，電鏡檢查樣品制備步驟：取0.9ml病毒懸液加0.1ml根據抗體凝聚的病毒顆粒的多少和程度以（+）表示。如果檢查不到抗體包被的病毒顆粒，可離心，將沉淀重懸浮于1-2滴蒸餾水中，再用同樣方法滴膜、負染。利用免疫電鏡技術發現和鑒定了許多重要的病毒。根據抗體凝聚的病毒顆粒的多少和程度以（+）表示。4免疫電鏡細胞化學技術課件

免疫電鏡細胞化學技術免疫電鏡細胞化學技術電鏡細胞化學技術

電鏡細胞化學技術是電鏡技術與細胞化學技術相結合產生的一門新技術，也稱超微結構細胞化學。目的：將化學研究與形態觀察相統一，要求在細胞超微結構水平上研究細胞內各種生化物質（蛋白質、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質在細胞內的動態變化，用以闡明細胞、細胞器結構與功能的相互關系。電鏡細胞化學技術電鏡細胞化學技術是電鏡技術與細胞

免疫電鏡技術

免疫電鏡技術是免疫化學技術與電鏡技術結合的產物，根據抗原抗體的高度特異性結合原理，用高電子密度的標記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結構水平上檢測某些抗原性物質的定位、定性、半定量的一種方法。

免疫電鏡技術免疫電鏡技術是免疫化學技術

目前免疫電鏡技術主要包括酶免疫電鏡技術，免疫鐵蛋白技術和免疫膠體金技術，此外還有抗體雜交技術、凝集素電鏡標記技術和鐵蛋白-抗鐵蛋白電鏡復合物技術。用以標記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強、穩定、可溶性好、敏感、廉價。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標技術中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP）目前免疫電鏡技術主要包括酶免疫電鏡技術，免疫鐵蛋白電鏡免疫細胞化學技術的標本處理原則1、取材與固定取材原則與常規電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞的超微結構。低濃度的甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超微結構保存又受影響。

（1）2%多聚甲醛液（2）2%多聚甲醛-0.01%～0.05%戊二醛（3）4%多聚甲醛-0.5%苦味酸-0.5%戊二醛電鏡免疫細胞化學技術的標本處理原則1、取材與固定

2．通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。冰凍切片8μm，震動切片20～80μm。3．漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標記染色。4．DAB顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。5.如果確定待測抗原的抗原性不會由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標記染色。

2．通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經包埋的預切厚片上先進行免疫染色，然后再進行脫水包埋超薄切片。優點：（1）切片染色前未經四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對抗原性破壞較小。（2）可在定位后再進行超薄切片，提高陽性檢出率.（3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結構的保存。包埋后染色：是指在超薄切片上進行免疫染色。優點：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。三、免疫染色

包埋前染色：是指在未經包埋的預切厚片上先進行免2.免疫染色①直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應結合，爾后進行酶與底物反應，終產物沉淀在抗原抗體反應部位。②間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的特異性抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應。然后使用過氧化物酶標記第二抗體，最后酶與底物反應，生產沉淀。2.免疫染色①直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應

結果判定在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。

結果判定

（二）膠體金免疫電鏡技術

利用膠體金在堿性環境中帶負電荷的性質，使其與抗體相互吸引從而將抗體標記。再以金標記的抗體與待檢抗原相互結合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。

（二）膠體金免疫電鏡技術2、膠體金的特性

①顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關，5-60nm時為紅色，95nm是為藍色，用于免疫細胞化學的膠體金呈紅葡萄酒色。

②影響膠體金穩定的因素：

a.電解質：少量有促進穩定的作用，過量則破壞。

b.膠體金的濃度：濃度越高容易導致膠體金凝集。

c.溫度：長時間加熱可使穩定性有所下降。2、膠體金的特性

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關系0.01%氯化金1%檸檬酸三鈉膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（nm）1003.019.01004.015.01006.012.51001.524.51001.041.01000.671.5（1）膠體金的制備①檸檬酸三鈉還原法（15nm）②鞣酸-檸檬酸鈉還原法（6nm）

檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關系100

鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉1%鞣酸0.025mol/LK2CO3去離子雙蒸水膠體金顆粒直徑（ml)（ml）（ml）（ml）（nm）40.02019.981540.1019.901040.50.515.006.043314.003.5鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方優點：①膠體金能穩定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發生明顯的變化。②金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。優點：

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。④膠體金標記物易于制備，而且可以根據需要制備不同大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標記。⑤根據抗原抗體反應部分結合金顆粒數量的多少，可進行粗略的免疫細胞化學定量研究。

③不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對

（2）電鏡包埋前免疫金染色①新鮮組織經適當固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定0.5～1h），制成厚切片。②0.05mol/LTBSpH7.4漂洗3次，每次15min。③0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。④TBS漂洗，5min×3次，⑤1%牛血清孵育組織塊30min。

（2）電鏡包埋前免疫金染色

⑥第一抗體4℃孵育過夜后室溫繼續放置2h。⑦TBS漂洗，5min×3次，⑧室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育60min。⑨TBS漂洗，3min×3次，后再用雙蒸水漂洗切片。⑩2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定30～60min，常規脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。

⑥第一抗體4℃孵育過夜后室溫繼續放置2h。（3）電鏡包埋后免疫金染色法

①超薄切片50～70nm，置于鎳網或金網中。②1%H2O2蝕刻，使試劑能穿透標本。EPON包埋的組織蝕刻時間約10min，而LRWhite、LRGold包埋的組織蝕刻時間則常小于5min.（3）電鏡包埋后免疫金染色法①超薄切片50～70nm，置

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。④1%牛血清孵育切片15min。⑤載網不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育1～2h或4℃18～24h。⑥TBS漂洗，3min×3次。⑦室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探針等）孵育30～60min。⑧TBS漂洗，3min×3次，后在用雙蒸水漂洗切片。⑨醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。

③雙蒸水漂洗3次，每次10min。2.電鏡免疫金染色用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據抗原的性質加以選擇。染色方法也有直接法和間接法。2.電鏡免疫金染色

(5)染色結果判斷假陽性染色和假陰性染色可以通過調整固定液種類、濃度、固定時間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時間、溫度等減少假陽性和假陰性染色。

(5)染色結果判斷雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm,20nm圖7-11血小板表面膠體金標記GPIb單抗×9000圖7-11血小板表面膠體金標記GPIb單抗×9000鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學技術

鐵蛋白標記抗體是由Singer（1959）首創的一種免疫細胞化學技術。這技術曾廣泛應用于病毒和細胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強的特點，可用于細胞膜表面抗原的準確定位。所以，雖然40年后的今天已發展了多種免疫電鏡細胞化學技術，但鐵蛋白標記法仍然是一種基本技術。鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學技術鐵蛋白標記抗基本原理：

鐵蛋白是一種直徑10～12nm的球形的蛋白質（分子量450kD）,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm），該核心含2000～5000個鐵原子，分布于四個區域，形成四個圓形致密區，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過低分子量的偶聯劑形成抗體-鐵蛋白復合物，此復合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察?；驹恚?/p>

病毒免疫電鏡技術病毒免疫電鏡技術5.影響因素：1）樣品的純度：負染色樣品純度要求不是很高，最好進行適當純化；樣品雜質太多，如大量的細胞碎片、培養基殘渣、糖類、各種鹽類結晶均會干擾染色效果及電鏡觀察。2）樣品的濃度：被檢查的樣品要有適當的濃度。太濃太稀均影響電鏡觀察。5.影響因素：1）樣品的純度：

3）樣品與染液的均勻分散度為促進樣品與染料的均勻分散提高染色效果，可以采用某些分散劑

4）懸液與染液的酸堿度一般以中性或略偏酸性（PH6.4－7）為宜。

5）染色時機的把握吸去過多樣品懸液后盡快滴加負染色液

3）樣品與染液的均勻分散度為促進樣品與染料的均1、標本－染液混合染色法：病毒懸液和2％的磷