復制性衰老中全基因組染色質(zhì)開放程度的變化,醫(yī)學遺傳學論文摘要：為研究復制性衰老中表觀遺傳學的變化,以年輕代齡(PD26)和年老代齡(PD55)的人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)為材料,進行ATAC-seq測序,并使用Bowtie2、FastQC、MACS、deepTools、phastCons、R語言、HOMER以及基因本體論(GeneOntology,GO)對測序結(jié)果進行深切進入分析和挖掘。結(jié)果顯示,2BS細胞染色質(zhì)開放區(qū)域的保守性較強,其主要集中于啟動子(promoter)區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點(transcriptionstartsite,TSS),且年輕細胞與年老細胞的啟動子區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點的開放程度不同,細胞隨著衰老在啟動子區(qū)至轉(zhuǎn)錄起始位點的開放程度逐步下降。進一步對年輕和年老細胞之間存在顯著差異的靶基因進行GO分析發(fā)現(xiàn),這些差異基因主要與細胞進程、代謝、生物性調(diào)節(jié)、結(jié)合功能、催化功能相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)衰老經(jīng)過中染色質(zhì)開放區(qū)減少、轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平下降,提示復制性衰老與轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系密切。本文關(guān)鍵詞語：復制性衰老;ATAC-seq測序;轉(zhuǎn)錄調(diào)控;染色質(zhì)開放程度;Abstract：Tostudytheepigeneticchangesinreplicativesenescence,theATAC-seqwasperformedinyoung(PD26)andsenescent(PD55)2BScells.Aftersequencing,theresultswereanalyzedbyBowtie2,FastQC,MACS,deepTools,phastCons,Rlanguage,HOMERandGeneOntology(GO).Theenrichmentsitesofopenchromatinregionswerehighlyconserved.Althoughtheopenregionsweremainlyenrichedbetweenthepro-moterandtranscriptionstartsite(TSS),theenrichmentsintheyoungandtheoldarenotthesame,varyingwithagingof2BScells.Furthermore,GOanalysiswasperformedtoanalyzethedifferentiallyexpressedgenesindifferentagesof2BScells.Thegenesweremainlyclusteredincellularprocess,metabolicprocess,biologicalregulation,bindingandsoon.Theseresultsshowedthattheagingprocesswasaccompaniedbydeclineddegreeofchromatinopennessanddecreasedleveloftranscriptionalregulation,whichrevealedthecloserelationshipbetweenthereplicativesenescenceandtranscriptionalregulation.Keyword：replicativesenescence;ATAC-seq;transcriptionalregulation;openingofchromatin;復制性衰老又稱細胞衰老,當細胞周期停滯、凋亡抵抗以及部分基因如P16INK4a表示出改變時,細胞出現(xiàn)衰老表型[1,2]。復制性衰老是整體衰老的基礎(chǔ),最近研究發(fā)現(xiàn)其具有拮抗癌癥、使癌細胞得以去除的能力[3,4]。近年來,隨著人口老齡化的發(fā)展及癌癥等老年病發(fā)病率的增加,細胞衰老作為老年疾病的主要病理基礎(chǔ),已成為分子生物學研究的熱門之一[5,6,7,8]。在真核生物中,DNA圍繞組蛋白分級折疊,構(gòu)成核小體,而核小體則通過進一步嚴密折疊構(gòu)成高級構(gòu)造染色質(zhì)[9]。此時,根據(jù)細胞所處的狀態(tài),其基因組可劃分為活潑踴躍表示出的基因與相對沉默的基因。在DNA分級折疊的這一經(jīng)過中,非活潑踴躍基因表示出相關(guān)的構(gòu)造區(qū)域相對封閉、核小體構(gòu)造致密,呈轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài);而與活潑踴躍表示出基因相關(guān)的區(qū)域則呈開放狀態(tài),核小體相對松懈,有利于轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等調(diào)節(jié)元件與這些基因的啟動子、加強子互相作用,促進轉(zhuǎn)錄的進行[9,10]。通常情況下,染色質(zhì)的開放程度可代表轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等調(diào)節(jié)元件與DNA的結(jié)合狀態(tài),因而根據(jù)染色質(zhì)的開放程度明確生理學狀態(tài)、疾病發(fā)生發(fā)展中表觀遺傳學狀態(tài)的改變,也已成為表觀遺傳學技術(shù)的主要切入點[9,11,12,13]。迄今為止,細胞衰老經(jīng)過中表觀遺傳學狀態(tài)的改變尚不明確,從染色質(zhì)空間構(gòu)造、基因組學角度對染色質(zhì)開放性的變化進行分析討論的研究較少,在細胞衰老經(jīng)過中染色質(zhì)開放程度的詳細變化仍未知[14,15]。故本研究采用基于轉(zhuǎn)座酶Tn5和高通量測序的染色質(zhì)開放性分析技術(shù)ATAC-seq(assayfortransposase-accessiblechromatinwithhighthroughputsequencing),研究在復制性衰老經(jīng)過中全基因組染色質(zhì)開放程度的變化,為探尋求索復制性衰老經(jīng)過中表觀遺傳以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的變化提供初步的研究基礎(chǔ)。1、材料和方式方法1.1、材料年輕代齡(PD26)和年老代齡(PD55)的人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、青霉素鏈霉素混合液和磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline,PBS)購自美國Gibco公司;Tris、NaCl以及MgCl2購自BBI生命科學有限公司;Tn5轉(zhuǎn)座酶源自美國Illumina公司;NP-40和nuclease-freeH2O購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA純化試劑盒源自美國Qiagen公司;PCR擴增試劑盒源自美國NewEnglandBioLabs公司。二代測序儀(150PE,Illumina公司,美國);qPCR儀(480,Roche公司,瑞士);低溫高速離心機(CR3I,Thermo公司,美國)。1.2、Tn5酶切反響參照文獻[16]的方式方法,對2BS細胞進行Tn5酶切反響,主要步驟如下:取凍存于液氮中的PD26、PD55的2BS細胞進行復蘇。復蘇后的細胞置于T75培養(yǎng)瓶,采用添加10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。當細胞長滿且生長狀態(tài)良好時,用胰酶將細胞消化,并使用臺盼藍染色,過濾除去死細胞后進行細胞計數(shù),計數(shù)50000個細胞。取計數(shù)后的細胞,在4℃條件下500g離心5min后棄上清;再參加50L預冷PBS吹打洗滌,4℃條件下500g離心5min,棄上清;參加50L預冷的裂解液(由10mmol/LTrispH7.5、10mmol/LNaCl、3mmol/LMgCl2以及0.1%NP-40配置而成)懸浮細胞,在4℃條件下500g離心10min后棄上清。此時向細胞沉淀中參加50L轉(zhuǎn)座反響體系(表1),吹打混勻后,37℃孵育30min。待孵育結(jié)束后使用DNA純化試劑盒純化DNA,純化完成后使用10L試劑盒中的洗脫液將其洗脫,隨后進行PCR擴增。PCR反響體系如表2所示,循環(huán)條件見表3。華而不實,PD26對應的primer1序列為AGGCAGAA,PD55對應的primer1序列為TCCTGAGC;barcodedprimer2序列為AATGAT-ACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCA-GCGTCAGATGTG。PCR結(jié)束后,再次使用DNA純化試劑盒純化DNA[17]。表1轉(zhuǎn)座反響體系表2PCR反響體系1.3、ATAC-seq測序、質(zhì)量評估及原始數(shù)據(jù)過濾使用IlluminaHiseq150PE測序儀對Tn5酶切反響得到的DNA進行雙端測序,辨別chasity0.6的堿基,對每個測序序列(sequencedread)進行passfilter檢驗(當某一read的前25個堿基中,僅存在一個或者不存在chasity0.6的堿基時,斷定該read符合檢驗標準),過檢后的單克隆reads則使用FastQC進行測序質(zhì)量評估。斷定評估合格的標準如下:每個堿基的質(zhì)量均5、每組堿基的中位數(shù)均tile的質(zhì)量檢測中不存在暖色結(jié)果;序列質(zhì)量評分均集中于高分;GC堿基含量分布均勻;GC堿基占比均勻;測序中序列長度分布較一致;測序序列中接頭(adapter)出現(xiàn)頻率較低;測序序列中特征性短序列重復出現(xiàn)的次數(shù)較低。假如評估合格,則進行數(shù)據(jù)過濾,去除低質(zhì)量(QPhred20的堿基數(shù)占整個read長度50%以上的reads)、N(N表示無法確定堿基信息)的比例10%和包含adapter的reads,以保證分析質(zhì)量。表3PCR循環(huán)條件1.4、ATAC-seq的序列比對和結(jié)合位點(peak)掃描使用Bowtie2(版本2.25)對參考基因組(hg19)建立索引回帖后,進行序列比對。然后根據(jù)泊松分布,使用MACS(版本2.1.0)對測序后各個區(qū)域基于唯一比對的read數(shù)的P-value值進行計算,當P-value1.0E-05時,該區(qū)域則被以為是一個結(jié)合位點(peak)。標準化后的P-value值越高,理論上該區(qū)域的染色質(zhì)越致密[18]。1.5、保守性分析使用phastCons軟件,根據(jù)phylo-HMM模型對結(jié)合位點的保守性進行計算[19]。1.6、回帖序列在基因附近的信號分布情況分析將所有基因作為目的區(qū)域,使用deepTools對基因長度(轉(zhuǎn)錄起始位點TSS到轉(zhuǎn)錄終止位點TTS之間的距離)進行歸一化處理,繪制ATAC-seqreads(使用bigwig文件)在轉(zhuǎn)錄起始位點上游3kb到轉(zhuǎn)錄終止位點下游3kb范圍內(nèi)的平均信號值,以averageplot的形式將結(jié)果展示。1.7、結(jié)合位點注釋分析使用HOMER軟件的annotatePeaks.pl工具尋找離每個結(jié)合位點距離近期的轉(zhuǎn)錄起始位點所屬的基因(下面稱為結(jié)合位點鄰近基因),以及結(jié)合位點覆蓋的基因,并注釋其覆蓋的功能性區(qū)域。注釋的功能性區(qū)域包括啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域(promoter-TSS,默認范圍為基因起點上游1kb到基因起點下游100bp)、轉(zhuǎn)錄終止位點(TTS,默認范圍為基因終點上游100bp到基因終點下游1kb)、外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)和基因間區(qū)(intergenic)。假如一些功能性區(qū)域有重疊部分,則按上述順序優(yōu)先選擇排在前面的功能性區(qū)域作為最終注釋。對上述注釋分析結(jié)果中結(jié)合位點在所覆蓋基因的功能性區(qū)域上的分布進行統(tǒng)計,并使用R語言的ggplot2包將統(tǒng)計結(jié)果繪制成餅狀圖和柱狀圖。1.8、差異結(jié)合位點分析使用bedtools工具將2BS-PD55與2BS-PD26的peak文件合并,并對合并文件進行處理。假如兩個結(jié)合位點有重疊區(qū)域,則合并成一個新的結(jié)合位點。計算PD26與PD55在每個合并的新結(jié)合位點區(qū)域上的read數(shù)目,然后使用DEGseq進行差異分析,得到樣本間的差異結(jié)合位點,即差異染色質(zhì)開放區(qū)域。本次差異結(jié)合位點的挑選原則為|log2FC|1且P-value0.05。1.9、差異結(jié)合位點注釋分析使用HOMER軟件的annotatePeaks.pl工具尋找離PD26與PD55差異結(jié)合位點距離近期的轉(zhuǎn)錄起始位點所屬的基因,以及差異結(jié)合位點覆蓋的基因,并注釋其覆蓋的功能性區(qū)域。對差異結(jié)合位點注釋分析結(jié)果中結(jié)合位點在所覆蓋基因的功能性區(qū)域上的分布進行統(tǒng)計,并使用R語言ggplot2包將統(tǒng)計結(jié)果繪制成餅狀圖。1.10、GO富集分析基因本體論(GeneOntology,GO)數(shù)據(jù)庫可對基因功能進行富集分析。我們使用GOTermFinder,將PD26與PD55差異結(jié)合位點鄰近的基因與GOterm數(shù)據(jù)庫比對,計算每個term的基因數(shù)量,然后應用超幾何檢驗,找出整個基因組背景下結(jié)合位點相關(guān)基因中顯著性富集的GOterm,進而辨別出差異結(jié)合位點相關(guān)基因行使的主要生物學功能。2、結(jié)果2.1、測序質(zhì)量2.1.1、測序的錯誤分布率對Tn5酶切后的年輕與年老細胞中的DNA進行雙端測序,排除酶切后堿基質(zhì)量因素以及測序儀和測序試劑等的影響后,所得reads的測序錯誤率如此圖1所示,均低于0.06%。本實驗測序的錯誤分布率檢查合格、測序質(zhì)量較高,提示此次測序結(jié)果可用于后續(xù)分析。Fig.1Errorratedistributionalongr2.1.2、堿基含量分布使用FastQC對Tn5酶切后的年輕與年老細胞中的DNA進行堿基組成檢測,結(jié)果如此圖2所示。各嘌呤堿基和嘧啶堿基的組成比例都較平衡,低質(zhì)量堿基(指在某一read的某一位置中,含量小于20%的堿基)比例較低且僅出現(xiàn)于隨機引物擴增的開場階段,表示清楚本次測序結(jié)果較好,可信度較高。2.2、酶切片段長度的分布酶切片段(insertsize,也稱作fragmentlength)是指經(jīng)轉(zhuǎn)座酶Tn5切割后獲得的DNA片段,常用于監(jiān)測Tn5酶切反響中酶的用量能否適宜。本實驗的酶切片段長度分布如此圖3所示,從左至右依次為無核小體片段(nucleosomefree,即開放染色質(zhì)區(qū)域)、單核小體片段(包括一個核小體的酶切片段,長度一般在147bp到147*2bp之間)和雙核小體片段(包括兩個核小體的酶切片段)的長度分布,表示清楚本次實驗酶切效果較好。2.3、結(jié)合位點統(tǒng)計對測序產(chǎn)生的reads的P-value值進行計算,通常標準化后的P-value值越小,理論上該區(qū)域的染色質(zhì)越疏松[18],越可能成為染色質(zhì)的開放區(qū)域進而結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子。對本次測序樣本的peaks進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn),PD26的2BS細胞有45681個peaks,而PD55的2BS細胞有50075個peaks。2.4、結(jié)合位點保守性分析圖4展示了年輕細胞與年老細胞進化保守性的分析結(jié)果。在脊椎動物基因組學中,調(diào)節(jié)復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列,常被以為是功能性保守序列[20]。在本次實驗中,我們對結(jié)合位點進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),年輕細胞與年老細胞的染色質(zhì)開放性變化區(qū)域較保守、類似性高,因而能夠初步推斷這些結(jié)合位點的相關(guān)區(qū)域在轉(zhuǎn)錄表示出中具有較高的重要性。圖2測序序列堿基分布示意圖Fig.2Sequencecontentacrossallbases圖3酶切片段長度的分布Fig.3FragmentlengthdistributionX軸代表Tn5酶切后DNA片段的長度,Y軸代表該長度片段出現(xiàn)的比例。TheX-axisrepresentsfragmentlength,andtheY-axisrepresentsthefrequencyoflengthdistribution.圖4結(jié)合位點保守性分析Fig.4TheresultsofconservationX軸代表此次檢測所得的結(jié)合位點對應基因組中該位點的相對位置信息,華而不實0表示相對位置的中點;Y軸代表保守性的評分,分值越高代表保守性越強。TheX-axisrepresentspositioninformation,and0representsrelativepositionofpeaks.TheY-axisrepresentsconservationscore(ahigherscoreindicatesahigherconservation).2.5、回帖序列(mappedreads)在基因附近的平均信號分析在所有基因長度歸一化后,將reads與hg19基因組比對,計算其在基因組上的分布情況,結(jié)果如此圖5所示。從結(jié)果可知,回帖序列(即染色質(zhì)的開放區(qū)域)主要集中在轉(zhuǎn)錄起始位點附近,提示這些染色質(zhì)的開放區(qū)域與活潑踴躍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。同時,我們發(fā)現(xiàn),隨著細胞衰老程度的加深,轉(zhuǎn)錄起始位點附近的染色質(zhì)開放程度明顯下降,提示隨著細胞衰老的發(fā)生發(fā)展,轉(zhuǎn)錄水平進一步下降。圖5回帖序列在基因附近的平均信號分布Fig.5TherelationshipbetweenmappedreadsandgenesinaverageplotX軸表示歸一化后的基因范圍,-3.0表示TSS上游3kb,3.0表示TTS下游3kb;Y軸表示位點的平均信號,數(shù)值越大代表越富集。TheX-axisrepresentsthenormalizedgenerange,-3.0represents3kbupstreamtheTSS,and3.0represents3kbdownstreamtheTTS.TheY-axisrepresentstheaveragesignalvalueofthesite.TheenrichmentdegreeisproportionaltotheY-axisvalue.2.6、結(jié)合位點在全基因組功能區(qū)上的注釋全基因組的功能區(qū)域分為啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域、轉(zhuǎn)錄終止位點、外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和基因間區(qū)。轉(zhuǎn)錄因子一般集中分布在轉(zhuǎn)錄起始位置附近,即TSS區(qū)域。結(jié)合位點在全基因組功能性區(qū)域上的分布如此圖6所示,年輕細胞(2BS-PD26)、年老細胞(2BS-PD26)的染色質(zhì)開放區(qū)段主要位于:內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)、啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域、外顯子區(qū)和終止子。除去在全基因組中占比極大且不介入基因表示出的內(nèi)含子和基因間區(qū)后,染色質(zhì)開放區(qū)主要富集于啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域。除此之外,圖7結(jié)果顯示年輕細胞與年老細胞中結(jié)合位點在該區(qū)域分布的比例分別為23.04%和15.4%。以上信息表示清楚轉(zhuǎn)錄調(diào)控對復制性衰老有著重要影響,且隨著細胞的逐步衰老,啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域的開放比例進一步下降,即轉(zhuǎn)錄的水平進一步下降。2.7差異結(jié)合位點統(tǒng)計通過分析PD55與PD26之間的差異結(jié)合位點,能夠得到衰老狀態(tài)下特異性染色質(zhì)開放區(qū)域。本次實驗樣本間的差異結(jié)合位點數(shù)目為15812。圖6結(jié)合位點在基因組功能性區(qū)域的分布統(tǒng)計圖Fig.6Theannotationofpeaksinthegenome圖7結(jié)合位點在啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域的分布統(tǒng)計圖Fig.7Theannotationofpeaksinpromoter-TSS2.8、差異結(jié)合位點在全基因組功能區(qū)上的注釋2BS-PD26和2BS-PD55的差異結(jié)合位點在全基因組功能區(qū)的注釋如此圖8所示。結(jié)果表示清楚,細胞衰老后染色質(zhì)關(guān)閉與開放的區(qū)域主要集中在內(nèi)含子區(qū)和啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域。華而不實,染色質(zhì)關(guān)閉的區(qū)域有40.31%分布于內(nèi)含子區(qū),有26.45%分布于啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域;染色質(zhì)開放的區(qū)域有52.55%分布于內(nèi)含子區(qū),有6.18%分布于啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域。同時,在注釋中我們能夠發(fā)現(xiàn)基因間區(qū)占比擬多,揣測可能由于基因間區(qū)在基因組上的占比擬大,故檢測到的結(jié)合位點相對其他區(qū)域更多,但此類結(jié)合位點并非真正的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點。圖8差異結(jié)合位點在基因組功能性區(qū)域的分布統(tǒng)計圖Fig.8Theannotationofdifferentpeaksinthegenome(A)細胞衰老后,染色質(zhì)關(guān)閉區(qū)域在基因組功能性區(qū)域的分布;(B)細胞衰老后,染色質(zhì)開放區(qū)域在基因組功能性區(qū)域的分布。(A)Thedistributionofclosingchromatinregionsannotation;(B)Thedistributionofopenchromatinregionsannotation.2.9、差異位點靶基因的GO分析對2BS-PD26和2BS-PD55的每個差異結(jié)合位點的鄰近基因進行GO注釋,部分結(jié)果如表4所示。表4差異位點靶基因GO富集分析圖9差異位點靶基因的GO富集分析Fig.9GOtermenrichmentanalysistothetargetgeneofdifferentpeaks選取差異位點鄰近基因顯著富集的GO條目繪制柱狀圖,結(jié)果如此圖9所示。富集程度較高的有細胞進程(cellularprocess)、代謝(metabolicprocess)、生物性調(diào)節(jié)(biologicalregulation)、結(jié)合功能(binding)、催化活性(catalyticactivity)等,表示清楚復制性衰老與細胞本身調(diào)節(jié)嚴密相關(guān),而這些生物學經(jīng)過,均與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有密切聯(lián)絡(luò)。3、討論盡管當前針對復制性衰老經(jīng)過中表觀遺傳學變化的研究方式方法有很多,如使用DNA酶1酶切基因組后進行高通量測序的DNase-seq、使用微球菌核酸酶酶切基因組后進行高通量測序的MNase-seq和利用甲醛對染色質(zhì)固定后進行高通量測序的FAIRE-seq,但此類方式方法對實驗組細胞數(shù)量要求極高、所需測序深度較高、實驗步驟繁瑣且可重復性極低[10,16]。ATAC-seq的開發(fā)與應用,極大程度減少了樣本的使用量、增加了實驗的可重復性[21]。本實驗中的測序質(zhì)量分析顯示:堿基錯配率極低、堿基含量分布均勻,這再次證明該實驗方式方法的準確性。同時,ATAC-seq作為檢測表觀遺傳學變化的一種新方式,可對靶基因的表觀狀態(tài)給出更為準確的揣測,具有一定的可挖掘性[22,23]。本研究通過ATAC-seq技術(shù)結(jié)合生物信息學分析方式方法,對年輕代齡(PD26)和年老代齡(PD55)的2BS細胞展開了分析,初步發(fā)現(xiàn),2BS細胞中結(jié)合位點的基因保守性均較強;ATAC-seq的回帖序列主要富集于轉(zhuǎn)錄起始位點附近;結(jié)合位點特異性地注釋于啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域,提示復制性衰老與轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有較強的相關(guān)性。文中在分析回帖序列在基因附近的平均信號分布時,發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的開放區(qū)域主要富集在轉(zhuǎn)錄起始位點附近,且年輕細胞與衰老細胞在轉(zhuǎn)錄起始位點的開放程度不同,衰老時染色質(zhì)的開放程度明顯下降。這可能與衰老時基因的表示出水平改變相關(guān),衰老時細胞內(nèi)各類蛋白質(zhì)的表示出大部分下降。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),E2F1、POLD1等基因的表示出水平隨著細胞衰老出現(xiàn)下降的趨勢[24,25,26],此類基因的啟動子區(qū)在年輕細胞中呈開放狀態(tài),當細胞衰老時則表現(xiàn)得較為封閉。故此類基因的回帖序列經(jīng)過富集分析,可出現(xiàn)衰老時轉(zhuǎn)錄起始位點的富集減少。但是,轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域富集減少并非意味著衰老時細胞不出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此時,細胞內(nèi)以E2F1、POLD1為代表的一類基因還能夠出現(xiàn)微弱表示出,而另外一些基因(如P16INK4a等)則隨著細胞衰老的出現(xiàn)表示出上升[27,28],這些表示出上調(diào)基因的啟動子區(qū)會隨衰老的發(fā)生發(fā)展進一步開放,進而使轉(zhuǎn)錄起始位點富集的回帖序列增加。由于衰老時呈表示出增加的基因仍較表示出減少的基因少,所以從全基因組的層面分析,衰老時染色質(zhì)的開放區(qū)域在轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)的富集下降。其實,結(jié)合位點在全基因組功能區(qū)上的注釋,也進一步說明了這一問題。對于年輕與年老的2BS細胞,其開放區(qū)段均富集于啟動子到轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域,表示清楚轉(zhuǎn)錄調(diào)控對復制性衰老有著重要影響。隨著細胞的逐步衰老,啟動子區(qū)的開放比例進一步下降,講明當細胞衰老發(fā)生時,細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平減弱,而在年輕細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控較為活潑踴躍。當然,在年老細胞中也存在開放的啟動子區(qū),這是由于衰老的細胞也存在需要轉(zhuǎn)錄表示出的基因。除此之外,我們使用GO富集分析進一步驗證了轉(zhuǎn)錄調(diào)控對復制性衰老的調(diào)節(jié)。華而不實,牽涉細胞進程、代謝、生物性調(diào)節(jié)、結(jié)合功能、催化活性等功能的基因,在細胞衰老經(jīng)過中富集,此類基因與細胞本身調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控均有密切聯(lián)絡(luò)。同時,我們也發(fā)現(xiàn),作為復制性衰老經(jīng)典標志物的P53、P16INK4a[1,29,30]等,均在GO分析結(jié)果中富集,如P53富集于GO:0048522、GO:0071840、GO:0016043等;P16INK4a富集于GO:0071840、GO:0016043、GO:0044260等。綜上所述,從轉(zhuǎn)錄調(diào)控探究、理解復制性衰老,應為我們后續(xù)研究的主要工作之一。以下為參考文獻[1]LOPEZ-OTINC,BLASCOMA,PARTRIDGEL,etal.Thehallmarksofaging[J].Cell,2020,153(6):1194-1217.[2]CHILDSBG,BAKERDJ,KIRKLANDJL,etal.Senescenceandapoptosis:duelingorcomplementarycellfates?[J].EMBOReports,2020,15(11):1139-1153.[3]CAMPISIJ,DADDADFF.Cellularsenescence:whenbadthingshappentogoodcells[J].NatureReviewsMolecularCellBiology,2007,8(9):729-740.[4]CHILDSBG,DURIKM,BAKERDJ,etal.Cellularsenescenceinagingandage-relateddisease:frommechanismstotherapy[J].NatureMedicine,2021,21(12):1424-1435.[5]PALS,TYLERJK.Epigeneticsandaging[J].ScienceAdvances,2021,2(7):e1600584.[6]KENNEDYBK,BERGERSL,BRUNETA,etal.Geroscience:linkingagingtochronicdisease[J].Cell,2020,159(4):709-713.[7]MOSKALEVAA,ALIPERAM,SMIT-MCBRIDEZ,etal.Geneticsandepigeneticsofagingandlongevity[J].CellCycle,2020,13(7):1063-1077.[8]CHANDRASEKARANA,IDELCHIKMDPS,MELENDEZJA.Redoxcontrolofsenescenceandage-relateddisease[J].RedoxBiology,2021,11:91-102.[9]VOSSTC,HAGERGL.Dynamicregulationoftranscriptionalstatesbychromatinandtranscriptionfactors[J].NatureReviewsGenetics,2020,15(2):69-81.[10]BUENROSTROJD,GIRESIPG,ZABALC,etal.Transpositionofnativechromatinforfastandsensitiveepigenomicprofilingofopenchromatin,DNA-bindingproteinsandnucleosomeposition[J].NatureMethods,2020,10(12):1213-1218.[11]LIB,CAREYM,WORKMANJL.Theroleofchromatinduringtranscription[J].Cell,2007,128(4):707-719.[12]RUIZJL,TENAJJ,BANCELLSC,etal.CharacterizationoftheaccessiblegenomeinthehumanmalariaparasitePlasmodiumfalciparum[J].NucleicAcidsResearch,2021,46(18):9414-9431.[13]TSOMPANAM,BUCKMJ.Chromatinaccessibility:awindowintothegenome[J].EpigeneticsChromatin,2020,7:33.[14]QUANH,YANGY,LIUS,etal.ChromatinstructurechangesduringvariousprocessesfromaDNAsequenceview[J].CurrentOpinioninStructuralBiology,2022,62:1-8.[15]YUR,MCCAULEYB,DANGW.Lossofchromatinstructuralintegrityisasourceofstressduringaging[J].HumanGenetics,2020,139(3):371-380.[16]BUENROSTROJD,WUB,CHANGHY,etal.ATAC-seq:amethodforassayingchromatinaccessibilitygenome-wide[J].CurrentProtocolsinMolecularBiology,2021,109:21-29.[17]CORCESMR,TREVINOAE,HAMILTONEG,etal.AnimprovedATAC-seqprotocolreducesbackgroundandenablesinterrogationoffrozentissues[J].NatureMethods,2021,14(10):959-962.[18]ZHENGR,WANC,MEIS,etal.CistromeDataBrowser:expandeddatasetsandnewtoolsforgeneregulatoryanalysis[J].NucleicAcidsResearch,2022,47(D1):D729-D735.[19]FANX,ZHUJ,SCHADTEE,etal.StatisticalpowerofphyloHMMforevolutionarilyconservedelementdetection[J].BioMedCentralBioinformatics,2007,8:374.[20]SIEPELA,BEJERANOG,PEDERSENJS,etal.Evolutionarilyconservedelementsinvertebrate,insect,worm,andyeastgenomes[J].GenomeResearch,2005,15(8