Celldeath（細胞死亡）Celldeath（細胞死亡）1ReversiblecellinjuryFunctionalandmorphologicchangesarereversibleifthedamagingstimulusisremoved.Thefeaturesare:decreasedoxidativephosphorylation,ATPdepletionandcellularswelling.Reversibledamage–cellularswellingReversiblecellinjuryFunction2Howmuchcanacellswell?Howmuchcanacellswell?3IrreversibleinjuryandcelldeathWithcontinuingdamage,injurybecomesirreversible.Cellsundergomorphologicchangesrecognisableascelldeath.Irreversibleinjuryandcelld4MechanismsofcellularinjuryMechanismsofcellularinjury5BymorphologyNecrosisTypeICD:apoptosis,pyroptosis,mitoticcatastropheTypeIICD:autophagyTypeIIICD:necroptosis,paraptosis,oncosisBymechanismCaspase-dependentcelldeath(CDCD):typeICDCaspase-independentcelldeath(CICD):necrosis,typeII&IIICDTypesofCellDeathBymorphologyTypesofCellDea6“gene–directedcellularself-destruction”orprogrammedcelldeath.Apoptosis細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結束生命的過程，所以也常常被稱為細胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。生物學意義：細胞凋亡對于多細胞生物個體發育的正常進行，自穩平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起非常關鍵的作用.ApoptoticBCells“gene–directedcellularself7"Webbed"tissuebetweenthedigitsofdevelopinghumanembryosisremovedbyapoptosisTadpoletailremovedbyapoptosisduringdevelopmentNeuronalcelldeathbyapoptosisisfundamentalforCNSdevelopmentEssentialforproperdevelopmentofthemulticellularorganismEssentialforproperdevelopme8CellsoftheintestinalwalldiebyapoptosistobereplacedbynewcellsSkincells(keratinocytes)undergoapoptosisandmigratetothesurfacewheretheyformtheprotectiveouterlayerofskin

Essentialfortheproperfunctioningofthematureorganism免疫學課件--細胞死亡機制9

EssentialfortheremovalofcellsthatthreatenhomeostasisVirus-infectedcells,cancer,CTLCellswhoseDNAhasbeendamagedbyUVlight,exposuretoradiation,chemotherapyAutoreactiveTcellswiththepotentialtoattack"self"areremovedbyapoptosisAttheterminationofanimmuneresponsewhentheyarenolongerneededEssentialfortheremovalofc10SydneyBrenner,H.RobertHorvitz,JohnESulstonApoptosisinC.elegansSydneyBrenner,H.RobertHorv111.形態學特征●細胞體積變小，細胞質濃縮。●胞膜結構完整，有泡狀突起。●細胞核染色質濃縮，聚集核膜周圍。●細胞膜內陷形成凋亡小體

(Apoptoticbodies)。●無內容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。1.形態學特征●細胞體積變小，細胞質濃縮。122.細胞凋亡的生化特征染色質DNA斷裂,形成180~200bp整數倍的DNA片段；細胞內的酶被激活；細胞內活性氧分子增多、胞漿鈣離子升高。膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面線粒體膜電位消失，膜通透性變大，細胞色素C被釋放。2.細胞凋亡的生化特征染色質DNA斷裂,形成180~2013Early:1.Decreasedcellsize(celldehydration)2.Alteredcellmembrane3.LargeDNAstrandbreak4.IncreaseincellularcalciumlevelsIntermediate:1.DNAcleavageinto180~200bpfragments,whichgivethecharacteristic“laddering”onaDNAgel.2.Furtherdecreaseincellsize3.Alterationsinplasmamembranesymmetry4.DecreasedpHLate:1.Lossofmembranefunction2.Apoptoticbodies.ThreestagesEarly:1.Decreasedcellsize(ce14免疫學課件--細胞死亡機制15免疫學課件--細胞死亡機制16免疫學課件--細胞死亡機制17細胞膜泡狀化（blebbing）Caspase3剪切膜蛋白，干擾膜蛋白的代謝。細胞膜泡狀化（blebbing）Caspase3剪切膜蛋白18ApoptosisindevelopmentofCaenorhabditiselegans

ThelifecycleofC.elegansfromeggtosexualmaturity(andneweggs)isabout3days.Theadulthermaphroditeconsistsofexactly959somaticcellsofpreciselydeterminedlineageandfunction.Individualcellsarenamedandtheirrelationshipstotheirneighboursareknown.Overallthe959cellsofadultC.elegansarisefrom1090originalcells;exactly131cellsundergoprogrammedcelldeathinthewildtypeworm.Ofthe1090,302areneurons,andmanyoftheprogrammeddeathsalsolieintheneuronallineage.細胞凋亡機制ApoptosisindevelopmentofCa19GeneticMechanismofApoptosis:TheapoptoticsysteminC.elegans.Meieret.alNatReviews,Vol407,2000.

MolecularnatureofthePCDcamefromgeneticstudiesdoneonC.elegans.131cellsoutof1090cellsundergoPCD:geneticscreensofmutantsidentifiedEgl-1,CED3,CED4andCED9tobeinvolved.Egl-1,CED3,CED4aredeathpromoterssincetheirlossoffunctionresultsinsurvivalofall131doomedcells.

CED9isdeathinhibitorsinceitslossoffunctioncausesembryoniclethalitybymassiveectopiccelldeaths.GeneticMechanismofApoptosis20KauffmannandVaux.Oncogene,22,2003

Fundamentalcomponentsofapoptoticpathwaysareconservedacrossthespecies.Ced-9issimilartohumanoncogene:Bcl2.

Ced-3hasamammaliancounterpart,originallyknownasICE(Interleukin1?ConvertingEnzyme),nowtermedCaspase1.

Ced-4actsasanadapterforcaspaseactivation;themammaliancounterpartApoptosisactivatingfactorApaf-1.

MolecularIdentitiesofapoptoticgenesKauffmannandVaux.Oncogene,221細胞凋亡的信號通路（一）內源性通路（線粒體途徑）（二）外源性通路（死亡受體途徑）:

Fas,TNF,Trail.（三）共同終末：caspase激活，啟動細胞凋亡進程細胞凋亡的信號通路（一）內源性通路（線粒體途徑）22免疫學課件--細胞死亡機制23Mitochondrialpathway線粒體不僅是細胞能量代謝的中心，而且在細胞內源性的死亡信號所誘導的細胞凋亡中處于中心位置。細胞內部的死亡信號源自各種因素，如DNA損傷、氧化應激、X-射線、化療藥物、營養缺乏等。因而，線粒體所介導的凋亡途徑又稱為細胞凋亡的內源途徑。（一）內源性通路：（Intrinsicpathway）Mitochondrialpathway線粒體不僅是細胞能24線粒體介導凋亡的大致過程：

損傷因素→線粒體跨膜電位（△ψ）的消失和線粒體滲透轉運孔（PTP）的開放→細胞色素C從線粒體中的釋放和Caspase-9的激活。線粒體介導凋亡的大致過程：25免疫學課件--細胞死亡機制26（二）外源性通路（Extrinsicpathway）（二）外源性通路（Extrinsicpathway）27TheDeathReceptorFamily

CellsurfacecytokinereceptorsbelongingtoTNF/NGFreceptorsuperfamily.ReceptorsareTypeItransmembraneproteins:intracellularCterminaltail,membranespanningregion,anextracellularligandbindingdomain.Significanthomologyin60-80aacytopl.sequence–Deathdomain(DD).Deathreceptorsareactivatedbytheirnaturalligands:groupofcytokinesbelongingtoTNFfamily.TheDeathReceptorFamilyCell28免疫學課件--細胞死亡機制29DeathReceptorSignaling

Ligandbindingtothedeathreceptorsleadstooligomerizationofthesereceptors.RecruitmentofadaptormoleculesthroughtheirDeathDomains(DD)Thisprotein–proteininteractionisrestrictede.gFas,DR4,DR5recruitsFADDwhereasTNFR1recruitsTRADD.AdaptormoleculesrecruitinitiatorcaspasesthroughinteractionoftheirDeatheffectorDomain(DED)andCARDdomainincaspases.TheresultingcomplexiscalledDeathinducingSignaling(DISC)complex.DeathReceptorSignalingLiga301.Fas/FasLpathway1）Fas/FasL蛋白：Fas又稱CD95或凋亡蛋白-1(Apo-1)，分子量約為43kD，成熟蛋白長319氨基酸。胞膜外區有3個富含半胱氨酸的結構域(cysteine-richdomain,CRD)，其中有2個N-糖基化位點。胞漿部分含有70個左右DD(deathdomain)區。FasL分子量約40kD，成熟蛋白長281個氨基酸。1.Fas/FasLpathway1）Fas/FasL蛋312）分布：Fas表達比較廣泛，胸腺、心臟、肝、肺、腎和卵巢等都有表達。與Fas分布廣泛性不同的是，FasL通常只出現于活化的T細胞和NK細胞。3）Fas誘導凋亡的途徑：Fas-FADD-Caspase-8FasL與Fas結合后，Fas三聚體化。通過DD區的蛋白質之間的相互作用，Fas與FADD(fasassociateddeathdomain)結合，形成DISC(deathinducingsignalingcomplex)。通過FADD的DED(deatheffectordomain)區，Procaspase-8被募集在DISC上。2）分布：32免疫學課件--細胞死亡機制332.TNFpathwayTNF(Tumornecrosisfactor):TNF由活化的單核巨噬細胞產生，亦稱惡液質素；TNF由活化的T細胞產生，亦稱淋巴毒素。兩種TNF的分子量為51kD，結構為同源三聚體，TNF-α和TNF-β都可以分別與TNFRⅠ或TNFRⅡ結合，并且與這兩型受體的結合基本上沒有選擇性。2.TNFpathwayTNF(Tumornecros34TNFR特點TNFRⅠ又稱為TNFR55，胞膜外區有4個CRD，其中有3個N-糖基化位點。胞漿區有3個蛋白激酶C(PKC)作用位點，1個蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位點。TNFRⅡ又稱為TNFR75，胞膜外區也有4個CRD，其中有2個N-糖基化位點。跨膜區有1個PKC作用位點。TNFRⅠ與TNFRⅡ在胞膜外區有28%的同源性，在胞漿區沒有同源性。TNFRⅠ在胞漿區有一個約80個氨基酸的DD區，TNFRⅡ沒有同樣的結構域，但其C端的78個氨基酸殘基可以結合信號轉導蛋白TRAF2(Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor-2)等胞漿信號蛋白，在信號轉導中發揮重要作用。TNFR特點TNFRⅠ又稱為TNFR55，胞膜外區有4個CR35TNF誘導的凋亡途徑TNFRⅠ-TRADD(TNFreceptor-associateddeathdomainprotein)-FADD-Caspase-8TNF與TNFRⅠ結合后，TNFRⅠ三聚體化。通過DD區，TRADD不但可以結合TNFRⅠ的胞漿區，也可以結合FADD的C-端部分。通過FADD的DED區，Procaspase-8被募集在DISC上。聚集的Procaspase-8或10，通過自身或相互切割產生成熟的Caspase-8或10。TNF誘導的凋亡途徑TNFRⅠ-TRADD(TNFrec36

TNFRⅠ活化轉錄因子NF-κB的信號也是通過TRADD介導的，TRADD在通過C端部分的DD區與TNFRⅠ胞漿區結合后，可以與另一種信號轉導蛋白TRAF2(Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor-2)結合，TRAF2再通過NIK→IKK→IκB通路引起NF-κB的活化，使細胞存活。TNF誘導的細胞存活途徑TNFRⅠ活化轉錄因子NF-κB的信號也是通過TR37免疫學課件--細胞死亡機制383.TRAILpathway●TRAIL又稱凋亡蛋白2配體（Apo2ligand）;●由281個氨基酸組成，分子量32kD;●其胞膜外C端區域與FasL和TNFα的同源性分別為28%及23%;●TRAIL受體：DR4又稱Apo-2或TRAILR1，胞膜外區有2個CRD，在C端的胞漿區有DD區，與TNFRI相應的結構域有30%的同源性。

TRAILR—DR5（TRAILR2），其胞膜外區也有2個CRD，胞漿區有DD區。●在正常和腫瘤細胞中，DR4和DR5分布均非常廣泛●最顯著的特征就是能夠選擇性殺傷腫瘤細胞而對大多數正常細胞沒有明顯毒性。3.TRAILpathway●TRAIL又稱凋亡蛋白239DCR1和DCR2的抗凋亡作用●DCR1（Deathdecoyreceptor1）也被稱為TRID(TRAILreceptorwithoutanintracellulardomain)。胞膜外區也有2個CRD，與DR4和DR5分別有69%和52%的同源性。但缺少DD區。●DCR2的胞膜外區與其他TRAILR相似，但它胞漿部分的DD區不完整。●分布：DCR1和DCR2只表達于正常組織，在腫瘤細胞系和轉化細胞不表達。●DCR1和DCR2的抗凋亡作用：DR4、DR5、DCR1和DCR2都可以與TRAIL結合。TRAIL與DR4和DR5的結合可以引起細胞凋亡，而DCR1和DCR2由于沒有胞漿部分或不完整，不能向胞漿中轉導凋亡信號，所以DCR1和DCR2與TRAIL結合后，可以保護細胞不發生凋亡。DCR1和DCR2的抗凋亡作用●DCR1（Deathdec40FADD?Caspase-8Caspase-10FADD?Caspase-841（三）共同終末：caspasecascade（三）共同終末：caspasecascade42Whatiscaspases●Caspase：cysteine-containingaspartate-specificproteases●Agroupofcysteineproteaseswithacrucialcysteineresiduethatcancleaveotherproteins,afteranasparticacidresidue,aspecificitywhichisunusualamongproteases.●Caspasesareessentialincellsforapoptosis.Whatiscaspases●Caspase：cyst43Caspase的種類已鑒定的caspase家族成員有14種：人類12種(無caspase-11、-12)小鼠9種(無caspase-4、-5、-9、-10、-13)不參加caspase編序的有：

C.elegans的7種蛋白酶果蠅的5種蛋白酶。Caspase的種類已鑒定的caspase家族成員有14種：44Caspase家族特征Caspase通常以酶原（Procaspase）的形式存在，相對分子質量為29-49kD。N末端具有一個原結構域（Prodomain）C端包含約20kD的大亞基和約10kD的小亞基C端同源區存在半胱氨酸激活位點，此激活位點結構域為QACR/QG。Caspase家族特征Caspase通常以酶原（Procas45根據在細胞凋亡中的作用，Caspases分為兩大類：啟始Caspase(Initiator):包括-2，-8,-9,-10等，對細胞凋亡的刺激信號作出反應，啟動細胞的凋亡過程；效應Caspase(Effector):包括-3，-6，-7等，是在細胞凋亡過程中的具體執行者，完成對特定蛋白底物的水解。根據在細胞凋亡中的作用，Caspases分為兩大類：46Caspase激活●去除N端原結構域，在大小亞基中進行切割；●大小亞基形成異源二聚體，進而形成四聚體。Caspase激活●去除N端原結構域，在大小亞基中進行切割；47免疫學課件--細胞死亡機制48免疫學課件--細胞死亡機制49Caspase的效應機制激活的Caspase可以水解約100個底物，包括細胞調節、細胞信號轉導、DNA修復、組織平衡、細胞存活等環節中重要的蛋白，從而使細胞表現為凋亡特有的形態學及生化特征：細胞皺縮、斷裂，染色質聚集，DNA降解，以及隨后的凋亡細胞被吞噬細胞迅速地清除等。Caspase的效應機制激活的Caspase可以50三、重要的凋亡控制基因BCl-2家族p53IAP家族三、重要的凋亡控制基因BCl-2家族511.BCl-2家族●

Bcl-2是調節細胞凋亡途徑中的一個重要基因。●后來又發現許多基因結構與Bcl-2相似，稱之為Bcl-2基因家族蛋白產物。●根據它們對細胞凋亡作用結果的不同，可將Bcl-2家族成員分為抑制凋亡和促進凋亡兩大類。1.BCl-2家族●Bcl-2是調節細胞凋亡途徑中的一個52免疫學課件--細胞死亡機制532.P53參與DNA損傷而誘發的細胞凋亡●使細胞在G1期停滯：當DNA由于各種原因損傷后，p53首先誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖，直至損傷的DNA修復。●一旦DNA不能被修復，p53就會活化那些誘導細胞凋亡的基因轉錄，使細胞發生凋亡。2.P53參與DNA損傷而誘發的細胞凋亡543.IAPIAP(inhibitorofapoptosisprotein)為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質，首先是從桿狀病毒（Baculovirus）基因組克隆到。所有的IAP都含有對抗凋亡作用非常重要的70氨基酸的BIR重復序列（BaculovirusIAPRepeat）。在C末端還擁有一個高度保守的RING序列，因而它們具有泛素（Ubiquitin）E3的活性。3.IAPIAP(inhibitorofapopto55HumancellularIAPs(BIRPs)HumancellularIAPs(BIRPs)56IAP抗凋亡的機制通過BIR序列與Caspase蛋白質-蛋白質作用，IAP可以直接抑制Caspase-3、7和9的作用。通過RING序列，IAP可以催化Caspase-3和-7泛素化，導致這些Caspase被proteasome降解。IAP抗凋亡的機制通過BIR序列與Caspase蛋白質-蛋白57TechniquestodetectApoptosis1)VitalDyeexclusionassay:

Trypanblue,propidiumiodide:donotstaintheviablecellsFluoresceindiacetate,Calcein-AM:staintheviablecells.2)MeasurementofcytosolicLeakage:basedonthefactthatviablecellshaveintactcellularcomponents.

LactateDehydrogenase

Pyruvate+NADHLactate+NAD+NADHNADHexhibitsfluorescenceatanexcitationwavelengthof360nmwithemissionat450nm.VelocityofdecreaseofEx360nm/Em450nmindicatesconversionofNADHtoNADandhenceactivityofLDH.3)Clonogenicassay:

Abilityofcellstodivideandformcoloniesiscalledclonogenicactivity.However,integrityofplmembisnotcompromisedtilllatestageandhencenotveryuseful;

DeterminationofCellViabilityTest:TechniquestodetectApoptosis58Theeasiestwaytomeasurecelldeathisbymeasuringlactatedehydrogenase(LDH),astablecytoplasmicenzymewhichispresentinallcellsbutonlyreleasedwhentheplasmamembraneisdamaged.Cell-mediatedcytotoxictywasmeasuredwiththeLDHCytotoxicityDetectionKit.MousespleencellswerestimulatedinvitroandcytotoxicTlymphocytes(CTLs)wereisolated.10,000testcells/wellwereincubatedwiththeeffectorCTLs,andthencelldeathwasmeasuredusingtheLDHassay.Theeasiestwaytomeasurecel59ClonogenicassayClonogenicassay60AlterationsinPlasmaMembrane:

Innormalcells,phosphoidylcholineandsphingomyelinareonexternalleafandphosphotidylethnolamineandphosphatidylserine(PS)areintheinnerleaflet.Redistributionofphospholipidsintheplasmamemb.isanearlyapoptoticchange.AnnexinVconjugatedwithflourophorelikeFITCcanbindtoexposedtoPSinCadependentmanner.Canbeviewedmicroscopicallyorbyflowcytometry.AlterationsinPlasmaMembrane61AnnexinVstainingAnnexinVstaining62AlterationsinCytosol:caspaseactivation

Activationofcaspases:hallmarkofapoptosis,canbemeasured.WesternblotforPARP,smallsubunitsofcaspase3,7,8and9.Biochemicalanalysisofcaspaseactivity:Tetrapeptidesequence(recognitionsiteofcaspase)conjugatedwithreportgrouplikep-nitroanilide(pNA)7-amino-4-methylcoumarin(AMC)7-amino-4–triflouromethylcoumarin(AFC)Calorimetric/flourimetricmeasurements.Immunohistochemica

Immunostaining/flourescentsubstratesintissues/cells.l/immunoflorescentstainingonparaffinsections.Cellpermeableflourescentsubstrates:PhiphiLux(Oncogeneresearchproducts)AlterationsinCytosol:caspas63Bcl2familyProteins:

Westernblotwithantibodiesspecifictoindividualmembers.Ifsubcellularlocalisationisnotrelevant:cellscanbelysedinnon-ionicdetergent.Ifsubcellularisneeded,cellularcomponentsaresubfractionatedtoobtainmitochondrialandcytosolicfractions.TodetermineBaxorBakoligomers,crosslinkingagentsareaddede.g

disuccinimidylsuberate(DSS),Bis(Sulphosuccinimidyl)suberate(BS3)tothemitochondrialfractionsuspendedinisotonicbuffer.Thecrosslinkerisquenchedwith1MTris-HClph7.5.Membranesarethenlysedinradioimmunolprecipitationassay(RIPA)bufferandclearedbycentrifugationat12000g:analysisbySDSandWesternBlot.

OligomerisationisvisualisedusingWesternblotasahighmolecularweightspecies.Bcl2familyProteins:Western64

Cytcreleaseisthemostcommonparameterofactivemitochondrialpathway.Subcellularfractionationtoyieldmitochondrialfractionwhichissuspendedinisotonicbufferwithenergisingagents.

WesternBlotofbothsupernatantandpelletwithcytcantibody:cytcinsupandreductioninthepelletindicatecytcrelease.ELISA:SupernatantispreparedforELISAfordetectionofCytc.ImmunostainingcellsundergoingapoptosisarewashedandfixedincubatedwithanticytcAbWashandincubationwithsecAbtaggedwithflourophore.Diffusedcytoplasmicstainingindicatescytcrelease

MitochondrialreleaseofCytCMitochondrialChanges:Cytcreleaseisthemostco65MitochondrialTransmembranePotentials:

Mitochondriatransmembranepotentialisafunctionalparameterduringapoptosis.Canbedeterminedbylipophiliccations:accumulationispotentialdependent.Commonlyusedare:Rhodamine123(Rh123),DiOC6,Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM),JC-1.Probescanbedirectlyaddedtoculturedcellsorisolatedmitochondria,incubatedfor15minandharvestedtobeanalyzedbyfloworfluorescentmicroscopy.MitochondrialTransmembranePo66

ChangesintheNucleus:NuclearCondensationandFragmentation:

Nuclearcondensationandfragmentationcanbevisualisedbystainingwithfluorescentdyese.gHoechst(bisbenzimide)andDAPI(4’6’diamidino2-phenylindole,dilactate).Intensityofstaininginthenucleusisproportionaltotheextentofapoptosisduetoincreasedpermeabilityofthedyes.ChangesintheNucleus:Nuclea67DNAcontentstainingbyPropidiumIodide::

DegradationofnuclearDNAresultsindecreaseinDNAcontentorhypoploidy.CellsaresuspendedinicecoldPBS,fixedwithcoldethanol.CellsarepermeabilisedwithTritonx100,stainedwithPIandanalysedwithflow.However,necroticandothercellulardebriscanalsogetincluded.DNAcontentstainingbyPropid68DNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數量2N4NDNA細胞周期分析細胞周期G2MG0G1s20040069DNA降解分析CAD核酸酶（Caspases-activatedDNase）可以造成凋亡時DNA的片段化。在正常情況下，CAD不顯示活性，因為CAD以一種無活性的復合物形式（CAD-ICAD）存在。細胞凋亡時，Caspases水解ICAD，CAD就會處于活性狀態并最終使DNA片段化。瓊脂糖凝膠電泳DNA降解分析CAD核酸酶（Caspases-activat70DNAFragmentation:

CleavageofDNAatnucleosomalsitesresultsin180-200bpfragmentswhichappearsasDNAladder.Quantitativemeasurement:amountoffragmentedDNAisproportionaltofrequencyofapoptosis.DNAFragmentation:Cleavageo71DetectionofDNAbreaksbyTUNELassay:(Terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)mediateddUTPnickendlabeling)

BasedontheprinciplethatTdTmediatesincorporationofbiotinylateddUTPinto3’OHendsoffragmentedDNA.CellsarepermeabilisedusingTritonX100orProteinaseKincaseofformalinfixedtissuesections.Cells/TissuesectionsaretheincubatdwithTdTanddUTP-biotin.Afterwash,cells/TissuescanbeincubatedeitherwithFITCconjugatedavidinfordetectionunderfluoroscentmicroscopeoravidin-HRPconjugatecanbeaddedfollowedbyDAB.DetectionofDNAbreaksbyTU72細胞自噬（Autophagy）1962年Ashford等在胰高血糖素處理的小鼠肝細胞中觀察到autophagy1963年,DeDuve首次提出細胞自噬的生物學概念:細胞在缺乏營養和能量供應時，部分細胞質與細胞器被包裹進一種特異性的雙層膜或者多層膜結構的自噬體(autophagosome)中，形成的自噬體再與溶酶體(Lysosome)融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，胞質和細胞器成分在這里被降解為核苷酸、氨基酸、游離脂肪酸等小分子物質，這些小分子物質可以被重新利用合成大分子或者合成ATP。細胞自噬（Autophagy）1962年Ashford等在胰73Autophagyautophagyisaprocessbywhichcellsundergopartialautodigestionthatprolongssurvivalforashorttimeunderstarvationconditions.Itprovidesnutrientsthatarenecessarytomaintaincellviability.autophagyisalsoinvolvedinthekillingofbacteriathatareingestedbycells.細胞生存的一種機制,在很多生理過程如清除損傷、衰老細胞器以及冗余蛋白上發揮著重要作用Autophagyautophagyisaproces74Autophagy細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現象細胞內物質的兩種降解途徑：蛋白酶體系統：降解胞內的短壽命蛋白自噬作用：長壽命蛋白和一些細胞器的降解利用Autophagy細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子75theproteasomebreaksdownubiquitinatedproteins,butitmaynotrecognizemisfoldedproteinsandproteinaggregatestheproteasomebreaksdownubi76Vesiclecontaining

twodamaged

organelles1mMitochondrion

fragmentPeroxisome

fragmentPeroxisomeVesicleMitochondrionLysosomeDigestion(b)AutophagyVesiclecontaining

twodamaged77免疫學課件--細胞死亡機制78AutophagyisactivatedbyChangingofenvironmentalconditions:starvationconditionsassociatedwithdeficiencyofnutrientssuchasaminoacids;hypoxicconditions;hightemperaturesCellularremolding:duringdevelopmentanddifferentiation（誘導因素：營養和能量缺乏、氧化應激、感染、蛋白質大量聚集）AutophagyisactivatedbyChang79小自噬2大自噬（一般）1

3分子伴侶介導的自噬（CMA）：由內質網來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內容物；分子伴侶介導的自噬（CMA）：溶酶體的膜直接包裹長壽命蛋白等，并在溶酶體內降解；胞質內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性。

根據細胞物質運到溶酶體內的途徑不同小自噬2大自噬（一般）13分子伴侶介導的自噬80免疫學課件--細胞死亡機制81免疫學課件--細胞死亡機制82細胞自噬過程自噬體膜：來源：粗面內質網的非核糖體區域高爾基體一種新合成的結構被降解物：部分胞漿細胞內需降解的細胞器(線粒體)細胞內需降解的蛋白質細胞自噬過程自噬體膜：來源：83細胞自噬過程饑餓、氧化應激損傷→自噬體膜脫落，形成環狀分隔膜，包繞在被降解物周圍分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成自噬體（autophagosome）自噬體通過細胞骨架微管系統運輸至溶酶體，與之融合形成自噬溶酶體(autolysosome),并降解其內成分，自噬體膜脫落再循環利用細胞自噬過程饑餓、氧化應激損傷→自噬體膜脫落，形成環狀分隔膜84自噬的過程自噬的過程85自噬的過程自噬的過程86自噬的功能對外源性刺激(包括營養缺乏、細胞密度負荷、低氧、氧化應激、感染等)的適應性反應：降解產物氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸等可供物質能量循環細胞保持穩定狀態的管家機制：調控長壽命蛋白、過氧化物體、線粒體和內質網的更新參與一定的組織特異性融合一種防御機制:清除胞質內受損的細胞器、代謝產物,進行亞細胞水平上的重構,保護受損的細胞；作為一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡自噬的功能對外源性刺激(包括營養缺乏、細胞密度負荷、低氧、87細胞自噬的分子機制參與自噬體形成的兩個泛素樣蛋白系統：分別由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和LC3參與組成Atg12首先由E1酶Atg7活化，之后轉運至E2酶Atg10，最后與Atg5結合,形成自噬體前體(autophagosomalprecursor)；LC3-Ⅰ也被Atg7活化，轉運至第二種E2酶Atg3，并被修飾成膜結合形式LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體——自噬體的標志分子（LC3是酵母細胞自噬相關基因Atg8的類似物）細胞自噬的分子機制參與自噬體形成的兩個泛素樣蛋白系統：88細胞自噬的分子機制Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（ClassⅢPI3K）PI3kinasetypeIII,whichincludesAtg6initscomplex,promotesthenucleationofautophagicvesicles.細胞自噬的分子機制Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（ClassⅢPI89自噬的生理學意義自噬在生理過程的作用：參與發育和分化過程中機體的重新構建(remomding)營養缺乏時產生氨基酸清除不需要的、損傷的細胞器與分子自噬的生理學意義自噬在生理過程的作用：90自噬的生理和病理意義廣泛存在于正常的生理過程中：如清除細胞廢物、結構重建、生長分化等細胞對不良環境的一種防御機制：如對抗營養缺乏、電離輻射參與多種疾病的病理過程：無論是自噬過度還是自噬不足都可能導致疾病發生自噬的生理和病理意義廣泛存在于正常的生理過程中：如清除細胞91AutophagyinDiseaseAutophagyandNeurodegenerativeDiseasesAutophagyandLiverDiseaseAutophagyandMuscleDiseaseAutophagyandCardiacDiseaseAutophagyandCancerAutophagyandAgingAutophagyinInfection,Immunity,andInlammatoryDiseasesAutophagyinDiseaseAutophagy92細胞自噬與腫瘤自噬對于腫瘤細胞存在雙向效應腫瘤發展不同階段、組織類型、細胞分化狀態、周圍環境以及特定的基因特征和信號轉導途徑共同影響著自噬的活性和結果細胞自噬與腫瘤自噬對于腫瘤細胞存在雙向效應93細胞自噬與腫瘤細胞自噬與腫瘤94AutophagyinInfection,Immunity,andInflammatoryDiseasesAutophagyinInfection,Immuni95免疫學課件--細胞死亡機制96免疫學課件--細胞死亡機制97免疫學課件--細胞死亡機制98LC3translocationtothephagosomeisinducedbyTLRsignalling.AutophayislinkedtoTLRsignalingLC3translocationtothephago99Theroleofautophagyincontrolofinnateimmunityandthesurvivalmechanismsofintracellularbacteria.Theroleofautophagyincontr1001.透射電鏡下超微結構的形態學觀測2.熒光染色法（MDC）3.自噬體膜標志性蛋白的檢測（Lc3-GFP）4.利用WesternBlot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬

（Note：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法4和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。）

5.檢測長壽蛋白的批量降解：非特異

6.殘體檢測（自噬溶酶體不能降解物質）自噬體的檢測手段1.透射電鏡下超微結構的形態學觀測自噬體的檢測手段101免疫學課件--細胞死亡機制102自噬抑制劑的應用根據自噬形成的過程，自噬的抑制分為不同的階段：

（1）對自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑，3-MA,Wortmannin，LY294002等（2）對自噬體與溶酶體融合的抑制：有巴伐洛霉素A1、長春堿、諾考達唑等。（3）對溶酶體降解的抑制:蛋白酶抑制劑，如E64d、PepstatinA等自噬抑制劑的應用根據自噬形成的過程，自噬的抑制分為不同的階段103免疫學課件--細胞死亡機制104Necroptosis

Fas,TNF-alphafamilyWhencaspasesareinhibitedincertaincelltypeNecrosisSwellingofmitochondriaandERIntracellularvacuolizationDilationofthenuclearmembraneFADDCaspase8Caspase3CanonicalapoptosisNecroptosisFas,TNF-alphafam105NumerousDAMPsreleasedfromcellsundergoingaccidentalnecroticcelldeathNumerousDAMPsreleasedfromc106Necroptosiscanbeinducedbyvariousstimulithatarerecognizedbyspeci?creceptors.Necroptosiscanbeinducedby107PolyICTriggersaCathepsinD-andIPS-1-DependentPathwaytoEnhanceCytokineProductionandMediateDendriticCellNecroptosisPolyICStimulationInducesLossofLysosomeIntegrityPolyICTriggersaCathepsinD108NecrosisCellswellingandruptureReleaseinintracellularcomponentsActivationofinflammatoryresponseCanberegulatedCanoccurinconcertwithorinsteadofapoptosis(e.g.ifapoptosisisblocked)NecrosisCellswellingandrupt109PyroptosisCaspase-1-dependentcelldeathConvertIL-1BandIL-18toactiveformsPyroptosisCaspase-1-dependent110免疫學課件--細胞死亡機制111InflammasomeComponentsCoordinateAutophagyandPyroptosisasMacrophageResponsestoInfectionInflammasomeComponentsCoordi112Celldeath（細胞死亡）Celldeath（細胞死亡）113ReversiblecellinjuryFunctionalandmorphologicchangesarereversibleifthedamagingstimulusisremoved.Thefeaturesare:decreasedoxidativephosphorylation,ATPdepletionandcellularswelling.Reversibledamage–cellularswellingReversiblecellinjuryFunction114Howmuchcanacellswell?Howmuchcanacellswell?115IrreversibleinjuryandcelldeathWithcontinuingdamage,injurybecomesirreversible.Cellsundergomorphologicchangesrecognisableascelldeath.Irreversibleinjuryandcelld116MechanismsofcellularinjuryMechanismsofcellularinjury117BymorphologyNecrosisTypeICD:apoptosis,pyroptosis,mitoticcatastropheTypeIICD:autophagyTypeIIICD:necroptosis,paraptosis,oncosisBymechanismCaspase-dependentcelldeath(CDCD):typeICDCaspase-independentcelldeath(CICD):necrosis,typeII&IIICDTypesofCellDeathBymorphologyTypesofCellDea118“gene–directedcellularself-destruction”orprogrammedcelldeath.Apoptosis細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結束生命的過程，所以也常常被稱為細胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。生物學意義：細胞凋亡對于多細胞生物個體發育的正常進行，自穩平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起非常關鍵的作用.ApoptoticBCells“gene–directedcellularself119"Webbed"tissuebetweenthedigitsofdevelopinghumanembryosisremovedbyapoptosisTadpoletailremovedbyapoptosisduringdevelopmentNeuronalcelldeathbyapoptosisisfundamentalforCNSdevelopmentEssentialforproperdevelopmentofthemulticellularorganismEssentialforproperdevelopme120CellsoftheintestinalwalldiebyapoptosistobereplacedbynewcellsSkincells(keratinocytes)undergoapoptosisandmigratetothesurfacewheretheyformtheprotectiveouterlayerofskin

Essentialfortheproperfunctioningofthematureorganism免疫學課件--細胞死亡機制121

EssentialfortheremovalofcellsthatthreatenhomeostasisVirus-infectedcells,cancer,CTLCellswhoseDNAhasbeendamagedbyUVlight,exposuretoradiation,chemotherapyAutoreactiveTcellswiththepotentialtoattack"self"areremovedbyapoptosisAttheterminationofanimmuneresponsewhentheyarenolongerneededEssentialfortheremovalofc122SydneyBrenner,H.RobertHorvitz,JohnESulstonApoptosisinC.elegansSydneyBrenner,H.RobertHorv1231.形態學特征●細胞體積變小，細胞質濃縮。●胞膜結構完整，有泡狀突起。●細胞核染色質濃縮，聚集核膜周圍。●細胞膜內陷形成凋亡小體

(Apoptoticbodies)。●無內容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。1.形態學特征●細胞體積變小，細胞質濃縮。1242.細胞凋亡的生化特征染色質DNA斷裂,形成180~200bp整數倍的DNA片段；細胞內的酶被激活；細胞內活性氧分子增多、胞漿鈣離子升高。膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面線粒體膜電位消失，膜通透性變大，細胞色素C被釋放。2.細胞凋亡的生化特征染色質DNA斷裂,形成180~20125Early:1.Decreasedcellsize(celldehydration)2.Alteredcellmembrane3.LargeDNAstrandbreak4.IncreaseincellularcalciumlevelsIntermediate:1.DNAcleavageinto180~200bpfragments,whichgivethecharacteristic“laddering”onaDNAgel.2.Furtherdecreaseincellsize3.Alterationsinplasmamembranesymmetry4.DecreasedpHLate:1.Lossofmembranefunction2.Apoptoticbodies.ThreestagesEarly: