第二章

基因工程制藥第二章1一、基因的概念:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質的最小功能單位。早期認為遺傳物質是蛋白質，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉化實驗證明是DNA。前言：基因工程的基礎知識一、基因的概念:前言：基因工程的基礎知識2二、基因的一般特性：①基因可自我復制，②基因決定蛋白質結構，③基因可突變。基因按功能分為：①結構基因②調控基因二、基因的一般特性：3三、DNA的結構與性能⒈DNA的結構：四種核苷酸（ATCG）連接。DNA二級結構為雙螺旋結構。⒉DNA的性質與功能①吸收光譜260②電場中泳動③變性復性雜交三、DNA的結構與性能4（一）、DNA的復制：半保留復制四DNA的復制與表達（一）、DNA的復制：四DNA的復制與表達5二、基因表達

⒈轉錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。轉錄后加工：剪切：除去內含子加帽：5’加m7Gppp加尾：3’加poly（A）二、基因表達⒈轉錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板6

二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質的過程。⒈分為三個階段：①起始②延長③終止二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的7第二章基因工程制藥

1-4節第二章基因工程制藥

1-4節820世紀70年代基因工程誕生最先應用在醫藥科學領域。1982年第一個基因工程產品--人胰島素在美國問世。優點:大量生產、應用臨床、深入研究、擴大應用、改造不足。第一節概述20世紀70年代基因工程誕生最先應用在醫藥科學領域9基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌(或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術。第二節基因工程藥物生產的基本過程基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的10基因工程基本過程基因工程基本過程11⒈目的基因的克隆，⒉構建DNA重組體，⒊DNA重組體轉入宿主菌，⒋構建工程菌，⒌工程菌發酵，⒍表達產物的分離純化，⒎產品的檢驗等。基因工程藥物制藥的主要程序⒈目的基因的克隆，基因工程藥物制藥的主要程序12基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質粒構建工程菌（或細胞）培養工程菌產物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質粒13克隆真核基因常用方法：逆轉錄法和化學合成法。一、逆轉錄法逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。第三節目的基因的獲得克隆真核基因常用方法：逆轉錄法和化學合成法。第三節14⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定⒈mRNA的純化15二、化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質的氨基酸順序。用化學法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。二、化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以16人工化學合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。⒊費用高。人工化學合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA17篩選基因的其他方法1編碼序列富集法2島嶼獲救PCR法3動物雜交法4功能克隆法5構建cDNA文庫6差異顯示技術篩選基因的其他方法1編碼序列富集法18第四節基因表達基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程中基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產的表達產物。第四節基因表達基因表達是指結構基因在生物體19最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高、表達產物穩定、生物活性高和表達產物容易分離純化。最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高、表達產物20一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應滿足以下要求:容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產生內毒素；

一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應滿足21發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；容易進行代謝調控；容易進行DNA重組技術操作；產物的產量、產率高，產物容易提取純化。發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；22宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。宿主細胞分為兩大類：23⒈原核細胞⑴大腸桿菌因為大腸桿菌的分子遺傳學研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。

⒈原核細胞⑴大腸桿菌24表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、25因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。其內毒素很難除去。因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表26⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強，蛋白質不形成包含體。產物蛋白質不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產物降解。⑵枯草芽胞桿菌27⑶鏈霉菌作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產物可糖基化。⑶鏈霉菌28⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞29⑵絲狀真菌優點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發酵和后處理工藝。⑵絲狀真菌30目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導入方法。許多外源基因已獲得成功表達。目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立31二、大腸桿菌中的基因表達載體基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運載到受體細胞內，從而復制擴增大量的目的DNA分子或轉錄表達為相應的產物。

二、大腸桿菌中的基因表達載體32基因工程載體分為：克隆載體轉錄載體表達載體克隆載體轉錄載體表達載體DNADNARNA蛋白質

基因工程載體分為：33原核細胞的基因組特點：①染色質為環狀雙股DNA分子②具有操縱子結構③結構基因多為單拷貝④特定區域分布特異DNA順序因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA復制體系的特定區段原核細胞的基因組特點：34基因工程克隆載體的特點：①具有復制子②有單一限制內切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標記如抗藥基因④拷貝數高⑤生物安全性好基因工程克隆載體的特點：35基因工程制藥課件36目前使用的載體按特性可分為：①質粒②λ噬菌體③黏性質粒④M13噬菌體⑤酵母⑥真核細胞病毒載體目前使用的載體按特性可分為：37細菌質粒的生物學特性質粒的定義：質粒是存在于細菌等微生物細胞染色質以外的共價閉環的雙股DNA分子，具有獨立自主復制和調控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。細菌質粒的生物學特性38質粒的生物學特性①大小小型質粒1.5～15kb,大型質粒60～120kb②復制類型:嚴緊型質粒,松弛型質粒③拷貝數④電泳特點⑤不相容性質粒的生物學特性39質粒的分類:⒈按復制型式①嚴緊型②松弛型⒉按基因轉移性①傳遞性質粒②非傳遞性質粒⒊按遺傳性狀產物分類:①抗生素抗性②限制酶修飾酶系統質粒的分類:40⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立復制。載體本身是一個復制子，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：41⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑶應具有很強的啟動子，能為42⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNA較為穩定。⑹所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉錄后順利翻譯。⑸應具有很強的終止子，只轉錄43常用表達載體--質粒pBV220的結構pBV220系統國內使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列常用表達載體--質粒pBV220的結構pBV220系統國44pBV220系統優點：①cIts857抑制子基因PL啟動子同在一個載體上，可以轉化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉錄終止信號可防止出現“通讀”現象，有利于質粒-宿主系統的穩定；pBV220系統優點：45④整個質粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯，可以增強啟動作用；④整個質粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數及容量，可以插46本系統宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質粒拷貝數較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。本系統為溫度誘導，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產物以包含體形式存在不易降解均一性好；本系統宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C47pBG-2是由pBV220系統衍生的便于產物純化的融合表達載體。該質粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結合區基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點，引入剪切融合蛋白具有與IgG結合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-2是由pBV220系統衍生的便于產物純化的48融合表達質粒pBG-2的結構融合表達質粒pBG-2的結構49⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產量與細胞濃度和細胞表達產量呈正相關。單個細胞產量取決于：⑴外源基因的拷貝數⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產量與細50⑵外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑵外源基因的表達效率51⑶表達產物的穩定性⑷細胞代謝負荷⑸工程菌的培養條件⑶表達產物的穩定性52⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。優點：操作簡便，表達蛋白在菌體內穩定，易實現高效表達；缺點：只能作抗原用。⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式⑴以融合蛋白的形式表達藥53⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。優點：保持原有蛋白活性；缺點：易被蛋白酶破壞。⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因54⑶分泌型表達藥物基因優點：在周質中穩定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點：產量不高，信號肽不被切割。⑶分泌型表達藥物基因55三、酵母中的基因表達⒈載體

酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細胞內保存和復制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。三、酵母中的基因表達⒈載體56⑴載體的復制系列可分四類：①Yep類（yeastepisomalplasmid，

酵母附加體質粒）②YRp類（yeastreplicationplasmid，

酵母復制型質粒）③YCp類（yeastcentromericplasmid，

酵母著絲粒質粒）④YIp類（yeastintegrativeplasmid，

酵母整合型質粒）⑴載體的復制系列可分四類：57⑵克隆載體⑶表達載體①普通表達載體②精確表達載體⑵克隆載體58⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數⑵外源基因的表達效率①啟動子②分泌信號的效率③終止序列的影響⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數59⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響①菌體生長力強②菌體內源蛋白酶要較弱③菌體性能穩定④分泌能力強⑶外源蛋白的糖基化60四、動物細胞中的基因表達哺乳動物細胞外源基因表達產物可由重組轉化的細胞分泌到培養液中，使產物易純化。基因產物糖基化接近天然產物。四、動物細胞中的基因表達哺乳動物細胞外源基因表達產物可由61細胞生長慢，生產率低，條件刻苛，費用高，培養液濃度較小。表達的外源細胞均為傳代細胞表達產物是否致癌尚有疑問。細胞生長慢，生產率低，62

主要基因工程表達體系比較表達體系產物產生部位培養方式提純產物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質菌體內容易一般對原核好不大融合蛋白質部分高產對真核差酵母多肽蛋白質菌體內容易菌體內真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產稍復雜天然產物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達天然需注意糖基化蛋白可高產產物致癌主要基因工程表達體系比較表達體系63

第二章

基因工程制藥第二章64一、基因的概念:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質的最小功能單位。早期認為遺傳物質是蛋白質，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉化實驗證明是DNA。前言：基因工程的基礎知識一、基因的概念:前言：基因工程的基礎知識65二、基因的一般特性：①基因可自我復制，②基因決定蛋白質結構，③基因可突變。基因按功能分為：①結構基因②調控基因二、基因的一般特性：66三、DNA的結構與性能⒈DNA的結構：四種核苷酸（ATCG）連接。DNA二級結構為雙螺旋結構。⒉DNA的性質與功能①吸收光譜260②電場中泳動③變性復性雜交三、DNA的結構與性能67（一）、DNA的復制：半保留復制四DNA的復制與表達（一）、DNA的復制：四DNA的復制與表達68二、基因表達

⒈轉錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。轉錄后加工：剪切：除去內含子加帽：5’加m7Gppp加尾：3’加poly（A）二、基因表達⒈轉錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板69

二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質的過程。⒈分為三個階段：①起始②延長③終止二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的70第二章基因工程制藥

1-4節第二章基因工程制藥

1-4節7120世紀70年代基因工程誕生最先應用在醫藥科學領域。1982年第一個基因工程產品--人胰島素在美國問世。優點:大量生產、應用臨床、深入研究、擴大應用、改造不足。第一節概述20世紀70年代基因工程誕生最先應用在醫藥科學領域72基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌(或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術。第二節基因工程藥物生產的基本過程基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的73基因工程基本過程基因工程基本過程74⒈目的基因的克隆，⒉構建DNA重組體，⒊DNA重組體轉入宿主菌，⒋構建工程菌，⒌工程菌發酵，⒍表達產物的分離純化，⒎產品的檢驗等。基因工程藥物制藥的主要程序⒈目的基因的克隆，基因工程藥物制藥的主要程序75基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質粒構建工程菌（或細胞）培養工程菌產物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質粒76克隆真核基因常用方法：逆轉錄法和化學合成法。一、逆轉錄法逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。第三節目的基因的獲得克隆真核基因常用方法：逆轉錄法和化學合成法。第三節77⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定⒈mRNA的純化78二、化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質的氨基酸順序。用化學法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。二、化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以79人工化學合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。⒊費用高。人工化學合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA80篩選基因的其他方法1編碼序列富集法2島嶼獲救PCR法3動物雜交法4功能克隆法5構建cDNA文庫6差異顯示技術篩選基因的其他方法1編碼序列富集法81第四節基因表達基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程中基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產的表達產物。第四節基因表達基因表達是指結構基因在生物體82最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高、表達產物穩定、生物活性高和表達產物容易分離純化。最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高、表達產物83一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應滿足以下要求:容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產生內毒素；

一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應滿足84發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；容易進行代謝調控；容易進行DNA重組技術操作；產物的產量、產率高，產物容易提取純化。發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；85宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。宿主細胞分為兩大類：86⒈原核細胞⑴大腸桿菌因為大腸桿菌的分子遺傳學研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。

⒈原核細胞⑴大腸桿菌87表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、88因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。其內毒素很難除去。因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表89⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強，蛋白質不形成包含體。產物蛋白質不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產物降解。⑵枯草芽胞桿菌90⑶鏈霉菌作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產物可糖基化。⑶鏈霉菌91⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞92⑵絲狀真菌優點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發酵和后處理工藝。⑵絲狀真菌93目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導入方法。許多外源基因已獲得成功表達。目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立94二、大腸桿菌中的基因表達載體基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運載到受體細胞內，從而復制擴增大量的目的DNA分子或轉錄表達為相應的產物。

二、大腸桿菌中的基因表達載體95基因工程載體分為：克隆載體轉錄載體表達載體克隆載體轉錄載體表達載體DNADNARNA蛋白質

基因工程載體分為：96原核細胞的基因組特點：①染色質為環狀雙股DNA分子②具有操縱子結構③結構基因多為單拷貝④特定區域分布特異DNA順序因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA復制體系的特定區段原核細胞的基因組特點：97基因工程克隆載體的特點：①具有復制子②有單一限制內切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標記如抗藥基因④拷貝數高⑤生物安全性好基因工程克隆載體的特點：98基因工程制藥課件99目前使用的載體按特性可分為：①質粒②λ噬菌體③黏性質粒④M13噬菌體⑤酵母⑥真核細胞病毒載體目前使用的載體按特性可分為：100細菌質粒的生物學特性質粒的定義：質粒是存在于細菌等微生物細胞染色質以外的共價閉環的雙股DNA分子，具有獨立自主復制和調控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。細菌質粒的生物學特性101質粒的生物學特性①大小小型質粒1.5～15kb,大型質粒60～120kb②復制類型:嚴緊型質粒,松弛型質粒③拷貝數④電泳特點⑤不相容性質粒的生物學特性102質粒的分類:⒈按復制型式①嚴緊型②松弛型⒉按基因轉移性①傳遞性質粒②非傳遞性質粒⒊按遺傳性狀產物分類:①抗生素抗性②限制酶修飾酶系統質粒的分類:103⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立復制。載體本身是一個復制子，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：104⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑶應具有很強的啟動子，能為105⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNA較為穩定。⑹所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉錄后順利翻譯。⑸應具有很強的終止子，只轉錄106常用表達載體--質粒pBV220的結構pBV220系統國內使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列常用表達載體--質粒pBV220的結構pBV220系統國107pBV220系統優點：①cIts857抑制子基因PL啟動子同在一個載體上，可以轉化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉錄終止信號可防止出現“通讀”現象，有利于質粒-宿主系統的穩定；pBV220系統優點：108④整個質粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯，可以增強啟動作用；④整個質粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數及容量，可以插109本系統宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質粒拷貝數較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。本系統為溫度誘導，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產物以包含體形式存在不易降解均一性好；本系統宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C110pBG-2是由pBV220系統衍生的便于產物純化的融合表達載體。該質粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結合區基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點，引入剪切融合蛋白具有與IgG結合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-2是由pBV220系統衍生的便于產物純化的111融合表達質粒pBG-2的結構融合表達質粒pBG-2的結構112⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產量與細胞濃度和細胞表達產量呈正相關。單個細胞產量取決于：⑴外源基因的拷貝數⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產量與細113⑵外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑵外源基因的表達效率114⑶表達產物的穩定性⑷細胞代謝負荷⑸工程菌的培養條件⑶表達產物的穩定性115⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。優點：操作簡便，表達蛋白在菌體內穩定，易實現高效表達；缺點：只能作抗原用。⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式⑴以融合蛋白的形式表達藥116