第二章

基因工程制藥第二章1一、基因的概念:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。早期認為遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗證明是DNA。前言：基因工程的基礎(chǔ)知識一、基因的概念:前言：基因工程的基礎(chǔ)知識2二、基因的一般特性：①基因可自我復(fù)制，②基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，③基因可突變。基因按功能分為：①結(jié)構(gòu)基因②調(diào)控基因二、基因的一般特性：3三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能⒈DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（ATCG）連接。DNA二級結(jié)構(gòu)為雙螺旋結(jié)構(gòu)。⒉DNA的性質(zhì)與功能①吸收光譜260②電場中泳動③變性復(fù)性雜交三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能4（一）、DNA的復(fù)制：半保留復(fù)制四DNA的復(fù)制與表達（一）、DNA的復(fù)制：四DNA的復(fù)制與表達5二、基因表達

⒈轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。轉(zhuǎn)錄后加工：剪切：除去內(nèi)含子加帽：5’加m7Gppp加尾：3’加poly（A）二、基因表達⒈轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板6

二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過程。⒈分為三個階段：①起始②延長③終止二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的7第二章基因工程制藥

1-4節(jié)第二章基因工程制藥

1-4節(jié)820世紀70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。1982年第一個基因工程產(chǎn)品--人胰島素在美國問世。優(yōu)點:大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴大應(yīng)用、改造不足。第一節(jié)概述20世紀70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域9基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的10基因工程基本過程基因工程基本過程11⒈目的基因的克隆，⒉構(gòu)建DNA重組體，⒊DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌，⒋構(gòu)建工程菌，⒌工程菌發(fā)酵，⒍表達產(chǎn)物的分離純化，⒎產(chǎn)品的檢驗等。基因工程藥物制藥的主要程序⒈目的基因的克隆，基因工程藥物制藥的主要程序12基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒13克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。第三節(jié)目的基因的獲得克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。第三節(jié)14⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導(dǎo)入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定⒈mRNA的純化15二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。用化學(xué)法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以16人工化學(xué)合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。⒊費用高。人工化學(xué)合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA17篩選基因的其他方法1編碼序列富集法2島嶼獲救PCR法3動物雜交法4功能克隆法5構(gòu)建cDNA文庫6差異顯示技術(shù)篩選基因的其他方法1編碼序列富集法18第四節(jié)基因表達基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程中基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。第四節(jié)基因表達基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體19最佳的基因表達體系：目的基因的表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、生物活性高和表達產(chǎn)物容易分離純化。最佳的基因表達體系：目的基因的表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物20一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應(yīng)滿足以下要求:容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；

一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應(yīng)滿足21發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；容易進行代謝調(diào)控；容易進行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；22宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。宿主細胞分為兩大類：23⒈原核細胞⑴大腸桿菌因為大腸桿菌的分子遺傳學(xué)研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。

⒈原核細胞⑴大腸桿菌24表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、細胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達等。大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、25因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表26⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。⑵枯草芽胞桿菌27⑶鏈霉菌作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產(chǎn)物可糖基化。⑶鏈霉菌28⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞29⑵絲狀真菌優(yōu)點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。⑵絲狀真菌30目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法。許多外源基因已獲得成功表達。目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立31二、大腸桿菌中的基因表達載體基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運載到受體細胞內(nèi)，從而復(fù)制擴增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達為相應(yīng)的產(chǎn)物。

二、大腸桿菌中的基因表達載體32基因工程載體分為：克隆載體轉(zhuǎn)錄載體表達載體克隆載體轉(zhuǎn)錄載體表達載體DNADNARNA蛋白質(zhì)

基因工程載體分為：33原核細胞的基因組特點：①染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子②具有操縱子結(jié)構(gòu)③結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝④特定區(qū)域分布特異DNA順序因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA復(fù)制體系的特定區(qū)段原核細胞的基因組特點：34基因工程克隆載體的特點：①具有復(fù)制子②有單一限制內(nèi)切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標(biāo)記如抗藥基因④拷貝數(shù)高⑤生物安全性好基因工程克隆載體的特點：35基因工程制藥課件36目前使用的載體按特性可分為：①質(zhì)粒②λ噬菌體③黏性質(zhì)粒④M13噬菌體⑤酵母⑥真核細胞病毒載體目前使用的載體按特性可分為：37細菌質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的定義：質(zhì)粒是存在于細菌等微生物細胞染色質(zhì)以外的共價閉環(huán)的雙股DNA分子，具有獨立自主復(fù)制和調(diào)控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。細菌質(zhì)粒的生物學(xué)特性38質(zhì)粒的生物學(xué)特性①大小小型質(zhì)粒1.5～15kb,大型質(zhì)粒60～120kb②復(fù)制類型:嚴緊型質(zhì)粒,松弛型質(zhì)粒③拷貝數(shù)④電泳特點⑤不相容性質(zhì)粒的生物學(xué)特性39質(zhì)粒的分類:⒈按復(fù)制型式①嚴緊型②松弛型⒉按基因轉(zhuǎn)移性①傳遞性質(zhì)粒②非傳遞性質(zhì)粒⒊按遺傳性狀產(chǎn)物分類:①抗生素抗性②限制酶修飾酶系統(tǒng)質(zhì)粒的分類:40⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立復(fù)制。載體本身是一個復(fù)制子，具有復(fù)制起點。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：41⑶應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄。⑶應(yīng)具有很強的啟動子，能為42⑸應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。⑸應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄43常用表達載體--質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列常用表達載體--質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)pBV220系統(tǒng)國44pBV220系統(tǒng)優(yōu)點：①cIts857抑制子基因PL啟動子同在一個載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產(chǎn)物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；pBV220系統(tǒng)優(yōu)點：45④整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯(lián)，可以增強啟動作用；④整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插46本系統(tǒng)宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo)，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好；本系統(tǒng)宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C47pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結(jié)合區(qū)基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點，引入剪切融合蛋白具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的48融合表達質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)融合表達質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)49⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和細胞表達產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個細胞產(chǎn)量取決于：⑴外源基因的拷貝數(shù)⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產(chǎn)量與細50⑵外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑵外源基因的表達效率51⑶表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性⑷細胞代謝負荷⑸工程菌的培養(yǎng)條件⑶表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性52⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達；缺點：只能作抗原用。⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式⑴以融合蛋白的形式表達藥53⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。優(yōu)點：保持原有蛋白活性；缺點：易被蛋白酶破壞。⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因54⑶分泌型表達藥物基因優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割。⑶分泌型表達藥物基因55三、酵母中的基因表達⒈載體

酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。三、酵母中的基因表達⒈載體56⑴載體的復(fù)制系列可分四類：①Yep類（yeastepisomalplasmid，

酵母附加體質(zhì)粒）②YRp類（yeastreplicationplasmid，

酵母復(fù)制型質(zhì)粒）③YCp類（yeastcentromericplasmid，

酵母著絲粒質(zhì)粒）④YIp類（yeastintegrativeplasmid，

酵母整合型質(zhì)粒）⑴載體的復(fù)制系列可分四類：57⑵克隆載體⑶表達載體①普通表達載體②精確表達載體⑵克隆載體58⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)⑵外源基因的表達效率①啟動子②分泌信號的效率③終止序列的影響⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)59⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響①菌體生長力強②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱③菌體性能穩(wěn)定④分泌能力強⑶外源蛋白的糖基化60四、動物細胞中的基因表達哺乳動物細胞外源基因表達產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細胞分泌到培養(yǎng)液中，使產(chǎn)物易純化。基因產(chǎn)物糖基化接近天然產(chǎn)物。四、動物細胞中的基因表達哺乳動物細胞外源基因表達產(chǎn)物可由61細胞生長慢，生產(chǎn)率低，條件刻苛，費用高，培養(yǎng)液濃度較小。表達的外源細胞均為傳代細胞表達產(chǎn)物是否致癌尚有疑問。細胞生長慢，生產(chǎn)率低，62

主要基因工程表達體系比較表達體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌主要基因工程表達體系比較表達體系63

第二章

基因工程制藥第二章64一、基因的概念:DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。早期認為遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗證明是DNA。前言：基因工程的基礎(chǔ)知識一、基因的概念:前言：基因工程的基礎(chǔ)知識65二、基因的一般特性：①基因可自我復(fù)制，②基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，③基因可突變。基因按功能分為：①結(jié)構(gòu)基因②調(diào)控基因二、基因的一般特性：66三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能⒈DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（ATCG）連接。DNA二級結(jié)構(gòu)為雙螺旋結(jié)構(gòu)。⒉DNA的性質(zhì)與功能①吸收光譜260②電場中泳動③變性復(fù)性雜交三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能67（一）、DNA的復(fù)制：半保留復(fù)制四DNA的復(fù)制與表達（一）、DNA的復(fù)制：四DNA的復(fù)制與表達68二、基因表達

⒈轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。轉(zhuǎn)錄后加工：剪切：除去內(nèi)含子加帽：5’加m7Gppp加尾：3’加poly（A）二、基因表達⒈轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板69

二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過程。⒈分為三個階段：①起始②延長③終止二、翻譯：以mRNA為模板,tRNA作為運載工具,將活化的70第二章基因工程制藥

1-4節(jié)第二章基因工程制藥

1-4節(jié)7120世紀70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。1982年第一個基因工程產(chǎn)品--人胰島素在美國問世。優(yōu)點:大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴大應(yīng)用、改造不足。第一節(jié)概述20世紀70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域72基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建成工程菌(或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的73基因工程基本過程基因工程基本過程74⒈目的基因的克隆，⒉構(gòu)建DNA重組體，⒊DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌，⒋構(gòu)建工程菌，⒌工程菌發(fā)酵，⒍表達產(chǎn)物的分離純化，⒎產(chǎn)品的檢驗等。基因工程藥物制藥的主要程序⒈目的基因的克隆，基因工程藥物制藥的主要程序75基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝基因工程藥物制藥的主要程序獲得目的基因組建重組質(zhì)粒76克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行cDNA的克隆表達。第三節(jié)目的基因的獲得克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。第三節(jié)77⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導(dǎo)入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定⒈mRNA的純化78二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。用化學(xué)法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以79人工化學(xué)合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。⒉遺傳密碼的簡并使選擇密碼子困難，用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。⒊費用高。人工化學(xué)合成基因的限制⒈不能合成太長的基因。目前DNA80篩選基因的其他方法1編碼序列富集法2島嶼獲救PCR法3動物雜交法4功能克隆法5構(gòu)建cDNA文庫6差異顯示技術(shù)篩選基因的其他方法1編碼序列富集法81第四節(jié)基因表達基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。基因工程中基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。第四節(jié)基因表達基因表達是指結(jié)構(gòu)基因在生物體82最佳的基因表達體系：目的基因的表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、生物活性高和表達產(chǎn)物容易分離純化。最佳的基因表達體系：目的基因的表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物83一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應(yīng)滿足以下要求:容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；

一、宿主細胞的選擇適合目的基因表達的宿主細胞應(yīng)滿足84發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；容易進行代謝調(diào)控；容易進行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)；85宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。宿主細胞分為兩大類：86⒈原核細胞⑴大腸桿菌因為大腸桿菌的分子遺傳學(xué)研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。

⒈原核細胞⑴大腸桿菌87表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、細胞內(nèi)可溶性表達、細胞周質(zhì)表達等。大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。表達基因產(chǎn)物形式多樣:細胞內(nèi)不溶性表達(包含體)、88因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基。其內(nèi)毒素很難除去。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表89⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解。⑵枯草芽胞桿菌90⑶鏈霉菌作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產(chǎn)物可糖基化。⑶鏈霉菌91⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞92⑵絲狀真菌優(yōu)點：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。⑵絲狀真菌93目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導(dǎo)入方法。許多外源基因已獲得成功表達。目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立94二、大腸桿菌中的基因表達載體基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運載到受體細胞內(nèi)，從而復(fù)制擴增大量的目的DNA分子或轉(zhuǎn)錄表達為相應(yīng)的產(chǎn)物。

二、大腸桿菌中的基因表達載體95基因工程載體分為：克隆載體轉(zhuǎn)錄載體表達載體克隆載體轉(zhuǎn)錄載體表達載體DNADNARNA蛋白質(zhì)

基因工程載體分為：96原核細胞的基因組特點：①染色質(zhì)為環(huán)狀雙股DNA分子②具有操縱子結(jié)構(gòu)③結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝④特定區(qū)域分布特異DNA順序因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA復(fù)制體系的特定區(qū)段原核細胞的基因組特點：97基因工程克隆載體的特點：①具有復(fù)制子②有單一限制內(nèi)切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標(biāo)記如抗藥基因④拷貝數(shù)高⑤生物安全性好基因工程克隆載體的特點：98基因工程制藥課件99目前使用的載體按特性可分為：①質(zhì)粒②λ噬菌體③黏性質(zhì)粒④M13噬菌體⑤酵母⑥真核細胞病毒載體目前使用的載體按特性可分為：100細菌質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的定義：質(zhì)粒是存在于細菌等微生物細胞染色質(zhì)以外的共價閉環(huán)的雙股DNA分子，具有獨立自主復(fù)制和調(diào)控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。細菌質(zhì)粒的生物學(xué)特性101質(zhì)粒的生物學(xué)特性①大小小型質(zhì)粒1.5～15kb,大型質(zhì)粒60～120kb②復(fù)制類型:嚴緊型質(zhì)粒,松弛型質(zhì)粒③拷貝數(shù)④電泳特點⑤不相容性質(zhì)粒的生物學(xué)特性102質(zhì)粒的分類:⒈按復(fù)制型式①嚴緊型②松弛型⒉按基因轉(zhuǎn)移性①傳遞性質(zhì)粒②非傳遞性質(zhì)粒⒊按遺傳性狀產(chǎn)物分類:①抗生素抗性②限制酶修飾酶系統(tǒng)質(zhì)粒的分類:103⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立復(fù)制。載體本身是一個復(fù)制子，具有復(fù)制起點。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：104⑶應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄。⑶應(yīng)具有很強的啟動子，能為105⑸應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。⑸應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄106常用表達載體--質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體,其組成:①來源于pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列常用表達載體--質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)pBV220系統(tǒng)國107pBV220系統(tǒng)優(yōu)點：①cIts857抑制子基因PL啟動子同在一個載體上，可以轉(zhuǎn)化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產(chǎn)物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便于插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定；pBV220系統(tǒng)優(yōu)點：108④整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯(lián)，可以增強啟動作用；④整個質(zhì)粒僅為3.66kb，有利于增加其拷貝數(shù)及容量，可以插109本系統(tǒng)宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質(zhì)粒拷貝數(shù)較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo)，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好；本系統(tǒng)宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C110pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達載體。該質(zhì)粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結(jié)合區(qū)基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點，引入剪切融合蛋白具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的111融合表達質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)融合表達質(zhì)粒pBG-2的結(jié)構(gòu)112⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產(chǎn)量與細胞濃度和細胞表達產(chǎn)量呈正相關(guān)。單個細胞產(chǎn)量取決于：⑴外源基因的拷貝數(shù)⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素外源基因表達產(chǎn)量與細113⑵外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑵外源基因的表達效率114⑶表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性⑷細胞代謝負荷⑸工程菌的培養(yǎng)條件⑶表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性115⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達；缺點：只能作抗原用。⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式⑴以融合蛋白的形式表達藥116