張琰華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院基因傳遞系統(tǒng)

張琰基因傳遞系統(tǒng)

1RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNAi）

RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象.它是一種跨越多種種屬的古老的生物途徑,同時(shí)它的出現(xiàn)為生物學(xué)家提供了一種快速、簡(jiǎn)便的反向遺傳學(xué)技術(shù),在后基因組時(shí)代功能基因的研究中具有重要的應(yīng)用前景.2.基因治療RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNA2RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallinterferingRNA),它利用了由小干擾RNA引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進(jìn)化的結(jié)果，是生物體對(duì)病毒基因等外源核酸侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)ｍRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測(cè)定，基因治療等方面開(kāi)辟一條新思路。2.基因治療RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallint3（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等導(dǎo)入了一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子控制的色素基因。結(jié)果許多花瓣顏色并未加深,反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)都被抑制了，Jorgensen把這個(gè)現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。P35S色素基因Ti質(zhì)粒＋色素基因重組轉(zhuǎn)化繁殖美國(guó)科學(xué)家安德魯-費(fèi)里和克拉格-米洛因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象而獲得了2006年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petu41998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)中的研究證明,在正義RNA阻斷基因表達(dá)的試驗(yàn)中,真正起作用的是雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他們將dsRNA注入線蟲(chóng)體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá),并證實(shí)這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,所以又稱(chēng)RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn),21～25nt的dsRNA的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。1998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.5Hammond等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)，證明了這些小分子雙鏈RNA（siRNA）在RNAi中的作用。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila)、錐蟲(chóng)(Trypanosomes)、渦蟲(chóng)(Planaria)、斑馬魚(yú)(Zebrafish)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。Hammond等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)，證明了這些6RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)。Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNASApril25,2000vol.97No.94985–4990RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因7RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機(jī)制可作為真核生物的基因組免疫系統(tǒng),抑制外源和內(nèi)源有害基因的表達(dá)。

★利用RNAi技術(shù)把與病毒基因具同源性的siRNA引入感染細(xì)胞將會(huì)抑制病毒的增殖,這為病毒相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

★利用RNAi技術(shù)抑制過(guò)度表達(dá)的癌基因?qū)?huì)使癌癥表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機(jī)制可作為真核83.基因的傳遞系統(tǒng)

一個(gè)理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的性質(zhì):①攜帶性能

②安全性③緩釋作用能攜帶足夠數(shù)量的目的基因?qū)C(jī)體沒(méi)有毒性、致病性或免疫原性,具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的釋放,延長(zhǎng)基因的表達(dá)時(shí)間,改善基因治療的效果3.基因的傳遞系統(tǒng)

一個(gè)理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的9理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,而且要保護(hù)攜帶的基因免受核酸酶等的破壞

⑤靶向性能

可有效地將目的基因輸送至靶細(xì)胞內(nèi)理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,⑤靶向性能10理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進(jìn)目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進(jìn)入胞漿；⑦可促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)入核；⑧可調(diào)控基因輸入后在體內(nèi)的表達(dá),因?yàn)楸磉_(dá)失控的后果將是非常嚴(yán)重的。理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進(jìn)目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進(jìn)入胞漿；11傳遞系統(tǒng)在已進(jìn)行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)占首位,共計(jì)150多個(gè)治療方案,病例數(shù)達(dá)1200多人；脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)位于第二,治療方案70多個(gè),病例數(shù)達(dá)700多人;腺病毒傳遞系統(tǒng)位于第三,治療方案約70個(gè),病例數(shù)達(dá)400多人;排在后面的基因傳遞系統(tǒng)依次是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞、Pox病毒、DNA載體和腺相關(guān)病毒。傳遞系統(tǒng)在已進(jìn)行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳12(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)

病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)病毒載體(viralvector),是野生型病毒經(jīng)改造除去致病性后得到的基因輸送系統(tǒng)其主要特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染相對(duì)高效,但安全性較差。(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)病毒載體13基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。

常用的載體有兩類(lèi)：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。基因載體的選擇基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)14

治療基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法

化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）

15(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)非病毒載體(non-viralvector),可以克服病毒載體的很多缺陷,己越來(lái)越引起科學(xué)家的重視。目前已進(jìn)入臨床研究的主要是陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA載體。非病毒基因傳遞系統(tǒng)的主要特點(diǎn)是安全性好,但轉(zhuǎn)染相對(duì)低效。(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也16

非病毒載體系統(tǒng)實(shí)際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視為藥物，將其運(yùn)送到特定的細(xì)胞或組織器官。

非病毒載體系統(tǒng)實(shí)際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視17(1)DNA載體

DNA載體又稱(chēng)質(zhì)粒DNA(plasmidDNA)或裸DNA(nakedDNA),可能是最簡(jiǎn)單的非病毒傳遞系統(tǒng)。用于基因治療的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品與一般的藥品很類(lèi)似,需要有一定的劑型和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。純化質(zhì)粒DNA的安全性較好,不會(huì)引起炎癥反應(yīng)等,適用面也較廣,劑量可以因人而異。(1)DNA載體

DNA載體又稱(chēng)質(zhì)粒DNA18

DNA載體

裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝的質(zhì)粒載體，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的非病毒載體。由于在體內(nèi)易被降解破壞（缺乏保護(hù)性外包裝）又無(wú)靶向性（缺乏可被靶細(xì)胞識(shí)別的成分），故多采用直接注射或基因槍等物理方法直接導(dǎo)入靶組織或靶器官,如皮膚、骨骼肌、心肌或腫瘤等。利用本法將編碼抗原的基因?qū)肫は拢杉ぐl(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，被稱(chēng)為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種較有前途的免疫方法。DNA載體裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝19DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細(xì)胞中的表達(dá)效率較低,持續(xù)時(shí)間較短,因此需要的劑量比較大。一般在一個(gè)療程的治療中需要毫克數(shù)量級(jí)的質(zhì)粒DNA如何進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細(xì)胞中的表達(dá)效率較低,持續(xù)20

脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。

(2)脂質(zhì)體載體

(2)脂質(zhì)體載體

21(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行基因輸送的研究已有20多年,這是因?yàn)橹|(zhì)體可促進(jìn)大分子物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的穿透。陽(yáng)離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體

pH敏感型脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體

(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行基因輸送的研22脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖23(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationicliposomes)是基因治療中應(yīng)用最多的非病毒傳遞系統(tǒng)一般由帶正電荷的脂類(lèi)與中性脂類(lèi)按一定的摩爾比組成。(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationiclipo24(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體用于制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的陽(yáng)離子脂類(lèi)大多是合成的雙鏈季銨鹽型兩性分子主要作用就是提供正電荷，增加與DNA的縮合一般化學(xué)穩(wěn)定性較好,可以生物降解,但均有一定的細(xì)胞毒性。

(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體用于制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的陽(yáng)離子脂類(lèi)大多是合成25(b)中性脂質(zhì)體中性脂類(lèi)的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽(yáng)離子脂質(zhì)的毒性、特別是促進(jìn)脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的滲透。膽固醇(Chol)磷酯酰膽堿(PC)磷酯酰乙醇胺(PE)二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(b)中性脂質(zhì)體中性脂類(lèi)的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽(yáng)離子脂26高分子藥物載體課件27陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑

內(nèi)吞小泡的大小約在80～200nm之間,因此內(nèi)吞作用是一個(gè)體積限制性步驟,這就要求所制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體大小適宜,而且復(fù)合物也應(yīng)足夠小,或者說(shuō)縮合應(yīng)比較完全；陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑28

由于復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程,控制起來(lái)有一定難度,而且復(fù)合物還可能進(jìn)一步聚集,因此一般是將脂質(zhì)體和DNA分別包裝,臨用時(shí)再進(jìn)行混合。

1.粒徑1.粒徑29

陽(yáng)離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性是一個(gè)重要的問(wèn)題,陽(yáng)離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中會(huì)帶上負(fù)電荷,而且容易發(fā)生聚集或破裂,釋放出DNA。用聚乙二醇等進(jìn)行修飾可在一定程度上降低復(fù)合物與血液成份的相互作用。2.穩(wěn)定性2.穩(wěn)定性301.具有多個(gè)正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA作用更牢、縮合較好有關(guān)；2.二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）

具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜去穩(wěn)定化作用,可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率,隨著DOPE比例增加,轉(zhuǎn)染效率隨之提高,但脂質(zhì)體在血中的穩(wěn)定性也會(huì)下降。1.具有多個(gè)正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA31(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anionicliposomes)所用的陰離子脂質(zhì)包括磷酯酰絲氨酸、心肌磷脂和二棕櫚磷脂酰甘油等。由于載體與DNA都帶負(fù)電,為了提高包封效率常需在制備脂質(zhì)體時(shí)加入鈣。陰離子脂質(zhì)體的特點(diǎn)是可將低聚核苷酸定位于細(xì)胞核,而且可延長(zhǎng)低聚核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間。對(duì)陰離子脂質(zhì)體的研究還比較少。(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anioniclipo32(d)pH敏感型脂質(zhì)體

PH敏感脂質(zhì)體(pH-sensitiveliposomes)是一種具有細(xì)胞內(nèi)靶向和控制藥物(如基因、肽、蛋白質(zhì))釋放的功能性脂質(zhì)體。

(d)pH敏感型脂質(zhì)體PH敏感脂質(zhì)體(pH-sen33pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機(jī)制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進(jìn)入溶酶體之前，pH從7.4減至5.3～6.3左右時(shí)，可導(dǎo)致脂肪酯羧基的質(zhì)子化，而引起六角晶相的形成，2.pH敏感脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，3.將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞漿及主動(dòng)靶向病變組織，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。

pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機(jī)制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成34(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時(shí)加入融合劑而獲得。常用融合劑包括PEG、甘油、PVA、以及重組病毒的細(xì)胞膜或某些病毒蛋白。DOPE也具有融合劑的性質(zhì),主要用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備。目前應(yīng)用還比較少。(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時(shí)加入融合劑而獲353.陽(yáng)離子聚合物

陽(yáng)離子聚合物(cationicpolymer)與DNA可以在電荷作用下發(fā)生縮合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物,防止DNA的降解,其大小可在100nm以下,表面帶正電,有利于與靶細(xì)胞的吸附。這類(lèi)載體的安全性較好,容易制備,不足之處是缺乏靶向性,而且單獨(dú)應(yīng)用時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較低。3.陽(yáng)離子聚合物

陽(yáng)離子聚合物(cationic363.陽(yáng)離子聚合物可選擇的陽(yáng)離子聚合物聚氨基化合物聚氨基酸星狀樹(shù)突體3.陽(yáng)離子聚合物可選擇的陽(yáng)離子聚合物聚氨基化合物37陽(yáng)離子聚合物基因載體陽(yáng)離子聚合物基因載體38聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽(yáng)離子聚合物具有高度分枝的結(jié)構(gòu),內(nèi)部的氨基與末端的氨基可在不同的pH下離子化,有較強(qiáng)的緩沖性能聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽(yáng)離子聚合物39PEIPEI有較強(qiáng)的緩沖性能：一方面：有利于DNA的穩(wěn)定性；另一方面：PEI在酸性條件下構(gòu)象改變可促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中的釋放PEIPEI有較強(qiáng)的緩沖性能：40乳糖化肝細(xì)胞乳糖化肝細(xì)胞41星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體(starburstdendrimers)的核心分子至少有三個(gè)具化學(xué)活性的側(cè)鏈,在這些化學(xué)活性部位與其他同樣的分子聚合,如此反復(fù),產(chǎn)生一個(gè)類(lèi)似球型的分枝狀聚合物。典型的星狀樹(shù)突體是聚氨基酰胺(polyamidoamine)。星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體(starburstdendrime42星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體的聚合過(guò)程是可以控制的,因此可以獲得不同粒度大小的產(chǎn)物。這類(lèi)載體用于體外實(shí)驗(yàn)已很成功目前正在研制可生物降解的,或者可形成圓筒狀的星狀樹(shù)突體。由于具有分枝結(jié)構(gòu),星狀樹(shù)突體也具緩沖性能,可促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中釋放。星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體的聚合過(guò)程是可以控制的,因此可以獲43聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚氨基酸幾乎只有聚賴(lài)氨酸在20世紀(jì)60年代就已有文獻(xiàn)報(bào)道。聚氨基酸/DNA復(fù)合物缺乏靶向性,而且由于是線性的結(jié)構(gòu),不能促進(jìn)復(fù)合物從內(nèi)吞小泡中釋放DNA,因此往往需要進(jìn)行一些修飾以改善其性能。聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚44修飾的聚賴(lài)氨酸基因載體修飾的聚賴(lài)氨酸基因載體454.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具備的很多重要性質(zhì),特別是安全性、穩(wěn)定性和緩釋作用明顯。進(jìn)行適當(dāng)修飾后可提高其靶向性和轉(zhuǎn)染效率。目前應(yīng)用較多的制備納米粒的材料有明膠、殼聚糖等。4.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具465.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化

可以說(shuō)到目前為止,所有的非病毒基因輸送系統(tǒng)都并不十分理想,總有一些不足之處,需要進(jìn)行優(yōu)化與完善。1.在提高靶向性方面,常用的方法是受體介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)的方法5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化可以說(shuō)到目前為止,所有的非47受體介導(dǎo)的基因載體運(yùn)輸受體介導(dǎo)的基因載體運(yùn)輸485.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中釋放3.促進(jìn)DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)入核4.載體輸送系統(tǒng)中基因的表達(dá)5.安全性6.各種載體與各種修飾方法進(jìn)行組合5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中49非病毒載體的一些進(jìn)展基因縫線將裸DNA直接涂粘或通過(guò)大分子多聚物偶聯(lián)到手術(shù)縫合線上，進(jìn)行血管、肌肉和組織的縫合而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；基因球囊和基因支架用大分子多聚物將基因載體黏附于球囊導(dǎo)管或支架表面的方法完成對(duì)心血管系統(tǒng)內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移；非病毒載體的一些進(jìn)展基因縫線50基因針

應(yīng)用魚(yú)精蛋白將基因載體黏附在針灸針上，刺入肌肉組織內(nèi)并施加短暫的高壓脈沖電刺激，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)暫時(shí)性松動(dòng)，產(chǎn)生納米級(jí)小孔洞，可實(shí)現(xiàn)局部組織的高效基因轉(zhuǎn)移。這些方法使血管或骨骼肌的局部性基因轉(zhuǎn)移更為有效而方便。

基因針51纖維蛋白凝固－溶解將基因載體與可溶性纖維蛋白原混合成復(fù)合液，從體外注射至血管周?chē)谀负徒M織凝血因子作用下，可溶性的纖維蛋白原和基因載體的復(fù)合物被轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘膹?fù)合物，黏附在血管周?chē)?-14天后在內(nèi)源性纖溶酶的作用下，纖維蛋白自行溶解，從而實(shí)現(xiàn)血管外膜的基因轉(zhuǎn)移。纖維蛋白凝固－溶解52溫度敏感性多聚物

可通過(guò)使多聚物膨脹縮小的溫度變化來(lái)控制DNA的釋放，如生物可降解的PEG–poly(D,L-lacticacid-co-glycolicacid)(PLGA)為非離子親水三聯(lián)多聚物，呈溫度依賴(lài)性溶液-凝膠態(tài)轉(zhuǎn)換。在室溫（4-20℃）為液狀，而在體溫（>30℃）則轉(zhuǎn)換成凝膠狀。因而在體外易于與質(zhì)粒DNA形成多聚物溶液，而進(jìn)入體內(nèi)后即在注射部位轉(zhuǎn)換成水凝膠，緩慢釋放質(zhì)粒DNA，從而延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間溫度敏感性多聚物53

世界上第一個(gè)正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國(guó)Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗(yàn)。

54（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類(lèi)有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見(jiàn)遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)。可供選擇并符合上述4條以上要求的不過(guò)只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：（一）遺傳病的基因治療研究已知人類(lèi)有4000多種551．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病1．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶56（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；

腫瘤發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，許多基因的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過(guò)干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過(guò)導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞。（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入57

1.腫瘤基因治療的基本策略

從實(shí)際應(yīng)用于臨床治療的角度來(lái)看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。(2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。1.腫瘤基因治療的基本策略58

2.腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：通過(guò)基因干預(yù)，使得腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細(xì)胞。

?腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。

?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

2.腫瘤基因治療的常用方法59

3.自殺基因治療

基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱(chēng)為“自殺基因”。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一3.自殺基因治療基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真60

自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤614.腫瘤的免疫基因治療

激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細(xì)胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類(lèi)。4.腫瘤的免疫基因治療625.提高化療效果的輔助基因治療

臨床上對(duì)腫瘤患者進(jìn)行化療時(shí)，通常面臨兩大難題：（1）是患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過(guò)多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導(dǎo)致化療失敗。（2）是大劑量的化療可能導(dǎo)致患者的正常細(xì)胞，特別是骨髓造血細(xì)胞的功能受到抑制。

5.提高化療效果的輔助基因治療臨床上對(duì)腫瘤患者進(jìn)行化63

(1)藥物增敏基因治療

將雞鈣調(diào)素（calmodulin,CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘?xì)胞株C127，結(jié)果僅需低劑量的長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春花堿即可明顯抑制該細(xì)胞株的生長(zhǎng)。對(duì)其作用原理進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，CaM基因的表達(dá)產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春花堿的吸收量而相應(yīng)減少了排出量，從而提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細(xì)胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，特別是對(duì)化療藥物原本不敏感的腫瘤細(xì)胞，使其對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達(dá)到增強(qiáng)化療效果的目的。

(1)藥物增敏基因治療將雞鈣調(diào)素（calmod64(2)耐藥基因治療

在解決化療所致骨髓細(xì)胞造血功能受到嚴(yán)重抑制的問(wèn)題方面，通過(guò)向腫瘤患者的骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。

目前除了開(kāi)發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的拮抗劑，如用于阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成的丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。還采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞喪失多藥耐藥性，從而易于被化療藥物殺死。

(2)耐藥基因治療在解決化療所致骨髓細(xì)胞造血功能65（三）病毒性疾病的基因治療研究

據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%的人類(lèi)傳染病是由病毒引起的。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，造成終身傷害。病毒還是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的聯(lián)系。迄今為止，臨床上對(duì)絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，而在眾多開(kāi)展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。（三）病毒性疾病的基因治療研究據(jù)統(tǒng)計(jì)，75%的人661．調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答

（1）將細(xì)胞因子(如干擾素、白細(xì)胞介素等)的基因，導(dǎo)入機(jī)體免疫細(xì)胞，激活免疫細(xì)胞并促進(jìn)其增殖分化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體清除病毒感染細(xì)胞和游離病毒。（2）將能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，導(dǎo)入機(jī)體，表達(dá)的抗原不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，還可以引發(fā)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生對(duì)野生致病病毒攻擊的防御作用。1．調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答（1）將細(xì)胞因子(如干擾素、白細(xì)胞介672．抗病毒復(fù)制：（1）抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合：即阻斷病毒表面抗原決定簇與宿主細(xì)胞受體間的特異性結(jié)合。

（2）干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控。

（3）抑制病毒基因組的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。

（4）RNA干擾技術(shù)。

（5）將抗病毒蛋白質(zhì)基因，如2ˊ→5ˊ腺苷酸合成酶等基因，導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞并持續(xù)表達(dá)，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA，對(duì)RNA病毒的感染產(chǎn)生明顯的抵抗作用。根據(jù)病毒在機(jī)體細(xì)胞中復(fù)制周期的各個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)設(shè)計(jì)的，主要包括：2．抗病毒復(fù)制：（1）抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合：即阻斷病毒68

基因治療的問(wèn)題與展望

治療基因調(diào)控元件的選擇；安全高效載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移技術(shù)的選擇；靶細(xì)胞的選擇。基因治療的問(wèn)題與展望69華東理工大學(xué)2010—2011學(xué)年第1學(xué)期《高分子藥物載體》課程論文2010.10班級(jí)

學(xué)號(hào)

姓名

開(kāi)課學(xué)院材料學(xué)院任課教師張琰成績(jī)

論文題目：綜述納米技術(shù)在高分子藥物載體系統(tǒng)構(gòu)建中的應(yīng)用；綜述高分子材料在基因藥物載體系統(tǒng)中的研究進(jìn)展；(3)綜述抗腫瘤藥物載體系統(tǒng)的研究進(jìn)展論文要求：任選一題，根據(jù)論文題目，通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料，內(nèi)容能夠反映教師要求，舉例恰當(dāng)，論文格式符合規(guī)范（參見(jiàn)華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)）。2000字左右。包括中文摘要、關(guān)鍵詞、正文和參考文獻(xiàn)。不可以整篇抄襲，如果抄襲，論文以零分計(jì)。教師評(píng)語(yǔ)：評(píng)分項(xiàng)目各項(xiàng)分值得分內(nèi)容與要求的吻合情況（5）摘要（10）關(guān)鍵詞（5）綜述內(nèi)容（50）正文組織結(jié)構(gòu)（15）參考文獻(xiàn)及標(biāo)注（15）教師簽名2010年月日華東理工大學(xué)2010—2011學(xué)年第1學(xué)期論文要求：教師評(píng)語(yǔ)70論文提交郵箱：macromoleculezy@163.com論文提交截止時(shí)間：2010年11月30日論文提交郵箱：71

張琰華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院基因傳遞系統(tǒng)

張琰基因傳遞系統(tǒng)

72RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNAi）

RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象.它是一種跨越多種種屬的古老的生物途徑,同時(shí)它的出現(xiàn)為生物學(xué)家提供了一種快速、簡(jiǎn)便的反向遺傳學(xué)技術(shù),在后基因組時(shí)代功能基因的研究中具有重要的應(yīng)用前景.2.基因治療RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNA73RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallinterferingRNA),它利用了由小干擾RNA引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進(jìn)化的結(jié)果，是生物體對(duì)病毒基因等外源核酸侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)ｍRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測(cè)定，基因治療等方面開(kāi)辟一條新思路。2.基因治療RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallint74（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等導(dǎo)入了一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子控制的色素基因。結(jié)果許多花瓣顏色并未加深,反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達(dá)都被抑制了，Jorgensen把這個(gè)現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。P35S色素基因Ti質(zhì)粒＋色素基因重組轉(zhuǎn)化繁殖美國(guó)科學(xué)家安德魯-費(fèi)里和克拉格-米洛因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象而獲得了2006年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petu751998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)中的研究證明,在正義RNA阻斷基因表達(dá)的試驗(yàn)中,真正起作用的是雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他們將dsRNA注入線蟲(chóng)體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá),并證實(shí)這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,所以又稱(chēng)RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn),21～25nt的dsRNA的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。1998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.76Hammond等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)，證明了這些小分子雙鏈RNA（siRNA）在RNAi中的作用。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila)、錐蟲(chóng)(Trypanosomes)、渦蟲(chóng)(Planaria)、斑馬魚(yú)(Zebrafish)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。Hammond等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)，證明了這些77RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)。Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNASApril25,2000vol.97No.94985–4990RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因78RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機(jī)制可作為真核生物的基因組免疫系統(tǒng),抑制外源和內(nèi)源有害基因的表達(dá)。

★利用RNAi技術(shù)把與病毒基因具同源性的siRNA引入感染細(xì)胞將會(huì)抑制病毒的增殖,這為病毒相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

★利用RNAi技術(shù)抑制過(guò)度表達(dá)的癌基因?qū)?huì)使癌癥表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機(jī)制可作為真核793.基因的傳遞系統(tǒng)

一個(gè)理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的性質(zhì):①攜帶性能

②安全性③緩釋作用能攜帶足夠數(shù)量的目的基因?qū)C(jī)體沒(méi)有毒性、致病性或免疫原性,具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的釋放,延長(zhǎng)基因的表達(dá)時(shí)間,改善基因治療的效果3.基因的傳遞系統(tǒng)

一個(gè)理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的80理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,而且要保護(hù)攜帶的基因免受核酸酶等的破壞

⑤靶向性能

可有效地將目的基因輸送至靶細(xì)胞內(nèi)理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,⑤靶向性能81理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進(jìn)目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進(jìn)入胞漿；⑦可促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)入核；⑧可調(diào)控基因輸入后在體內(nèi)的表達(dá),因?yàn)楸磉_(dá)失控的后果將是非常嚴(yán)重的。理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進(jìn)目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進(jìn)入胞漿；82傳遞系統(tǒng)在已進(jìn)行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)占首位,共計(jì)150多個(gè)治療方案,病例數(shù)達(dá)1200多人；脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)位于第二,治療方案70多個(gè),病例數(shù)達(dá)700多人;腺病毒傳遞系統(tǒng)位于第三,治療方案約70個(gè),病例數(shù)達(dá)400多人;排在后面的基因傳遞系統(tǒng)依次是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞、Pox病毒、DNA載體和腺相關(guān)病毒。傳遞系統(tǒng)在已進(jìn)行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳83(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)

病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)病毒載體(viralvector),是野生型病毒經(jīng)改造除去致病性后得到的基因輸送系統(tǒng)其主要特點(diǎn)是轉(zhuǎn)染相對(duì)高效,但安全性較差。(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)病毒載體84基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。

常用的載體有兩類(lèi)：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。基因載體的選擇基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)85

治療基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法

化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）

86(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱(chēng)非病毒載體(non-viralvector),可以克服病毒載體的很多缺陷,己越來(lái)越引起科學(xué)家的重視。目前已進(jìn)入臨床研究的主要是陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA載體。非病毒基因傳遞系統(tǒng)的主要特點(diǎn)是安全性好,但轉(zhuǎn)染相對(duì)低效。(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也87

非病毒載體系統(tǒng)實(shí)際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視為藥物，將其運(yùn)送到特定的細(xì)胞或組織器官。

非病毒載體系統(tǒng)實(shí)際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視88(1)DNA載體

DNA載體又稱(chēng)質(zhì)粒DNA(plasmidDNA)或裸DNA(nakedDNA),可能是最簡(jiǎn)單的非病毒傳遞系統(tǒng)。用于基因治療的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品與一般的藥品很類(lèi)似,需要有一定的劑型和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。純化質(zhì)粒DNA的安全性較好,不會(huì)引起炎癥反應(yīng)等,適用面也較廣,劑量可以因人而異。(1)DNA載體

DNA載體又稱(chēng)質(zhì)粒DNA89

DNA載體

裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝的質(zhì)粒載體，是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的非病毒載體。由于在體內(nèi)易被降解破壞（缺乏保護(hù)性外包裝）又無(wú)靶向性（缺乏可被靶細(xì)胞識(shí)別的成分），故多采用直接注射或基因槍等物理方法直接導(dǎo)入靶組織或靶器官,如皮膚、骨骼肌、心肌或腫瘤等。利用本法將編碼抗原的基因?qū)肫は拢杉ぐl(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，被稱(chēng)為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種較有前途的免疫方法。DNA載體裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝90DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細(xì)胞中的表達(dá)效率較低,持續(xù)時(shí)間較短,因此需要的劑量比較大。一般在一個(gè)療程的治療中需要毫克數(shù)量級(jí)的質(zhì)粒DNA如何進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細(xì)胞中的表達(dá)效率較低,持續(xù)91

脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。

(2)脂質(zhì)體載體

(2)脂質(zhì)體載體

92(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行基因輸送的研究已有20多年,這是因?yàn)橹|(zhì)體可促進(jìn)大分子物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜的穿透。陽(yáng)離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體

pH敏感型脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體

(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行基因輸送的研93脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖94(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationicliposomes)是基因治療中應(yīng)用最多的非病毒傳遞系統(tǒng)一般由帶正電荷的脂類(lèi)與中性脂類(lèi)按一定的摩爾比組成。(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationiclipo95(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體用于制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的陽(yáng)離子脂類(lèi)大多是合成的雙鏈季銨鹽型兩性分子主要作用就是提供正電荷，增加與DNA的縮合一般化學(xué)穩(wěn)定性較好,可以生物降解,但均有一定的細(xì)胞毒性。

(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體用于制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的陽(yáng)離子脂類(lèi)大多是合成96(b)中性脂質(zhì)體中性脂類(lèi)的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽(yáng)離子脂質(zhì)的毒性、特別是促進(jìn)脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的滲透。膽固醇(Chol)磷酯酰膽堿(PC)磷酯酰乙醇胺(PE)二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(b)中性脂質(zhì)體中性脂類(lèi)的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽(yáng)離子脂97高分子藥物載體課件98陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑

內(nèi)吞小泡的大小約在80～200nm之間,因此內(nèi)吞作用是一個(gè)體積限制性步驟,這就要求所制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體大小適宜,而且復(fù)合物也應(yīng)足夠小,或者說(shuō)縮合應(yīng)比較完全；陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑99

由于復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程,控制起來(lái)有一定難度,而且復(fù)合物還可能進(jìn)一步聚集,因此一般是將脂質(zhì)體和DNA分別包裝,臨用時(shí)再進(jìn)行混合。

1.粒徑1.粒徑100

陽(yáng)離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性是一個(gè)重要的問(wèn)題,陽(yáng)離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中會(huì)帶上負(fù)電荷,而且容易發(fā)生聚集或破裂,釋放出DNA。用聚乙二醇等進(jìn)行修飾可在一定程度上降低復(fù)合物與血液成份的相互作用。2.穩(wěn)定性2.穩(wěn)定性1011.具有多個(gè)正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA作用更牢、縮合較好有關(guān)；2.二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）

具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜去穩(wěn)定化作用,可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率,隨著DOPE比例增加,轉(zhuǎn)染效率隨之提高,但脂質(zhì)體在血中的穩(wěn)定性也會(huì)下降。1.具有多個(gè)正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA102(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anionicliposomes)所用的陰離子脂質(zhì)包括磷酯酰絲氨酸、心肌磷脂和二棕櫚磷脂酰甘油等。由于載體與DNA都帶負(fù)電,為了提高包封效率常需在制備脂質(zhì)體時(shí)加入鈣。陰離子脂質(zhì)體的特點(diǎn)是可將低聚核苷酸定位于細(xì)胞核,而且可延長(zhǎng)低聚核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間。對(duì)陰離子脂質(zhì)體的研究還比較少。(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anioniclipo103(d)pH敏感型脂質(zhì)體

PH敏感脂質(zhì)體(pH-sensitiveliposomes)是一種具有細(xì)胞內(nèi)靶向和控制藥物(如基因、肽、蛋白質(zhì))釋放的功能性脂質(zhì)體。

(d)pH敏感型脂質(zhì)體PH敏感脂質(zhì)體(pH-sen104pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機(jī)制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進(jìn)入溶酶體之前，pH從7.4減至5.3～6.3左右時(shí)，可導(dǎo)致脂肪酯羧基的質(zhì)子化，而引起六角晶相的形成，2.pH敏感脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，3.將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞漿及主動(dòng)靶向病變組織，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。

pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機(jī)制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成105(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時(shí)加入融合劑而獲得。常用融合劑包括PEG、甘油、PVA、以及重組病毒的細(xì)胞膜或某些病毒蛋白。DOPE也具有融合劑的性質(zhì),主要用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備。目前應(yīng)用還比較少。(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時(shí)加入融合劑而獲1063.陽(yáng)離子聚合物

陽(yáng)離子聚合物(cationicpolymer)與DNA可以在電荷作用下發(fā)生縮合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物,防止DNA的降解,其大小可在100nm以下,表面帶正電,有利于與靶細(xì)胞的吸附。這類(lèi)載體的安全性較好,容易制備,不足之處是缺乏靶向性,而且單獨(dú)應(yīng)用時(shí)轉(zhuǎn)染效率比較低。3.陽(yáng)離子聚合物

陽(yáng)離子聚合物(cationic1073.陽(yáng)離子聚合物可選擇的陽(yáng)離子聚合物聚氨基化合物聚氨基酸星狀樹(shù)突體3.陽(yáng)離子聚合物可選擇的陽(yáng)離子聚合物聚氨基化合物108陽(yáng)離子聚合物基因載體陽(yáng)離子聚合物基因載體109聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽(yáng)離子聚合物具有高度分枝的結(jié)構(gòu),內(nèi)部的氨基與末端的氨基可在不同的pH下離子化,有較強(qiáng)的緩沖性能聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽(yáng)離子聚合物110PEIPEI有較強(qiáng)的緩沖性能：一方面：有利于DNA的穩(wěn)定性；另一方面：PEI在酸性條件下構(gòu)象改變可促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中的釋放PEIPEI有較強(qiáng)的緩沖性能：111乳糖化肝細(xì)胞乳糖化肝細(xì)胞112星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體(starburstdendrimers)的核心分子至少有三個(gè)具化學(xué)活性的側(cè)鏈,在這些化學(xué)活性部位與其他同樣的分子聚合,如此反復(fù),產(chǎn)生一個(gè)類(lèi)似球型的分枝狀聚合物。典型的星狀樹(shù)突體是聚氨基酰胺(polyamidoamine)。星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體(starburstdendrime113星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體的聚合過(guò)程是可以控制的,因此可以獲得不同粒度大小的產(chǎn)物。這類(lèi)載體用于體外實(shí)驗(yàn)已很成功目前正在研制可生物降解的,或者可形成圓筒狀的星狀樹(shù)突體。由于具有分枝結(jié)構(gòu),星狀樹(shù)突體也具緩沖性能,可促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中釋放。星狀樹(shù)突體星狀樹(shù)突體的聚合過(guò)程是可以控制的,因此可以獲114聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚氨基酸幾乎只有聚賴(lài)氨酸在20世紀(jì)60年代就已有文獻(xiàn)報(bào)道。聚氨基酸/DNA復(fù)合物缺乏靶向性,而且由于是線性的結(jié)構(gòu),不能促進(jìn)復(fù)合物從內(nèi)吞小泡中釋放DNA,因此往往需要進(jìn)行一些修飾以改善其性能。聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚115修飾的聚賴(lài)氨酸基因載體修飾的聚賴(lài)氨酸基因載體1164.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具備的很多重要性質(zhì),特別是安全性、穩(wěn)定性和緩釋作用明顯。進(jìn)行適當(dāng)修飾后可提高其靶向性和轉(zhuǎn)染效率。目前應(yīng)用較多的制備納米粒的材料有明膠、殼聚糖等。4.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具1175.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化

可以說(shuō)到目前為止,所有的非病毒基因輸送系統(tǒng)都并不十分理想,總有一些不足之處,需要進(jìn)行優(yōu)化與完善。1.在提高靶向性方面,常用的方法是受體介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)的方法5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化可以說(shuō)到目前為止,所有的非118受體介導(dǎo)的基因載體運(yùn)輸受體介導(dǎo)的基因載體運(yùn)輸1195.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中釋放3.促進(jìn)DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)入核4.載體輸送系統(tǒng)中基因的表達(dá)5.安全性6.各種載體與各種修飾方法進(jìn)行組合5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進(jìn)DNA從內(nèi)吞小泡中120非病毒載體的一些進(jìn)展基因縫線將裸DNA直接涂粘或通過(guò)大分子多聚物偶聯(lián)到手術(shù)縫合線上，進(jìn)行血管、肌肉和組織的縫合而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；基因球囊和基因支架用大分子多聚物將基因載體黏附于球囊導(dǎo)管或支架表面的方法完成對(duì)心血管系統(tǒng)內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移；非病毒載體的一些進(jìn)展基因縫線121基因針

應(yīng)用魚(yú)精蛋白將基因載體黏附在針灸針上，刺入肌肉組織內(nèi)并施加短暫的高壓脈沖電刺激，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)暫時(shí)性松動(dòng)，產(chǎn)生納米級(jí)小孔洞，可實(shí)現(xiàn)局部組織的高效基因轉(zhuǎn)移。這些方法使血管或骨骼肌的局部性基因轉(zhuǎn)移更為有效而方便。

基因針122纖維蛋白凝固－溶解將基因載體與可溶性纖維蛋白原混合成復(fù)合液，從體外注射至血管周?chē)谀负徒M織凝血因子作用下，可溶性的纖維蛋白原和基因載體的復(fù)合物被轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘膹?fù)合物，黏附在血管周?chē)?-14天后在內(nèi)源性纖溶酶的作用下，纖維蛋白自行溶解，從而實(shí)現(xiàn)血管外膜的基因轉(zhuǎn)移。纖維蛋白凝固－溶解123溫度敏感性多聚物

可通過(guò)使多聚物膨脹縮小的溫度變化來(lái)控制DNA的釋放，如生物可降解的PEG–poly(D,L-lacticacid-co-glycolicacid)(PLGA)為非離子親水三聯(lián)多聚物，呈溫度依賴(lài)性溶液-凝膠態(tài)轉(zhuǎn)換。在室溫（4-20℃）為液狀，而在體溫（>30℃）則轉(zhuǎn)換成凝膠狀。因而在體外易于與質(zhì)粒DNA形成多聚物溶液，而進(jìn)入體內(nèi)后即在注射部位轉(zhuǎn)換成水凝膠，緩慢釋放質(zhì)粒DNA，從而延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間溫度敏感性多聚物124

世界上第一個(gè)正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國(guó)Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗(yàn)。

125（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類(lèi)有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見(jiàn)遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)。可供選擇并符合上述4條以上要求的不過(guò)只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：（一）遺傳病的基因治療研究已知人類(lèi)有4000多種1261．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病1．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶127（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；

腫瘤發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，許多基因的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過(guò)干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過(guò)導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞。（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入128

1.腫瘤基因治療的基本策略

從實(shí)際應(yīng)用于臨床治療的角度來(lái)看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。(2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。1.腫瘤基因治療的基本策略129

2.腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：通過(guò)基因干預(yù)，使得腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細(xì)胞。

?腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能。

?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

2.腫瘤基因治療的常用方法130

3.自殺基因治療

基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱(chēng)為“自殺基因”。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一3.自殺基因治療基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真131

自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤1324.腫瘤的免疫基因治療

激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細(xì)胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類(lèi)。4.腫瘤的免疫基因治療1335.提高化療效果的輔助基因治療

臨床上對(duì)腫瘤患者進(jìn)行化療時(shí)，通常面臨兩大難題：（1）是患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感程度存