生物工程下游技術復習講義PAGEPAGE17第一章緒論★什么是生物工程的下游技術？生物工程的下游技術：一般泛指從工程菌或工程細胞的大規模培養一直到產品的分離純化、質量檢測所需要的一系列單元操作技術。其中，產品的分離純化是其最重要的組成部分。生物工程下游技術的發展歷程？1.古代釀造業生物技術產業的歷史可追溯到古代的釀造業，它包括釀酒、制醬（油）、醋、酸奶和干酪等。2.第一代生物技術主要指19世紀60年代到20世紀40年代青霉素等抗生素出現之前的生物技術產業。這一時期，發現了發酵的本質是微生物的作用，掌握了純種培養技術，生物技術進入近代釀造產業的發展階段。此時開始引入化學工程中成熟的近代分離技術，如過濾、蒸餾、精餾等。3.第二代生物技術以20世紀40年代出現的青霉素產品為代表。產品品種、類型迅速增加，不僅有初級代謝產物，也有次級代謝產物；不僅有小分子的物質，也有具生命活性的大分子物質，有些產品的分子結構相當復雜。4.第三代生物技術一般認為以20世紀70年代末掘起的DNA重組技術及細胞融合技術為代表。此時，生物技術在其主要領域：基因工程、酶工程、細胞工程和微生物發酵工程取得了長足進步，一批對人類十分有益的高附加值的產品開始面世，如乙肝疫苗、干擾素等。★3．細胞破碎技術？初步分離純化技術？高度分離純化技術？細胞破碎是工業化生產胞內物質所必需的技術，已經開發出球磨破碎、壓力釋放破碎、冷凍加壓釋放破碎和化學破碎等技術。主要開發了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術。較早出現的是酶及蛋白質的鹽析法；有機溶劑沉淀法；雙水相萃取技術比較適合于胞內活性物質和細胞碎片的分離，為進一步純化精制創造了前提；超濾技術解決了生物大分子對pH、熱、有機溶劑、金屬離子敏感等難題，在生物大分子的分級、濃縮、脫鹽等操作中得到了廣泛的使用。小分子物質一般可通過離子交換、脫色和結晶、重結晶等方法獲得純度很高的產品。生物大分子的純化一直是個難題。70年代以來，逐漸開發出各種色譜(層析)技術，如親和色譜、疏水色譜、聚焦色譜、離子交換色譜和凝膠色譜等，后兩種技術已開始用于批量生產。★4、下游技術的一般工藝過程？按生產過程劃分，生物工程下游技術大致可分為4個階段，即預處理、提取（初步分離）、精制（高度純化）、成品制作。如下圖所示。發酵液預處理細胞分離細胞破碎碎片分離提取精制成品制作加熱過濾勻漿法離心沉淀（重）結晶濃縮調pH離心研磨法雙水相吸附離子交換干燥絮凝膜分離酶解法膜分離萃取色譜分離無菌過濾超濾膜分離成型結晶圖1-1生物工業下游技術一般工藝過程★5、什么是生物工程下游技術永久性的發展方向和推動力？成本、質量、環境保護將是生物工程下游技術永久性的發展方向和推動力。★6、清潔生產(CleanerProduction）？清潔生產：將綜合預防的環境保護策略持續應用于生產過程和產品中，以期減少對人類和環境的風險。它包括三方面內容：即清潔生產工藝（技術）、清潔產品、清潔能源。清潔生產工藝是生產全過程控制工藝，包括節約原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和廢物離開生產過程以前，盡最大可能減少它們的排放量和毒性，對必須排放的污染物實行綜合利用，使廢物資源化。第二章發酵液預處理★1．發酵液有什么特性？微生物發酵液的特性可歸納為：①發酵產物濃度較低，大多為1%~10%，懸浮液中大部分是水；②懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；③固體粒子可壓縮性大；④液相粘度大，大多為非牛頓型流體；⑤性質不穩定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。★2、改變發酵液過濾特性的主要方法有哪些?其簡要機理如何?一、降低液體粘度根據流體力學原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，可見降低液體粘度可有效提高過濾速率。降低液體粘度的常用方法有加水稀釋法和加熱法等。采用加水稀釋法雖能降低液體粘度，但會增加懸浮液的體積，加大后繼過程的處理任務。而且，單從過濾操作看，稀釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認為有效，即若加水一倍，則稀釋后液體的粘度必須下降50％以上才能有效提高過濾速率。升高溫度可有效降低液體粘度，提高過濾速率，如12°Be麥芽汁40℃時粘度為1.2X10-3Pa·s，升高至75℃其粘度可下降一半，過濾速率可加倍1倍。同時，在適當溫度和受熱時間下可使蛋白質凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進一步改善了發酵液的過濾特性。如鏈霉素發酵液，調酸至pH3.0后，加熱至二、調整pHpH值直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節pH值可改善其過濾特性。此法是發酵工業中發酵液預處理較常用的方法之一。對于蛋白質，由于羧基的電離度比氨基大，故蛋白質的酸性性質通常強于堿性，因而大多數蛋白質的等電點都在酸性范圍內(pH4.0～5.5)。利用酸性來調節發酵液pH值使之達到等電點，可除去蛋白質等酸性兩性物質。在膜過濾中，發酵液中的大分子物質易與膜發生吸附，通過調整pH值改變易吸附分子的電荷性質，即可減少堵塞和污染。此外，細胞、細胞碎片及某些膠體物質等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。三、凝聚與絮凝采用凝聚和絮凝技術能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質的分散狀態，使其聚結成較大的顆粒，便于提高過濾速率。除此之外，還能有效地除去雜蛋白質和固體雜質，提高濾液質量。因此，凝聚和絮凝是目前工業上最常用的預處理方法之一。凝聚是指在電解質作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩定的現象。絮凝則是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。1、凝聚發酵液中的細胞、菌體或蛋白質等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子和自身基團的電離。在生理pH值下，發酵液中的菌體或蛋白質常常有負電荷，由于靜電引力的作用，使溶液中帶相反電荷的陽離子被吸附在其周圍，在界面上形成雙電層。這種雙電層的結構使膠粒之間不易聚集而保持穩定的分散狀態。雙電層的電位越高，電排斥作用越強，膠體粒子的分散程度也就越大，發酵液過濾就越困難。根據Schuze-Hardy法則，反離子的價數越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越強。陽離子對帶負電荷的發酵液膠體粒子凝聚能力的次序為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。常用的凝聚電解質有硫酸鋁Al2(SO4)3·18H20(明礬)、氯化鋁AlCl3·6H20、三氯化鐵FeCl3·6H20、硫酸亞鐵FeSO4·7H20、石灰、ZnSO4、MgC03等。2、絮凝采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常是比較細小的，有時還不能有效地進行分離。采用絮凝法則常可形成粗大的絮凝體，使發酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結構，其鏈節上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子(如－COOH)或陽離子(如－NH2)基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節分別吸附在不同的膠粒表面上，產生橋架聯接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。對絮凝劑的化學結構一般有下列兩方面的要求，一方面要求其分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結合；另一方面要求必須具有長鏈的線性結構，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子質量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。根據其活性基團在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為非離子型、陰離子型和陽離子型三類。根據其來源的不同，工業上使用的絮凝劑又可分為如下三類：(1)有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物。(2)無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。(3)天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常用的絮凝劑是有機合成的聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)類衍生物，其絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快，用量少(一般以mg/L計)，適用范圍廣。它們的主要缺點是存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，一般不宜用于食品及醫藥工業。近年來發展的聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，無毒，可用于食品和醫藥工業。絮凝效果與絮凝劑的加量、相對分子質量和類型、溶液的pH、攪拌轉速和時間等因素有關。同時，在絮凝過程中，常需加入一定的助凝劑以增加絮凝效果。溶液pH值的變化常會影響離子型絮凝劑中官能團的電離度，從而影響吸附作用的強弱。3、混凝對于帶負電荷的菌體或蛋白質來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產生吸附橋架的雙重機理，所以可以單獨使用。對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則主要通過分子間引力和氫鍵作用產生吸附橋架，所以它們常與無機電解質凝聚劑搭配使用。首先加入電解質，使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩，凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。無機電解質的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創造了良好的條件，從而大大提高了絮凝的效果。這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。四、加入助濾劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。這是因為使用助濾劑后，懸浮液中大量的細微膠體離子被吸附到助濾劑的表面上，從而改變了濾餅結構，它的可壓縮性下降了，過濾阻力降低了。常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質表面預涂助濾劑，另一種是直接加入發酵液，也可兩種方法同時兼用。對于第二種使用方法，使用時需要一個帶攪拌器的混合槽，充分攪拌混合均勻，防止分層沉淀。除此之外，選擇和使用助濾劑的要點如下：(1)根據目的產物選擇助濾劑品種(2)根據過濾介質和過濾情況選擇助濾劑品種(3)粒度選擇(4)使用量的選擇五、加入反應劑加入某些不影響目的產物的反應劑，可消除發酵液中某些雜質對過濾的影響，從而提高過濾速率。加入反應劑和某此可溶性鹽類發生反應生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。如在新生霉素發酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉，生成的磷酸鈣沉淀可充當助濾劑，另一方面可使某些蛋白質凝固。又如環絲氨酸發酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成磷酸鈣沉淀，能使懸浮物凝固，多余的磷酸根離子還能除去鈣、鎂離子，并且在發酵液中不會引入其他陽離子，以免影響環絲氨酸的離子交換吸附。正確選擇反應劑和反應條件，能使過濾速率提高3～10倍。如發酵液中含有不溶性多糖物質，則最好用酶將它轉化為單糖，以提高過濾速率。例如萬古霉素用淀粉作培養基，發酵液過濾前加入0.025％的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5％硅藻土助濾劑，從而可使過濾速率提高5倍。★3、什么是等電點？等電點沉淀法?對于氨基酸、蛋白質等兩性物質，在酸性條件下帶正電荷，在堿性條件下帶負電荷，而在某一pH值下，凈電荷為零，稱為等電點。在等電點下，兩性物質的溶解度最小，此即為等電點沉淀法。4.凝聚與絮凝的區別？凝聚是指在電解質作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩定的現象。凝聚作用就是向膠體懸浮液中加入某種電解質，在電解質中異電離子作用下，膠粒的雙電層電位降低，使膠體體系不穩定，膠體粒子間因相互碰撞而產生凝集的現象。電解質的凝聚能力可用凝聚值來表示，使膠粒發生凝聚作用的最小電解質濃度(mmol/L)稱為凝聚值。根據Schuze-Hardy法則，反離子的價數越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越強。陽離子對帶負電荷的發酵液膠體粒子凝聚能力的次序為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+。常用的凝聚電解質有硫酸鋁Al2(SO4)3·18H20(明礬)、氯化鋁AlCl3·6H20、三氯化鐵FeCl3·6H20、硫酸亞鐵FeSO4·7H20、石灰、ZnSO4、MgC03等。絮凝則是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常是比較細小的，有時還不能有效地進行分離。采用絮凝法則常可形成粗大的絮凝體，使發酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結構，其鏈節上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子(如－COOH)或陽離子(如－NH2)基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節分別吸附在不同的膠粒表面上，產生橋架聯接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。對絮凝劑的化學結構一般有下列兩方面的要求，一方面要求其分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結合；另一方面要求必須具有長鏈的線性結構，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團，但相對分子質量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。根據其活性基團在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為非離子型、陰離子型和陽離子型三類。根據其來源的不同，工業上使用的絮凝劑又可分為如下三類：(1)有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物。(2)無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。(3)天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常用的絮凝劑是有機合成的聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)類衍生物，其絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快，用量少(一般以mg/L計)，適用范圍廣。它們的主要缺點是存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，一般不宜用于食品及醫藥工業。近年來發展的聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，無毒，可用于食品和醫藥工業。絮凝效果與絮凝劑的加量、相對分子質量和類型、溶液的pH、攪拌轉速和時間等因素有關。同時，在絮凝過程中，常需加入一定的助凝劑以增加絮凝效果。溶液pH值的變化常會影響離子型絮凝劑中官能團的電離度，從而影響吸附作用的強弱。絮凝劑的最適添加量往往需通過試驗確定，雖然較多的絮凝劑有助于增加橋架的數量，但過多的添加量反而會引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使絮疑團的粒徑變小，絮凝效果下降。5.如何除去發酵液中的雜蛋白質?(1)沉淀法蛋白質是兩性物質，在酸性溶液中，能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。(2)變性法蛋白質從有規則的排列變成不規則結構的過程稱為變性，變性蛋白質的溶解度較小。使蛋白質變性的方法很多，其中最常用的是加熱法。加熱不僅使蛋白質變性，同時降低液體粘度，提高過濾速率。例如，將檸檬酸發酵液加熱至80℃使蛋白質變性的其他方法有：大幅度調節pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。如在抗生素生產中，常將發酵液pH調至偏酸性范圍(pH2～3)或較堿性范圍(pH8～9)使蛋白質凝固，一般以酸性下除去的蛋白質較多。變性法存在一定的局限性。如加熱法只適合于對熱較穩定的目的產物；極端pH也會導致某些目的產物失活，并且要消耗大量酸堿；而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。(3)吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去。例如在四環類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用生成亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3[Fe(CN6)]2的膠狀沉淀來吸附蛋白質，在生產實際中已取得很好的效果。在枯草芽孢桿菌發酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而可加快過濾速率。第三章細胞破碎、蛋白質復性和固液分離★1．常用的細胞破碎方法？1、高壓勻漿法高壓勻漿法所用設備是高壓勻漿器（Highpressurehomogenizer），最早用于牛奶的勻漿化，使奶質均勻，不產生分層、成膜現象。（1）作用機理從高壓室（幾十兆帕）壓出的細胞懸浮液（見圖5-2）經過閥座3的中心孔道從閥座3和閥桿5之間的小環隙中噴出，速度可達幾百米每秒。這種高速噴出的漿液又射到靜止的碰撞環4上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列過程中經歷了高流速下的剪切、碰撞以及由高壓倒常壓（出口處壓力）的變化，使細胞產生較大的形變，導致細胞壁的破壞。細胞壁是細胞的機械屏障，稍有破壞就會造成細胞膜的破壞，胞內物質在滲透壓作用下釋放出來，從而造成細胞的完全破壞。細胞懸浮液經過一次高壓勻漿后，常常只有一部分細胞破碎，不能達到100%的細胞破碎率。為此，需要在收集完破碎液（通常稱為“細胞勻漿”）后進行第二次、第三次或更多次的破碎，這是高壓勻漿法的缺點。為避免操作煩瑣，也可以將細胞勻漿進行循環破碎，但要避免過度破碎帶來產物的損失，以及細胞碎片進一步變小，影響后面對碎片的分離。（2）動力學方程值得提出的是在細胞破碎過程中，胞內物質的釋放快慢由內含物在胞內的位置決定。例如，胞間質（periplasm）的釋出先于胞內質（cytoplasm），而膜結合酶（membrane-boundenzyme）最難釋放。（3）溫控與能耗人們普遍關心的是活性物質在破碎過程中的失活問題，研究表明蛋白質和酶的失活主要由勻漿過程中產生的熱引起。如果能將溫度控制在35℃以下，那么酶活損失可以忽略。對于溫度敏感性物質低溫操作是必需的。高壓勻漿一般需多級操作，每次循環前往往進行級間冷卻。盡管提高壓力有利于細胞破碎，但是提高壓力需增加能耗（3.5kW/100MPa），同時為移走產生的熱量（23.8（4）存在的問題除了較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌以及較小的革蘭陽性菌不適合用高壓勻漿器處理以外，其他微生物細胞都可以用高壓勻漿法破碎。另外有些亞細胞器（如包含體，inclusionbody）質地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。但也有人在實驗室用高壓勻漿器研究真菌和含有包含體的大腸桿菌的破碎。2、高速珠磨法（1）作用機理微生物細胞懸浮液與極細的研磨劑（通常是d<1mm的無鉛玻璃珠）在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細胞之間的互相剪切、碰撞，促使細胞壁破裂，釋出內含物。在珠液分離器的協助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出，從而實現連續操作。破碎中產生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。（2）動力學方程微生物細胞的形態和生理因素決定了細胞壁的化學組成與機械強度，從而決定了細胞破碎的難易程度。顯然這些復雜的因素難以用簡單的方程來描述，只能通過實驗加以區分比較。（3）溫控和能耗珠磨機是采用夾套冷卻的方式實現溫度控制的，一般情況下能夠將溫度控制在要求的范圍內。珠磨機破碎的能耗與細胞破碎率成正比。提高破碎率，需要增加裝珠量，或延長破碎時間，或提高轉速，這些措施不僅導致電能消耗的增加，而且產生較多的熱量，引起漿液溫度升高，從而增加了制冷費，因此總能量消耗增加。不僅僅如此，高破碎率還給后分離帶來麻煩。對于可溶性胞內產物的提取，細胞破碎后必須進行固-液分離，將細胞碎片除去。盡管采用高速離心，錯流微孔過濾，或雙水相萃取等技術可以除去碎片，但是破碎率越高，碎片越細小，清除碎片越困難，并且不得不考慮產物活性損失因此增加的可能性。總之，不管是高壓勻漿，還是珠磨機破碎，都不是以破碎率為基準的，而考慮產物的收率和兼顧上下游過程。（4）兩種方式的比較（高壓勻漿法同高速珠破法相比）高壓勻漿法與高速珠磨法相比各有特點，前者操作參數少，易于確定，后者操作參數多，一般憑經驗估計，并且玻璃珠之間的液體損失使一次處理85ml懸浮液最終只能得到50ml左右得漿液。連續操作時珠磨機兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產物失活的可能性，而高壓勻漿器配備換熱器進行級間冷卻；其次珠磨機法破碎在適當條件下一次操作就能達到較高的破碎率，而高壓勻漿往往需循環2~4次才行；再者幾乎所有種類的微生物細胞都可以用珠磨機破碎，包括含有包含體的基因工程菌的破壁。3、超聲破碎（ultrasonication）（1）作用機理可能與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。聲頻高于15~20kHz的超聲波在高強度聲能輸入可以進行細胞破碎，其破碎機理尚未弄清楚，可能與空化現象引起的沖擊波和剪切力有關。空化現象是在強聲波作用下，讓氣泡形成，脹大和破碎的現象。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及菌種類型等因素有關。采用超聲破碎法處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，因而在實驗室規模應用較為普遍。超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時常在細胞懸浮液中加入冰塊或在夾套中通入冷卻及進行冷卻。但在大規模操作中，聲能傳遞和散熱均有困難。此外，超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質失活，因而有一定的局限性。（2）動力學方程（3）存在的問題超聲破碎在實驗室規模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少；但是超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感活性物質變性失活，噪聲令人難以忍受，而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，因而超聲破碎的應用潛力有限。4、化學滲透法指某些化學藥品可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內含物有選擇地滲透出來的處理方式。（1）作用機理化學滲透取決于化學試劑的類型及細胞壁和膜的結構與組成，表5-2列出不同類型微生物細胞的結構和化學組成。各種化學試劑不同種類細胞作用的情況見表-3所示。不同試劑對各種微生物細胞作用的部位和方式有所差異。①EDTA作為螯合劑，可用于處理革蘭陰性菌（如E.coli）對細胞的外層膜有破壞作用。②有機溶劑常用甲苯，它能溶解細胞膜的磷脂層。③TritonX-100是非離子型清潔劑，對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，因此起作用部位主要是內膜的雙磷脂層。化學滲透法以前主要用來檢測胞內酶活性。經化學試劑處理后，檢測酶活性的底物等小分子可以滲透到胞內，這樣就不必釋出胞內酶了。鹽酸胍不僅能改變細胞的通透性，而且能溶解不溶性重組蛋白（如包含體），并在其他試劑的配合下使其二硫鍵斷裂，變性解離成亞基，從而釋放出來。除去變性劑和雜蛋白后，在一定條件下恢復太鏈或肽鏈間的二硫鍵，再折疊復性成具有活性的蛋白質立體結構。（2）優缺點化學滲透法與機械法相比具有如下優點。①對產物釋出具有一定的選擇性。化學試劑處理能使一些分子量小的溶質（如多肽和小分子的酶蛋白）透過，而分子量大的物質（如核酸）則被阻滯在胞內。②細胞外形保持完整；碎片少，有利于后分離。③核酸釋出量少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。化學滲透法也有自身的缺陷。①時間長，效率低。一般胞內物質釋放率不超過50%，而處理時間則長達2h以上，所以往往需添加還原劑（如巰基乙醇）作保護，以防活性損失太多。②化學試劑具有毒性。有些化學試劑本身就有較強的毒性，同時對產物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑。③通用性差。某種試劑職能作用于某些特定類型的微生物細胞。5、酶溶法（enzymaticlysis）酶溶法是一種利用酶反應，分解破壞細胞壁上的特殊鍵，從而達到破壁的目的的方法。酶溶法可分為外加酶法和自溶法兩種。（1）外加酶法在外加酶法中，常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、β-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、β-1,6葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽鍵內切酶（Endopeptidase）、殼多糖酶等，而細胞壁溶解酶（Zymolyase）是幾種酶的復合物。其中溶菌酶主要用于細菌類，其他酶對酵母作用較顯著。溶酶同其他酶一樣具有高度專一性，蛋白酶只能水解蛋白質，葡聚糖酶只對葡聚糖起作用，因此利用溶酶系統處理細胞時必須根據細胞壁的結構和化學組成選擇適當的酶，并確定相應的次序。例如對酵母細胞采用酶溶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質-甘露聚糖結構，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內物質。外加酶法主要用于實驗室規模，如利用酶溶法可從細胞內不同位置選擇性地釋放目的產物（如克隆的胞內蛋白質）和制取特殊的胞壁葡聚糖聚合物等。此外，酶溶法大量用來剝離細胞壁，將原生質體進行融合，這是細胞工程常用的方法。酶溶法的優點是：選擇性釋放產物，條件溫和，核酸泄出量少，細胞外形完整。酶溶法的不足：一是溶酶價格高，限制了大規模應用，若回收溶酶則又需增加分離純化溶酶的操作和設備，其費用也不低；二是酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件；三是產物抑制的存在，在溶酶系統中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶，這可能是導致酶溶法胞內物質釋放低的一個重要因素。（2）自溶法自溶法（Autolysis）是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產生的。事實上，在微生物生長代謝過程中，大多都能產生一定的水解自身細胞壁上聚合物結構的酶，以便使生長繁殖過程進行下去。控制一定條件，可以誘發微生物產生過剩的溶胞酶或激發自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑和細胞代謝途徑等。微生物細胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。例如，對谷氨酸生產菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pH10的緩沖液，再配3%的細胞胞懸浮液，加熱至70℃6、微波加熱法（1）作用機理微波是頻率介于300MHz和300GHz之間的電磁波，微波加熱法（microvaveheating）是利用為波長中介質的偶極子轉向極化與界面極化的時間與微波頻率吻合的特點，促使介質轉動能級躍遷，加劇熱運動，將電能轉化為熱能。從細胞破碎的微觀角度看，微波加熱導致細胞內的極性物質，尤其是水分子吸收微波能，產生大量的熱量，是胞內溫度迅速上升，液態水汽化產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞；進一步加熱，導致細胞內部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現裂紋。孔洞或裂紋的存在使胞外溶劑容易進入細胞內，溶解并釋放出胞內產物。微波具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點，可以用來處理微生物、植物和動物細胞提取胞內有效成分。（2）存在的問題一是只適用于對熱穩定的產物（如寡糖、多糖、核酸、生物堿、黃酮、苷類等中藥成分），對于熱敏性物質（如蛋白質、多肽、酶等）微波加熱容易導致變性失活；二是要求被處理的物料具有良好的吸水性，或者說待分離的產物所處的位置容易吸水，否則細胞難以吸收足夠的微波能將自身擊破，產物也就難以迅速釋放出來；三是不適合于富含淀粉和/或樹膠的天然植物，因為微波干燥很容易使它們變性或糊化，堵塞通道，反而不利于胞內產物地釋放。（3）機械法與非機械法的比較以高壓勻漿和珠磨為代表的機械法與以化學滲透和酶溶法為代表的非機械法相比各有特點，表5-5對二者進行了比較。7、其他方法（1）X-press法（壓榨法）X-press法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-----------25℃（2）滲透壓法滲透壓法（Osmoticpressure）是一種較溫和的細胞破碎法。將細胞放在高滲透壓的介質中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達平衡后，轉入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞溶脹，甚至破碎。于是，細胞內容物就釋放出來。此法僅適用于細胞比較脆弱的細胞，或者細胞壁預先用酶處理，或者在培養過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。（3）反復凍結-融化法將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面是細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能；另方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。此法制是用于細胞比較脆弱的菌體，破碎率較低，常需反復多次。此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。（4）干燥法可采用多種方法是細胞干燥，如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過干燥使細胞壁膜的結合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。氣流干燥主要是用于酵母菌，一般在25~30℃★2、什么是自溶法(Autolysis）？自溶法是一種特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產生的。事實上，在微生物生長代謝過程中，大多都能產生一定的水解自身細胞壁上聚合物結構的酶，以便使生長繁殖過程進行下去。控制一定條件，可以誘發微生物產生過剩的溶胞酶或激發自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH、激活劑和細胞代謝途徑等。微生物細胞的自溶法常采用加熱法或干燥法。例如，對谷氨酸生產菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3，配成pH10的緩沖液，再配3%的細胞胞懸浮液，加熱至70℃細胞破碎率的測定？1、直接測定法利用適當的方法，計數破碎前后的細胞數即可直接計算其破碎率。對于破碎前的細胞，可利用顯微鏡或電子微粒計數器直接計數。破碎后，破碎過程所釋放的物質如DNA和其他聚合物組分會干擾計數，此時可采用染色的方法把破碎的細胞與未受損害的完整細胞區分開來。例如，破碎的革蘭氏陽性菌可染色成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，未受損害的細胞成紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。2、目的產物測定法細胞破碎后，通過測定破碎液中目的產物地釋放量來估算破碎率。通常將破碎后的細胞懸浮液用離心法分離細胞碎片，測定上清液中目的產物（如蛋白質或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標準數值比較，計算其破碎率。3、導電率測定法Luther等報道了一種利用破碎前后導電率的變化來測定破碎程度的快速方法。細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。導電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。由于導電率的大小與微生物種類、處理條件、細胞濃度、溫度和懸浮液中原電解質的含量等有關，因此，正式測定前應預先采用其他方法制定標準曲線。★4、論述細胞破碎技術研究的發展方向？1、多種破碎方法相結合化學法與酶法取決于細胞壁的化學組成，機械法取決于細胞結構的機械強度，而化學組成又決定了結構的機械強度，組成的變化必然影響到強度的差異，這就是化學法或酶法與機械法相結合的原理。在實際操作中，可先用化學法或酶法對細胞進行處理，破壞細胞壁膜的某些物質組成，使壁膜的機械強度下降，隨后在用機械法處理，即可大大提高細胞的破碎率。2、與上游相結合在發酵培養過程中，培養基、生長期、操作參數（如pH、溫度、通氣量、稀釋率）等因素對細胞破碎都有影響，因此細胞破碎與上游培養有關。另一方面用基因工程的方法對菌種進行改造也是非常重要的。這方面的工作包括以下內容。（1）培養過程控制在發酵培養過程的細胞生長后期，加入某些能抑制或組織細胞壁物質合成的抑制劑（如青霉素、環絲氨酸等），繼續培養一段時間后，新分裂的細胞其細胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞內產物不經破碎即可直接滲透出來。（2）寄主細胞的選擇選擇較易破壁的菌種作為寄主細胞，如革蘭氏陰性細菌。（3）包含體的形成包含體是重組蛋白在原核生物細胞內表達后形成的不溶性組分，是不具活性的蛋白質產物，其密度很大。寄主細胞破碎后，包含體可用密度梯度離心機收集。收集的包含體用變性劑溶解，再除變性劑即可得到恢復活性的蛋白質產品。（4）克隆噬菌體溶解基因在細胞內引進噬菌體基因，培養結束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細胞自內向外溶解，釋放出內含物。（5）耐高溫產品的基因表達在細胞破碎和分離過程中，為了防止產品失活而消耗的制冷能耗是相當可觀的。如果產品能表達呈耐高溫型，雜蛋白仍然保持原特性，那么就可在較高溫度下將產品與雜質分開，這樣既節省了冷卻費用，有簡化了分離步驟。3、與下游過程結合細胞破碎與固-液分離緊密相關，對于可溶性產品來講，碎片必須除凈，否則將造成層析柱和超濾膜的堵塞，縮短設備的壽命。因此，在破碎細胞的同時，要考慮所造成的細胞碎片對后分離的影響。例如，多次進行高壓勻將雖然可以增加產物的釋放量，但是也會造成前次的碎片在下一次的勻漿中被進一步破碎，產生更細小的碎片，給后面的固液分離增加難度。必須從后分離過程的整體角度來看待細胞破碎，進行整體的集成、優化，才能獲得最佳的工藝。★5．分離出具有活性的蛋白質的一般步驟？要分離出具有活性的蛋白質，一般要經歷下列步驟：破碎細胞分離出包含體溶解包含體目標產物的構型復原★6．什么是包涵體，它存在的兩面性？相當多的蛋白質產物在胞內凝集成沒有活性的固體顆粒，稱為包涵體。兩面性：一方面包含體基本是由蛋白質構成，其中大部分（占50%以上）是克隆表達的產物，這些產物在一級結構上是正確的，但在立體構型上卻是錯誤的，因此沒有生物學活性，另一方面包含體蛋白質能夠避免遭受宿主蛋白質的降解；同時也不會對宿主細胞造成毒害，影響生長。7．什么是蛋白質的復性，通常采用什么方法？除去變性劑時，一部分蛋白質可以自動折疊成具有活性的正確構型，這一折疊過程稱為蛋白質的復性。方法：使蛋白質復性最常用的有兩種方法。一種方法是將溶液稀釋，導致變性劑的濃度降低，蛋白質開始復性。此法很簡單，只需加入大量的水或緩沖液，缺點是增大了加工的液量，降低了蛋白質的濃度。另一種辦法是用透析、超濾或電滲析除去變性劑。其中透析法常在實驗室中使用，將溶液對水或緩沖液透析，變性劑透過膜被除去，里面的蛋白質開始復性。此法不增加液體體積，不降低蛋白質濃度，但時間較長，易形成蛋白質沉淀。超濾或電滲析比透析速度快，但要注意這兩種過程都存在蛋白質的失活問題。8．從細胞破碎到蛋白質復性的工藝路線？①機械破碎（高壓勻漿，高速珠磨）離心法提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復性；②機械破碎膜分離出可溶性蛋白變性劑溶解包含體除變性劑復性；③化學破碎（加變性劑）離心除細胞碎片除變性劑復性9．固液分離的方法？一、離心沉降二、微孔膜過濾三、雙水相萃取四、泡沫分離法10．離心機的種類？過濾的種類？1、碟片式離心機2、管式離心機3、傾析式離心機過濾種類：根據過濾機理的不同，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾兩種。當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，這種方法叫做澄清過濾。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布所阻攔而逐漸形成濾餅(或稱濾渣)。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾或濾渣過濾。第四章膜分離技術在生物工程中的應用1．什么是膜分離技術？膜分離技術是用半透膜作為選擇障礙層，允許某些組分透過而保留混合物中其他組分，從而達到分離目的的技術。2．膜的分類？現根據各種物理結構和化學性質，可將膜分為下列幾種：1、對稱膜對稱膜是結構與方向無關的膜2、非對稱膜非對稱膜有一個很薄的，但比較致密的分離層和多孔支撐層，如圖9-1所示3、復合膜這種膜的選擇性膜層(活性膜層)沉積于具有微孔的底膜(支撐層)表面上4、荷電膜即離子交換膜，是一種對稱膜，含有高度的溶脹膠載著固定的正電荷或負電荷，帶有正電荷的膜稱為陰離子交換膜，從周圍流體中吸引陰離子。帶有負電荷的膜稱為陽離子交換膜。相對應的有中性膜。另外還有根據膜材料親疏水性可分為親水膜和疏水膜。5、液膜即液體膜，是從生物膜奇妙的選擇性輸送功能上得到啟發而模仿的一種人工膜6、微孔膜孔徑為0.05~20μm的膜7、動態膜在多孔介質(如陶瓷管)上沉積一層顆粒物(如氧化鋯)作為有選擇作用的膜，此沉積層與溶液處于動態平衡3．滲透、透析、反滲透、超濾、和電滲析？滲透是一個擴散過程，在膜的兩旁，滲透壓差的作用下溶劑產生流動。透析是利用膜兩側的濃度差從溶液中分離出小分子物質的過程。從溶液中分離出溶劑的膜分離操作為反滲透。按粒徑選擇分離溶液中所含的微粒和大分子的膜分離操作為超濾在電場中交替裝配的陰離子和陽離子交換膜，在電場中形成一個個隔室，使溶液中的離子有選擇地分離或富集，這就是電滲析。★4．膜的濃差極化與膜污染？如何控制膜污染？濃差極化是指在分離過程中，料液中的溶劑在壓力驅動下透過膜，溶質被截留，于是在膜表面與臨近膜面區域濃度越來越高。在濃度梯度作用下，溶質由膜面向本體溶液擴散，形成邊界層，使流體阻力與局部滲透壓增加，從而導致溶劑透過流量下降。溶劑向膜面流動（對流）引起溶質向膜面流動，當溶質向膜面的流動速度與濃度梯度使溶質向本體溶液擴散速度達到平衡時，在膜面附近存在一個穩定的濃度梯度區，這一區域稱為濃度極化邊界層，這一現象稱為濃差極化。膜污染是指處理物料中的微粒、膠體粒子或溶質大分子由于與膜存在物理化學相互作用或機械作用而引起的在膜表面或膜孔內吸附、沉積造成膜孔徑變小或堵塞，使膜產生透過流量與分離特性的不可逆變化現象。1、膜材料的選擇膜的親疏水性、荷電性會影響到膜與溶質間相互作用大小。2、膜孔徑或截留分子量的選擇（圖6-7和6-8）當待分離物質的尺寸大小與膜孔相近時，由于壓力的作用，溶劑透過膜時把粒子帶向膜面，極易產生堵塞作用。3、膜結構選擇通常原則是選擇不對稱結構膜較耐污染。4、組件結構選擇毛細管式與薄流道式組建設計可以減小濃差極化或凝膠層形成。5、溶液pH控制溶液pH對蛋白質在水中溶解性，荷電性機構型有很大影響。6、溶液中鹽濃度的影響7、溶液溫度影響一般溶液溫度升高，其黏度下降，但對某些蛋白質溶液，溫度升高，反而會使透水率下降。8、溶質濃度，料液流速與壓力的控制5．膜分離技術應用實例？實例：1、膜分離技術在純凈水處理中的應用它可以在超純水制備中作為預處理手段，去除微生物、膠體和大分子物質，以減輕反滲透和離子交換樹脂的負擔，提高出水質量與再生經濟效果，它也可以用在終點過濾，以去除微粒膠體、細菌和有機物。2、采用膜集成技術為電鍍廢水處理提供完美解決方案，促進電鍍工業技術升級。其主要特點：(1)降低成本——水與貴重金屬循環利用，減少材料消耗(2)回收資源——貴重金屬回收利用(3)保護環境——廢水零排放或微排放3、膜分離技術在給水及循環水處理中的應用4、超濾技術除菌除熱原5、超濾技術澄清藥酒和中藥制劑6、超濾技術在輕工、食品中的應用7、膜分離技術在生物化工中的應用8、超濾技術在膜生物反應器中的應用第五章生物大分子的色譜分離和純化1．什么是色譜分離(ChromatographicResolution，CR)？色譜分離(ChromatographicResolution，CR)也稱為色層分離或層析分離，利用多組分混合物中各組分物理化學性質(如吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數等)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中。其中一個相為固定的，稱為固定相；另一個相則流過此固定相，稱為流動相。當多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學性質的差別，而以不同的速率移動，使之分離。2．色譜分離具有哪些基本特點？色譜分離具有如下基本特點：(1)分離效率高(2)應用范圍廣(3)選擇性強(4)高靈敏度的在線檢測(5)快速分離(6)過程自動化操作3．色譜分離的規模？分析色譜：＜10mg半制備色譜（中等規模制備）：10～50mg制備色譜（樣品制備）：0.1～1g工業生產規模色譜：＞20g/d4．基因工程菌培養液中所要除去的生物大分子雜質有哪些？5．在色譜操作中的術語？分配系數在一定條件下，一定量的溶質在兩種互不相溶的溶劑中達平衡時，溶質在兩種溶劑中的濃度之比為一常數，此常數稱為分配系數Kd。6．什么是有效柱長和最短柱長，以及它們在色譜操作時的實際意義？溶質從開始遷移至其遷移速度等于流動相速度時，溶質在色譜柱上遷移的距離稱之為有效遷移距離，也稱之為有效柱長，用Leff表示。最短柱長Lmin定義為混合溶質中使一對最難分離的溶質(分離度Rs=1時），所需的最短柱長。Leff表征的是一種溶質的遷移特征，而Lmin描述的則是在滿足一定分離度要求條件下，兩種溶質遷移的差異程度。7．柱色譜一般裝置？色譜柱的分離效率與柱長及直徑的關系？柱色譜裝置一般有進樣、流動相供給、色譜柱、檢測及流分收集器等部分構成一般細長高，短粗低8．展開操作的方法？1．洗脫展開法2．前沿分析法3．置換展開法9．如何來選擇合適的色譜分離方法？(1)目的產物的分子結構、物理化學特性、及分子量的大小；(2)主要雜質，特別是分子結構、大小和理化特性與目的產物相近的雜質的成分與含量；(3)目的產物在色譜分離過程中生理活性的穩定性。10．有哪些色譜分離方法？基本原理，基本特點和主要應用方向？吸附色譜(AdsorptionChromatography，AC)是指混合物隨流動相通過固定相(吸附劑)時，由于固定相對不同物質的吸附力不同而使混合物分離的方法。分配色譜(DistributionChromatography，DC)的流動相和固定相都是液體，因而又稱為液液色譜，其原理是利用混合物中各物質在兩液相中的分配系數不同而分離。離子交換色譜(IonExchangeChromatography，IEC)是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，由于混合物中不同溶質對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。凝膠色譜(GelChromatography，GC)以凝膠為固定相，是一種根據各物質分子大小不同而進行分離的色譜技術，因而又稱為分子篩色譜(MolecularSieveChromatography，MSC)、空間排阻色譜或尺寸排阻色譜(SizeExclusionChromatography，SEC)。親和色譜(AffinityChromatography，AFC)作為色譜分離技術的一個分支，對于生物大分子化合物的分離純化具有特別重要的意義。把與目的產物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當含有目的產物的混合物(流動相)流經此固定相時，即可把目的產物從混合物中分離出來。疏水作用層析（HIC）根據化合物的疏水性進行分離：帶有疏水和親水基團的樣品分子在高鹽緩沖液中加入到HIC層析柱，緩沖液中的鹽降低了樣品的溶解度。由于總溶解度下降，裸露在外的疏水基團就被介質吸附。化合物的疏水性越強，需要加入用來提高結合力的鹽就越少。通常依照疏水性的遞增次序，用遞減鹽梯度來洗脫層析柱內的樣品，也可以在洗脫液中加入溫和的有機調節物或洗滌劑來完成。11．色譜分離技術的分類？根據固定相的形狀不同，色譜分離技術可分為柱色譜、紙上色譜和薄層色譜三類。(1)根據流動相的物態不同，可分為氣相色譜分離、液相色譜分離和超臨界色譜分離。(2)根據操作壓力不同可分為低壓色譜分離(<0.5MPa)、中壓色譜分離(0.5～5MPa)和高壓色譜分離(5～50MPa)。(3)根據洗脫操作時展開方式的不同，可分為洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法3種。★12．理解LC法進行蛋白質復性的優點？(“一石四鳥”)用LC法進行蛋白質復性的優點是：①進樣后可很快除去變性劑；②由于色譜固定相對變性蛋白質的吸附，可明顯地減少甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環境后的分子聚集，從而避免或減少了該蛋白形成沉淀，從而提高了蛋白質復性的質量和活性回收率；③在蛋白質復性的同時可使目標蛋白質與雜蛋白分離以達到純化的目的，使復性和純化同時進行；④便于回收變性劑，以降低廢水處理成本。★13．熟悉LC法進行蛋白質復性的技術？（SEC、IEC、AFC、HIC）1．SEC其復性機理為：在變性蛋白進入柱頂端時，因有高濃度變性劑的存在，變性蛋白質分子有一個隨機的構象狀態和大的動力學水合半徑，不能進入柱的空隙，蛋白質在SEC柱上不保留。當使用復性的緩沖溶液洗脫時，因其逐步取代變性劑并使蛋白質濃度降低，使變性蛋白質分子處于熱力學不穩定的高能狀態，這些蛋白質分子就會自發地向熱力學穩定的低能態——即蛋白質的天然狀態轉化，從而使變性蛋白質開始復性。2．IEC其復性機理與SEC不同之處在于變性蛋白質與固定相間有分子間的電荷作用，這種作用力可導致變性的蛋白吸附于固定相表面，在洗脫過程中進行吸附-解吸-再吸附的復性。3．AFC是利用配體與目標蛋白質問的特異性的親和作用，使變性蛋白分子保留在柱的頂端從而與變性劑分離的方式使變性蛋白在洗脫過程中進行復性的。4．HIC（疏水作用色譜）復性機理為當蛋白質、變性劑和雜蛋白質進入HIC系統后，由于HIC固定相對變性劑的作用力較弱，而對變性蛋白質的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白質分離，并隨流動相一同流出色譜柱；隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質不斷地在固定相表面上進行吸附一解吸附一再吸附，并在此過程中逐漸被復性，形成與天然蛋白質構象相同的蛋白質并流出色譜柱。14．了解色譜技術的應用？SEC用于工業生產的分離、純化聚合物和蛋白質；高效疏水色譜用于分離生物大分子，并且是一種通用型的分離和純化蛋白的工具；AFC是一類專門用于生物大分子的色譜。它是基于固定相的配基與生物大分子之間的特殊的生物親和能力的不同來進行相互間的分離的。IEC由于價廉和純化后的蛋白多保持原有活性，是另一種在生物大分子分離和純化中應用廣泛的通用型色譜。RPLC（反相液相色譜）是一種通用型的分析、分離和純化色譜方法。第六章溶劑萃取和浸取1．什么是溶劑萃取法？什么是浸取？溶劑萃取是利用一種溶質組分，(如產物)在兩個互不混溶的液相(如水相和有機溶劑相)中競爭性溶解和分配性質上的差異來進行分離操作的。用某種溶劑把有用物質從固體原料中提取到溶液中的過程稱為浸取，也稱之為浸出。2．新型溶劑萃取分離技術有哪些？超臨界流體萃取、反膠團萃取和雙水相萃取技術3．理解相似相溶原理？“相似相溶”原理:一是分子結構相似，如分子的組成、官能團、形態結構的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有極性的和非極性的之分，兩種物質如相互作用力相近，則能互相溶解。4．溶劑萃取過程中的有關術語？在溶劑萃取過程中，通常將供提取的溶液稱為料液，通常是水溶液；從料液中提取出來的物質稱為溶質；用來萃取產物的溶劑常稱為萃取劑；溶質轉移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液稱為萃取液；被萃取出溶質后的料液稱萃余液。這一常數稱之為分配系數K，即有：K=萃取相濃度/萃余相濃度=c1/c2若原來料液中除溶質A以外，還含有溶質B，則萃取劑對溶質A和B分離能力的大小可用分離因數(β)來表征：β=KA／KBβ=K產／K雜β越大，A、B的分離效果越好，即產物與雜質越容易分離。5．了解鹽析效應？鹽析無機鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產物在水中的溶解度而使其更易于轉入有機溶劑相中，另一方面還能減小有機溶劑在水相中的溶解度。6．熟悉超臨界流體萃取？超臨界流體萃取（SFE,supercriticalfluidextraction）分離過程的原理是利用超臨界流體的溶解能力與其密度的關系，即利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而進行的。在超臨界狀態下，將超臨界流體與待分離的物質接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點高低和分子量大小的成分依次萃取出來。當然，對應各壓力范圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質則完全或基本析出，從而達到分離提純的目的，所以超臨界流體萃取過程是由萃取和分離過程組合而成的。★7．雙水相萃取？向水相中加入溶入水的高分子化合物，形成密度不同的兩相，輕相富含某一種高分子化合物；重相富含鹽類或另一種高分子化合物。因兩相均含有較多的水，所以稱之為雙水相萃取。第七章目標產品的分析檢測及質量控制★1．什么是蛋白質工程？蛋白質工程是以蛋白質空間結構及其生物學功能的關系為基礎，通過分子設計和由設計結構所指導的特定的基因修飾，而實現的對天然蛋白質的定向改造，其目的是為構造并生產性能比現有蛋白質更加符合人類需要的蛋白質新品種提供科學依據和技術途徑，同時，為分子生物學的基礎理論研究提供強有力的新手段。因為DNA指導蛋白質的合成，因此蛋白質工程也被稱為第二代基因工程。2．了解美國食品與藥品管理局（FDA）的有關要求？按照美國食品與藥品管理局（FDA）的要求，在蛋白質的物理化學表征方面要取得下列數據：分子量，溶解度，等電點，氨基酸序列，肽譜，二硫鍵配對，糖脂電泳圖譜，二級結構、三級結構，與內源性物質的關系，受體的分布和結合等。★3．蛋白質分離純化的一般程序以及蛋白質的純化方法？1、蛋白質分離純化的一般程序一般來說，蛋白質的分離純化包括以下過程：(1)破碎生物組織(原料是細胞外分泌物時無需此步)，并用適當的緩沖液將蛋白質抽提出來；(2)用離心法將細胞的亞細胞顆粒(如核，線粒體、微粒體或核糖體)及細胞碎片與溶液分開；(3)應用鹽析法或有機溶劑法將有關蛋白質組分沉淀下來；(4)進二步應用層析法或電泳法使各種蛋白質分開；(5)有可能的話，在適當條件下使蛋白質結晶或制成凍干粉。2、蛋白質的純化方法從原理上看可分為幾種類型：一是利用一種蛋白質相對于其它蛋白質溶解度不同的沉淀法；二是依據蛋白質在兩相間分配作用不同的相分配法；三是利用蛋白質對固體載體的吸附性質不同，通過柱層析方式將它們分別洗脫下來的柱層析法；四是依據蛋白質在電場或離心場中運動速度不同的電泳法或離心法。上述提純方法的適當結合，在多數情況下，足以獲得純化蛋白質。★4．蛋白質含量測定的方法？最常用的是紫外光吸收法、雙縮脲法、福林—酚法和考馬斯亮藍染色法1、雙縮脲法在復雜生物體系中需要