激光共聚焦顯微鏡技術吉林大學人獸共患病研究所王心蕊激光共聚焦顯微鏡技術吉林大學人獸共患病研究所1緒論激光共聚焦顯微鏡技術（ConfocalLasersScanningMiccruscopeCLSM)CLSM是將顯微鏡技術與激光技術有效的結合，使用紫外或可見光激發熒光探針，對有熒光標記物的形態及功能，利用計算機進行成像，從而得到細胞或內部微細結構的熒光圖像。它匯集了激光技術，顯微鏡技術，免疫熒光技術，計算機及圖像處理技術，精密的機械技術等高，精，尖細胞分析及工程技術于一體的新技術。緒論2激光共聚焦顯微鏡發展史在1957年MarvinMinsky提出共聚焦顯微鏡的理論，但共聚焦顯微鏡作為商品推出是在20世紀80年代初期，早期的激光共聚焦顯微鏡在技術上很不完善，其應用也受到限制。至到20世紀80年代末，光學系統設計不斷改進，成像的質量和靈敏度都有所提高，進入90年代初，激光共聚焦顯微鏡系統中逐步引入混合激光和紫外激光技術。90年代末由美國Meridian公司推出的新型激光共聚焦顯微鏡系統，已具備完善的光學系統，模塊化的儀器設計，靈活的軟件和高配置的計算機硬件，從而使共聚焦顯微鏡系統的功能不斷升級，應用的領域不斷擴展。隨著生命科學研究的不斷深入及熒光探針技術的迅速發展，共聚焦顯微鏡將推動生命科學研究的迅速發展，同時生命科學研究的進展也將使激光顯微鏡技術不斷改進和完善。激光共聚焦顯微鏡發展史在1957年MarvinMinsky3激光共聚焦顯微鏡的特點激光共聚焦顯微鏡是現今最為先進的光學顯微鏡，其主要優點為：以激光為光源，在相應的熒光探針標記后，對樣本進行逐點掃描，逐層獲得二維光學橫斷面圖像，具有“細胞CT”的功能，并可通過計算機三維重建軟件支持，獲得真三維圖像，并可以任意角度旋轉，觀察細胞，組織的立體形態和空間關系；可以對活細胞和組織進行無損傷的觀察，動態測量細胞內的Ca離子濃度和pH值等活細胞生理信息；可對細胞膜的流動性，細胞間通訊，細胞融合，細胞骨架彈性測量等，可用作“光刀子”完成細胞內“外科手術”。這一技術使得對活細胞和組織進行原位，動態，定量的觀察和測量的夢想成為現實。激光共聚焦顯微鏡的特點激光共聚焦顯微鏡是現今最為先進的光學顯4光學顯微鏡顯微鏡的基本原理普通顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的基本結構和原理激光共聚焦顯微鏡基本結構和原理光學顯微鏡顯微鏡的基本原理普通顯微鏡的基本結構和原理5顯微鏡的基本結構光學系統機械裝置顯微鏡的基本結構光學系統6顯微鏡的基本結構光學系統（1）目鏡有一組透鏡組成目鏡，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小目鏡可分為：普通目鏡；廣角目鏡兩種（2）物鏡它安裝在轉換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數，主要有10X、20X、40X、60X、100X等（3）光源有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。（4）聚光器包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調節光的強度。

顯微鏡的基本結構光學系統7顯微鏡的基本結構（1）機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。

（2）目鏡筒位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定目鏡插在其上。根據有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據瞳距的調節方式不同，可分為鉸鏈式和平移式。

（3）物鏡轉換器它是一個旋轉圓盤，上有3～5個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉動物鏡轉換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。

（4）載物臺是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。

（5）調焦機構利用調焦手輪可以驅動調焦機構，使載物臺作粗調和微調的升降運動，從而使被觀察物體對焦清晰成像。

（6）聚光器調節機構聚光器安裝在其上，調節螺旋可以使聚光器升降，用以調節光線的強弱。

顯微鏡的基本結構（1）機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂8光學顯微鏡的分類光學顯微鏡的分類

光學顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。

光學顯微鏡的分類光學顯微鏡的分類

光學顯微鏡有多種分類方法：9明場觀察微分干涉襯DIC浮雕相襯RC相襯（相差）明場觀察微分干涉襯DIC浮雕相襯RC相襯（相差）10暗場觀察熒光觀察偏光觀察暗場觀察熒光觀察偏光觀察11熒光顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的構成熒光顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的構成12激光共聚焦顯微鏡技術課件13熒光顯微鏡的基本結構和原理光源激發濾片、雙色反色鏡、阻斷濾片物鏡、目鏡熒光顯微鏡的基本結構和原理光源14汞燈光源:提供激發光(U、V、B、G)熒光顯微鏡光源氙燈光源：高峰值更寬，更穩定汞燈光源:熒光顯微鏡光源氙燈光源：15熒光激發塊鏡組A激發濾色鏡C吸收濾色鏡B分光鏡吸收濾色鏡激發濾色鏡分光鏡BT%AC熒光激發塊鏡組A激發濾色鏡吸收濾色鏡激發16熒光顯微鏡的分類透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現整個視場的均勻照明。

熒光顯微鏡的分類透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗17吸收光，必需有激發光源熒光波長＞激發波長（損失熱能）熒光強度極小于激發光的強度有不同程度的熒光衰減（光漂白）熒光強度取決于激發光強度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質吸收光，必需有激發光源熒光的性質18優點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進行多重染色用途：物體構造的觀察——熒光素熒光的有無、色調比較進行物質判別——抗體熒光等發熒光量的測定對物質定性、定量分析熒光顯微鏡的優點和用途優點：熒光顯微鏡的優點和用途19熒光顯微鏡的局限性對于厚的樣品【1um以上很難聚焦清楚】焦平面外有干擾信息靈敏度高、分辨率低熒光顯微鏡的局限性對于厚的樣品【1um以上很難聚焦清楚】20激光共聚焦顯微鏡的基本結構激光共聚焦顯微鏡主要是由以下及部分組成：電源及其穩壓系統、激光器、掃描器（包括檢測器）、熒光顯微鏡(裝有微量步進馬達）、光學裝置、計算機控制系統。激光共聚焦顯微鏡的基本結構激光共聚焦顯微鏡主要是由以下及部分21激光共聚焦顯微鏡技術課件22共聚焦顯微鏡系統優點可對固定或者活的細胞、組織切片進行連續斷層掃描，獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器、細胞膜等系統的三維圖像高水平分辨率普通顯微鏡 0.61λ/NA共聚焦顯微鏡 0.55λ/NA實時多通道熒光（熒光平衡）、透射DIC觀測數字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析離子濃度測定，即檢測細胞內鈉、鈣、鎂、pH等離子濃度及觀察其動態變化光譜功能光誘導功能熒光壽命成像功能活體多光子顯微觀察功能共聚焦顯微鏡系統優點可對固定或者活的細胞、組織切片進行連續斷23共聚焦系統v.s熒光顯微鏡Confocal是一種高級熒光顯微鏡照明光源：激光器－點光源；照明/掃描方式：點照明/點掃描；成像方式：點成像（高靈敏PMT）共聚焦原理：點光源、物點、像點時刻保持共軛焦距普通熒光顯微鏡照明光源：汞燈、氙燈－場光源；照明方式：面照明；成像方式：面成像（膠片，CCD）共聚焦系統v.s熒光顯微鏡Confocal是一種高級熒光24共聚焦顯微技術應用細胞生物學如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析；利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞與癌細胞的細胞骨架及其與核改變之間的關系；細胞黏附行為等生物化學如：酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、染色體基因定位等，利用共聚焦技術可以取代傳統的核酸印跡染交等技術，進行基因的表達檢測，使基因的轉錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確藥理學如：藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量分析生理學、發育生物學如：膜受體，離子通道，離子含量、分布與動態變化；動物發育以及胚胎的形成，干細胞的分化等；細胞膜電位的測量，熒光漂白后恢復（FRAP）的測量等共聚焦顯微技術應用細胞生物學如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結25共聚焦顯微技術應用遺傳學和組胚學如：細胞生長、分化，細胞的三維結構，染色體分析，基因表達，基因診斷等

神經生物學如：神經細胞結構，神經遞質的成分、運輸和傳遞微生物學和寄生蟲學如：細菌、寄生蟲形態結構病理學及病理學臨床應用如：活檢標本的快速診斷，腫瘤診斷，自身免疫性疾病的診斷免疫學、環境醫學和營養學如：免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布，兩種以上蛋白的共存與共定位，蛋白與細胞器的共定位，動態實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達等共聚焦顯微技術應用遺傳學和組胚學如：細胞生長、分化，細胞的26激光共聚焦顯微鏡技術吉林大學人獸共患病研究所王心蕊激光共聚焦顯微鏡技術吉林大學人獸共患病研究所27緒論激光共聚焦顯微鏡技術（ConfocalLasersScanningMiccruscopeCLSM)CLSM是將顯微鏡技術與激光技術有效的結合，使用紫外或可見光激發熒光探針，對有熒光標記物的形態及功能，利用計算機進行成像，從而得到細胞或內部微細結構的熒光圖像。它匯集了激光技術，顯微鏡技術，免疫熒光技術，計算機及圖像處理技術，精密的機械技術等高，精，尖細胞分析及工程技術于一體的新技術。緒論28激光共聚焦顯微鏡發展史在1957年MarvinMinsky提出共聚焦顯微鏡的理論，但共聚焦顯微鏡作為商品推出是在20世紀80年代初期，早期的激光共聚焦顯微鏡在技術上很不完善，其應用也受到限制。至到20世紀80年代末，光學系統設計不斷改進，成像的質量和靈敏度都有所提高，進入90年代初，激光共聚焦顯微鏡系統中逐步引入混合激光和紫外激光技術。90年代末由美國Meridian公司推出的新型激光共聚焦顯微鏡系統，已具備完善的光學系統，模塊化的儀器設計，靈活的軟件和高配置的計算機硬件，從而使共聚焦顯微鏡系統的功能不斷升級，應用的領域不斷擴展。隨著生命科學研究的不斷深入及熒光探針技術的迅速發展，共聚焦顯微鏡將推動生命科學研究的迅速發展，同時生命科學研究的進展也將使激光顯微鏡技術不斷改進和完善。激光共聚焦顯微鏡發展史在1957年MarvinMinsky29激光共聚焦顯微鏡的特點激光共聚焦顯微鏡是現今最為先進的光學顯微鏡，其主要優點為：以激光為光源，在相應的熒光探針標記后，對樣本進行逐點掃描，逐層獲得二維光學橫斷面圖像，具有“細胞CT”的功能，并可通過計算機三維重建軟件支持，獲得真三維圖像，并可以任意角度旋轉，觀察細胞，組織的立體形態和空間關系；可以對活細胞和組織進行無損傷的觀察，動態測量細胞內的Ca離子濃度和pH值等活細胞生理信息；可對細胞膜的流動性，細胞間通訊，細胞融合，細胞骨架彈性測量等，可用作“光刀子”完成細胞內“外科手術”。這一技術使得對活細胞和組織進行原位，動態，定量的觀察和測量的夢想成為現實。激光共聚焦顯微鏡的特點激光共聚焦顯微鏡是現今最為先進的光學顯30光學顯微鏡顯微鏡的基本原理普通顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的基本結構和原理激光共聚焦顯微鏡基本結構和原理光學顯微鏡顯微鏡的基本原理普通顯微鏡的基本結構和原理31顯微鏡的基本結構光學系統機械裝置顯微鏡的基本結構光學系統32顯微鏡的基本結構光學系統（1）目鏡有一組透鏡組成目鏡，可以使物鏡成倍地分辨、放大物像，例如10X、15X等。按照所能看到的視場大小目鏡可分為：普通目鏡；廣角目鏡兩種（2）物鏡它安裝在轉換器的孔上，也是由一組透鏡組成的，能夠把物體清晰地放大。物鏡上刻有放大倍數，主要有10X、20X、40X、60X、100X等（3）光源有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。（4）聚光器包括聚光鏡、孔徑光闌。聚光鏡由透鏡組成，它可以集中透射過來的光線，使更多的光能集中到被觀察的部位?？讖焦怅@可控制聚光器的通光范圍，用以調節光的強度。

顯微鏡的基本結構光學系統33顯微鏡的基本結構（1）機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂。

（2）目鏡筒位于機架上方，靠圓形燕尾槽與機架固定目鏡插在其上。根據有否攝像功能，可分為雙目鏡筒和三目鏡筒；根據瞳距的調節方式不同，可分為鉸鏈式和平移式。

（3）物鏡轉換器它是一個旋轉圓盤，上有3～5個孔，分別裝有低倍或高倍物鏡鏡頭。轉動物鏡轉換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路。

（4）載物臺是放置玻片的平臺，其中央具有通光孔。臺上有一個彈性的標本夾，用來夾住載玻片。右下方有移動手柄，使載物臺面可在XY雙方向進行移動。

（5）調焦機構利用調焦手輪可以驅動調焦機構，使載物臺作粗調和微調的升降運動，從而使被觀察物體對焦清晰成像。

（6）聚光器調節機構聚光器安裝在其上，調節螺旋可以使聚光器升降，用以調節光線的強弱。

顯微鏡的基本結構（1）機架顯微鏡的主體部分，包括底座和彎臂34光學顯微鏡的分類光學顯微鏡的分類

光學顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學原理可分為偏光、相襯和微差干涉對比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紫外光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、數碼（攝像）顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、熒光顯微鏡等。

光學顯微鏡的分類光學顯微鏡的分類

光學顯微鏡有多種分類方法：35明場觀察微分干涉襯DIC浮雕相襯RC相襯（相差）明場觀察微分干涉襯DIC浮雕相襯RC相襯（相差）36暗場觀察熒光觀察偏光觀察暗場觀察熒光觀察偏光觀察37熒光顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的構成熒光顯微鏡的基本結構和原理熒光顯微鏡的構成38激光共聚焦顯微鏡技術課件39熒光顯微鏡的基本結構和原理光源激發濾片、雙色反色鏡、阻斷濾片物鏡、目鏡熒光顯微鏡的基本結構和原理光源40汞燈光源:提供激發光(U、V、B、G)熒光顯微鏡光源氙燈光源：高峰值更寬，更穩定汞燈光源:熒光顯微鏡光源氙燈光源：41熒光激發塊鏡組A激發濾色鏡C吸收濾色鏡B分光鏡吸收濾色鏡激發濾色鏡分光鏡BT%AC熒光激發塊鏡組A激發濾色鏡吸收濾色鏡激發42熒光顯微鏡的分類透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗視野聚光鏡，使激發光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調中時，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。落射式：透射式目前幾乎被淘汰，新型的熒光顯微鏡多為落射式，光源來自被檢物體的上方，在光路中具有分光鏡，所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實現整個視場的均勻照明。

熒光顯微鏡的分類透射式：激發光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗43吸收光，必需有激發光源熒光波長＞激發波長（損失熱能）熒光強度極小于激發光的強度有不同程度的熒光衰減（光漂白）熒光強度取決于激發光強度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質吸收光，必需有激發光源熒光的性質44優點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激小（可以活體染色）能進行多重染色用途：物體構造的觀察——熒光素熒光的有無、色調比較進行物質判別——抗體熒光等發熒光量的測定對物質定性、定量分析熒光顯微鏡的優點和用途優點：熒光顯微鏡的優點和用途45熒光顯微鏡的局限性對于厚的樣品【1um以上很難聚焦清楚】焦平面外有干擾信息靈敏度高、分辨率低熒光顯微鏡的局限性對于厚的樣品【1um以上很難聚焦清楚】46激光共聚焦顯微鏡的基本結構激光共聚焦顯微鏡主要是由以下及部分組成：電源及其穩壓系統、激光器、掃描器（包括檢測器）、熒光顯微鏡(裝有微量步進馬達）、光學裝置、計算機控制系統。激光共聚焦顯微鏡的基本結構激光共聚焦顯微鏡主要是由以下及部分47激光共聚焦顯微鏡技術課件48共聚焦顯微鏡系統優點可對固定或者活的細胞、組織切片進行連續斷層掃描，獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器、細胞膜等系統的三維圖像高水平分辨率普通顯微鏡 0.61λ/NA共聚焦顯微鏡 0.55λ/NA實時多通道熒光（熒光平衡）、透射DIC觀測數字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析離子濃度測定，即檢測細胞內鈉、鈣、鎂、pH等離子濃度及觀察其動態變化光譜功能光誘導功能熒光壽命成像功能活體多光子顯微觀察功能共聚焦顯微鏡系統優點可對固定或者活的細胞、組織切片進行連續斷49共聚焦系統v.s熒光顯微鏡Confocal是一種高級熒光顯微鏡照明光源：激光器－點光源；照明/掃描方式：點照