《抗生素與化學(xué)治療》美國(guó)微生物協(xié)會(huì)版權(quán)所有（中譯文初稿）抗病毒劑-愛力諾力克鈣的特異性約翰·海思茲，阿瑟·海厄，菲利普·卡爾英國(guó)伊利諾伊州厄巴納伊利諾伊大學(xué)微生物系61801愛力諾力克鈣是一種抗病毒刑，可抑制逆轉(zhuǎn)錄酶，雞胚胎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)還可抑制大腸桿菌菌株和枯草桿菌菌株。體外的藥劑抑制大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶以及其他一些酶。通常的DNA聚合酶鑒定成分，除了亞精胺外，對(duì)已觀察到的抑制性沒有影響。藥劑對(duì)DNA聚合酶II的抑制性看來是由于對(duì)酶直接的，不可逆轉(zhuǎn)的影響造成的。然而，大腸桿菌里的DNA合成并不比細(xì)胞團(tuán)的增長(zhǎng)更容易受藥劑的影響。這些結(jié)果表明愛力諾力克鈣是一種低特量抑制劑。愛力諾力克鈣是從經(jīng)過微酸催化的橄欖的汁液中分離出來的一種單帖，—種體外殺病毒刑，可以殺大量RNA和DNA病毒。它也會(huì)減少感染副流感病毒的倉鼠所攜帶病毒的生長(zhǎng)，應(yīng)用于動(dòng)物時(shí)，毒性很小。愛力諾力克鈣抑制莫洛尼氏白血病毒和勞舍爾氏白血病病毒的RNA依賴的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)，當(dāng)愛力諾力克鈣濃度為20ug/ml時(shí)，抑制率達(dá)到50％：此藥劑好象不會(huì)和核酸制劑或DNA或RNA發(fā)生反應(yīng)。經(jīng)證明，此藥劑直接抑制逆轉(zhuǎn)錄酶。在早期潛伏期，用2—M等量的氨基乙酸，離氨酸，半胱氨酸或組氨酸可以使此藥利滅活，用其他氨基酸則無效。要滅活此藥劑，必須有一個(gè)游離氨基酸組，然而，此藥劑在濃度高為200ug/ml，不會(huì)對(duì)埃希氏大腸桿菌RNA聚合酶或DNA聚合酶I起抑制作用。最近曾經(jīng)有過關(guān)于愛力諾力克酸的結(jié)構(gòu)和鹽酸甲基愛力諾力克的總合成的報(bào)道。我們需要判斷此藥劑是否抑制大腸桿菌DNA聚合酶11或III，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)酶在很多特性上部和這些酶非常相似。大腸桿菌酶的一種特定抑制劑可能對(duì)闡明細(xì)胞中這些酶的生理作用很有幫助。然而，兩種酶受到抑制的程度很相近，而且進(jìn)一步的研究表明此藥劑并非特效材料和方法材料：細(xì)胞培養(yǎng)皿是用獵鷹塑科做的。改良細(xì)胞培養(yǎng)液干粉，磷酸胰化蛋白稀釋液，小牛血清和雞血清是從格蘭德艾蘭生物化宇公司獲得的。[3H]胸腺嘧啶，7．OCi/mmol是從施瓦茨/曼購(gòu)買的。[3H]胸甘，5—三磷酸，50Ci/mmol購(gòu)自NewEnglandNuclear公司。小牛血清DNA(V型)是從西格瑪購(gòu)得的，將胰去氧核糖核酸水解晦(脫氧核糖核酸酶I)水解(渥新頓，EC3．1．4．5)以便使DNA聚合酶III獲得最大的活性。愛力諾力克鈣，項(xiàng)目9426—JHF2是卡拉麻組，米奇的美國(guó)普強(qiáng)公司獻(xiàn)給世人的一個(gè)豐厚的禮物。當(dāng)把此藥利以1：lOmg/ml的濃度溶于水中并冷凍保存時(shí)，它可以通過反復(fù)的凍結(jié)和融化維持至少兩個(gè)月的穩(wěn)定性：細(xì)菌的滋長(zhǎng)：大腸桿菌菌株W3110(thyA36和dra-2)和D)10(polAl，endA—，thyA36和dra—2)是從美國(guó)康乃秋克州的紐哈芬市的大腸桿菌基因庫中心獲得的。尤金內(nèi)斯特分離出來的枯草桿菌原養(yǎng)型菌株WB746是從薩穆爾．卡普蘭處獲得的。細(xì)菌生長(zhǎng)在M9基本培養(yǎng)基中，并補(bǔ)充以0．2％葡萄糖，lmm無水硫酸鎂和每毫升4ug胸腺嘧啶：平板培養(yǎng)基可以用1.5％的瓊脂(Difco)來使之凝固。細(xì)胞團(tuán)是光學(xué)密度在為450nm時(shí)由ZeissPMQll分光尤度計(jì)確定的。總的細(xì)胞數(shù)是通過在Petroff-Hauserchamber記數(shù)200別400個(gè)細(xì)胞來確定的。成活細(xì)胞的數(shù)量是通過適當(dāng)稀釋以后用M9瓊脂作為平板來確定的：DNA合成是通過把[H]胸腺嘧啶包含列不溶酸含量中去水測(cè)定的。雞胚胎成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng):主要的雞胚胎成纖維細(xì)胞，正如前面所描述的那樣，是用十天大的雞胚胎準(zhǔn)備的。這些細(xì)胞經(jīng)過在38℃下四五天的生長(zhǎng)，從細(xì)胞培養(yǎng)皿中被移出，浸泡在有0．05％胰蛋白酶的三羥甲基氨基甲烷，三羥甲基鹽酸(25mM三羥甲基鹽酸[pH7．3]，140mM氯化鈉，5mM氯化鉀和0．7mM磷酸二氫鈉)中并置于10個(gè)細(xì)胞/35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。細(xì)胞被培植在41℃的含10％磷酸胰化蛋白稀釋液，4％小牛血清和1％的遇熱處理使之不活化的雞血清的改良細(xì)胞培養(yǎng)液中。所有的實(shí)驗(yàn)在于皿接種24小時(shí)后開始。細(xì)胞的增長(zhǎng)速度是在把細(xì)胞用三羥甲基鹽酸中的0．25％的胰蛋白酶和0．1％葡萄糖從培養(yǎng)皿中移走后通過顆粒計(jì)數(shù)器來測(cè)定的。錐蟲藍(lán)和0．9％的鹽水被攝取用來估計(jì)細(xì)胞的成活率。在幾次實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞是用胰化蛋白緩和的鹽水沖洗的，此鹽水中含有140mM氯化鈉，5．4mM磷酸二氫鈉，5mM氯化鉀，1.8mM氯化鈣，lmM磷酸二氫鈉，0．

酶的抑制性研究

雞的蛋白溶菌酶(A等，EC2．3．1.17)是從西格瑪購(gòu)進(jìn)的。內(nèi)切核酸酶(NFCP，EC3．1．4．7)和胰臟脫氧核糖核酸酶{(DPFF，EC3．1．4．5)是從渥新頓購(gòu)得的。將這些濃度為40—50ugml的酶在37℃下暴露于5mM三羥甲基鹽酸中的酸堿度為8．0的愛力諾力克鈣半個(gè)小時(shí)，然后按照供應(yīng)商所描述的進(jìn)行鑒定。將大腸桿菌DNA聚合酶II用Kornberg和Geftcr的方法進(jìn)行提純，緊接著是透析，磷酸纖維素層析法和葡聚糖凝膠G—100凝膠過濾法。這種酶有125Ums的最終比活度，并按Ottoet．a(chǎn)l所推薦的進(jìn)行儲(chǔ)存。DNA聚合酶II的標(biāo)準(zhǔn)鑒定含(0．3ml—體積)：33mM三醋酸緩和物(酸堿度7．2，30℃)，50mM氯化鉀，16．7mM二硫蘇糖醇，13．3mM氯化鎂，280uM(核苷酸)經(jīng)過脫氧核糖核酸酶水解過的小牛胸腺DNA，33uM(每個(gè))脫氧腺苷三磷酸二鈉，deoxyeytosine三磷酸二鈉，脫氧胞苷酸和[3H]脫氧胸苷三磷酸二鈉(150counts/min每毫克蛋白)，大約0．7ug酶(通過假定270U/mg比活度的制劑的純度很高來估箅的)和愛力諾力克鈣的濃度。37℃下的潛伏時(shí)間為30分鐘，參入核甘酸的不溶酸產(chǎn)品用前面所描述的方法測(cè)量。DNA聚合酶III全酶的原提取液是按照Wickner和Kornberg所描述的進(jìn)行準(zhǔn)備的，培植在M9中，并輔以1％的葡萄糖和0．2％的酸水解酪素(Difco)3．5X108／m1。DNA聚合酶III全酶的標(biāo)準(zhǔn)鑒定包含(0．3ml體積)：33mMmoroholinopropane磺酸氫氧化鉀緩和物(酸堿度7．0)，16．7mM二硫蘇糖醇，6．7mM氧化鎂，5mM氯化鈉，1．4mM(核苷酸)經(jīng)過脫氧核糖核酸酶水解過的小牛胸腺DNA，1.3mM腺苷三磷酸二鈉，0．15mg/每毫升大腸桿菌磷脂質(zhì)，133uM脫氧腺苷三磷酸二鈉，deoxycytoslne三磷酸二鈉，脫氧胞苷酸和[3結(jié)果

酶抑制性的光譜:如圖表l中所示，愛力諾力克鈣對(duì)大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶有抑制作用。和以前發(fā)表的報(bào)導(dǎo)相一致的是，控制實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)沒有出示)表明愛力諾力克鈣對(duì)DNA聚合酶II的抑制性不受任何一個(gè)DNA聚合酶II或DNA聚合酶III全酶鑒定因素的影響，除了亞精胺外，這一結(jié)果沒有用于DNA聚合酶III全酶在提取液中活性情況的測(cè)定，因此，這兩種酶在易受影響狀況方面的明顯差異不能用二者在酶鑒定方面的差異來解釋。

愛力諾力克鈣對(duì)DNA聚合酶II活動(dòng)性的抑制作用，不能通過增加DNA，脫氧核(糖核)苷三磷酸鹽或鎂的濃度來克服，但是可以通過增加酶的濃度來克服(圖表1)。因此，抑制性看來是針對(duì)酶自身的。而且，愛力諾力克鈣對(duì)DNA聚合酶II的抑制作用看來是不可逆轉(zhuǎn)的(圖表1)。將DNA聚合酶II在37℃

圖1

愛力諾力克鈣對(duì)幾種酶的抑制作用。在無藥劑的情況下所觀察列的酶的活動(dòng)被視為100％。

符號(hào)：△微球菌核酸酶；○雞的蛋白溶菌酶；●大腸桿菌DNA聚合酶II；□大腸桿菌DNA聚合酶III全酶；▲胰臟脫氧核糖核酸酶,圖表l影響愛力諾力克鈣對(duì)DNA聚合酶抑制作用的因素指數(shù)條件觀察到的抑制性（%）標(biāo)準(zhǔn)鑒定條件42把DNA濃度增加五倍到1.4mM40把脫氧核（糖核）酸苷三磷酸鹽的濃度增加到每個(gè)133uM42把鎂的濃度稀釋四倍到3.3mM39把酶的濃度增加四倍27把酶的濃度增加十倍18將酶在37℃66

此圖表表明了DNA聚合酶II的標(biāo)準(zhǔn)鑒定以及200ugml的愛力諾力克鈣的抑制活動(dòng)。鑒定配合比中愛力諾力克鈣的最終濃度為17ug/ml，對(duì)DNA聚合酶II的抑制作用微乎其微(表1)。然而，在此次實(shí)驗(yàn)中，和暴露于水相比，DNA聚合酶II在暴露于愛力諾力克鈣時(shí)受列更強(qiáng)烈的抑制，這表明暴露于500ug/ml的愛力諾力克鈣的影響是不可逆轉(zhuǎn)的。

表l還表明了愛力諾力克鈣對(duì)其他幾種酶活動(dòng)的影響。盡管胰臟脫氧核糖核酸酶I僅僅在藥劑配制為高濃度時(shí)才受到輕微的抑制，溶菌酶和微球菌核酸酶較之DNA聚合酶II更易受到愛力諾力克鈣的抑制。實(shí)際上，微球菌核酸酶，50％的活動(dòng)性在濃度為2ug／ml時(shí)受到抑制，受藥劑影響的程度是濾過性毒菌逆轉(zhuǎn)酶的10倍。

大腸桿菌體內(nèi)靶的抑制性

對(duì)大腸桿菌里的DNA復(fù)制至關(guān)重要的DNA聚合酶III受到了愛力諾力克鈣的抑制，因此我們想確定大腸桿菌里的DNA合成是不是首先受到體內(nèi)愛力諾力克鈣的抑制。早期的實(shí)驗(yàn)表明枯草桿菌WB746和大腸桿菌w3110的生長(zhǎng)受到了愛力諾力克鈣的抑制。因此我們就愛力諾力克鈣對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)物的指數(shù)增長(zhǎng)進(jìn)行了觀察(表2)。表2A是對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，表明這些細(xì)胞在快速平衡地增長(zhǎng)，就象所有參數(shù)的平行增長(zhǎng)所表明的一樣。

表2B表明200ug/ml(0．75mM)的愛力諾力克鈣的作用。此藥劑在這個(gè)濃度表現(xiàn)為抑制菌，因?yàn)樵诒┞队诖怂巹?0分鐘后，所有的參數(shù)從60分鐘倍增時(shí)間平行變?yōu)?5分鐘倍增時(shí)間。值得注意的是，即使在此藥劑濃度對(duì)此菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生很小影響的時(shí)候，DNA合成看起來比細(xì)胞團(tuán)的增氏更容易受到抑制。

表2C表明500ug/ml(1.88mM)的愛力諾力克鈣的影響。在暴露于此藥劑20分鐘后，DNA合成，細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)全部停止了。此藥劑在這個(gè)濃度上看起來是一種高抑制菌，因?yàn)樵谔砑恿舜怂巹┖螅苫罴?xì)胞的數(shù)量大幅度下降。

愛力諾力克鈣對(duì)雞胚胎成纖維細(xì)胞的影響。據(jù)報(bào)導(dǎo)，濃度為200ug/m1的愛力諾力克鈣對(duì)培養(yǎng)液中的鼠胚胎成纖維細(xì)胞無毒性：我們發(fā)現(xiàn)配制為此濃度的藥劑減緩了大腸桿菌的生長(zhǎng)速度，同時(shí)也對(duì)大量體外酶起到了抑制了作用。因?yàn)閻哿χZ力克鈣會(huì)受到細(xì)胞培養(yǎng)液中氨圣酸的滅活，我們?cè)趲状尾煌膶?shí)驗(yàn)條件下對(duì)此藥劑對(duì)培養(yǎng)液中雞胚胎成纖維細(xì)胞的影響進(jìn)行了調(diào)查(圖表2)。這些細(xì)胞用磷酸生理食鹽水沖洗以去除培養(yǎng)液中的氨基酸后，暴露于磷酸生理食鹽水中的愛力諾力克鈣20分鐘，配制為500ugml濃度的藥劑土觀出毒性，而200ug/ml濃度的藥劑大幅度減緩了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度：配制的濃度為50ug/rnl的藥劑對(duì)生長(zhǎng)速度則無任何影響。然而，正如圖表2中所示，愛力諾力克鈣對(duì)雞胚胎成纖維細(xì)胞的影響在很大程度上依賴于培養(yǎng)液和暴露于此藥劑的時(shí)間的長(zhǎng)短。即使采用最溫和的實(shí)驗(yàn)條件(在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中暴露30分鐘)生長(zhǎng)速度也會(huì)受到200ug／ml的愛力諾力克鈣的輕微抑制。

表2:愛力諾力克鈣對(duì)在27℃下在M9培養(yǎng)液中的大腸桿菌W3110的指數(shù)增K的影響。按照箭頭所指的時(shí)間，[3討論

這些有關(guān)愛力諾力克鈣的研究表明此藥劑抑制大腸桿菌菌株和枯草桿菌菌株的生長(zhǎng)。此藥劑對(duì)體外大腸桿菌DNA聚合酶II和DNA聚合酶III全酶具有抑制作用。酶在受影響程度方面的細(xì)微差別不能用酶在鑒定條件方面的差別來解釋，但是可以反映出在酶制劑純度方面的一些差別，因?yàn)榇怂巹┧坪鯇?duì)DNA聚合酶II會(huì)起直接的不可逆轉(zhuǎn)的化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)抑制幾種不相關(guān)的酶。愛力諾力克鈣似乎并不是起著一種傳導(dǎo)阻滯硫基劑的作用，但是會(huì)被氨基酸和亞精胺滅活。此藥劑似乎會(huì)和自由氨基起化學(xué)反應(yīng)。盡管DNA聚合酶II和III會(huì)受到體外愛力諾力克鈣的抑制，大腸桿菌里的DNA合成并不比細(xì)胞團(tuán)的增氏更容易受到此藥劑的影響。這些觀察表明大腸桿菌里愛力諾力克鈣的主要作用可能是通過與自由氨基和蛋白質(zhì)的共價(jià)反應(yīng)宋抑制生長(zhǎng)。圖表2愛力諾力克鈣對(duì)雞胚胎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響指數(shù)愛力諾力克鈣（g/ml）倍增時(shí)間率（實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液/對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液）1501.00

2003.67

500—b22001.14

5001.213d2001.71

5004.00

a細(xì)胞用磷酸生理食鹽水沖洗兩次并在磷酸生理食鹽水中暴露于此藥劑20分鐘，然后再在調(diào)濕的介質(zhì)加入之前用磷酸生理食鹽水洗兩次。

b經(jīng)過五天的時(shí)間，細(xì)胞數(shù)量有輕微的下降。在暴露于此藥劑12小時(shí)后，90%多的細(xì)胞滲透到錐蟲藍(lán)中。

c細(xì)胞暴露于在生長(zhǎng)液中的此藥劑30分鐘，然后再在調(diào)濕的介質(zhì)加入之前用磷酸生理食鹽水洗一次。

D細(xì)胞不斷地暴露于培養(yǎng)液中的次藥劑。

愛力諾力克鈣也會(huì)影響雞胚胎成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)速度．影響的程度依賴于藥劑的濃度和實(shí)驗(yàn)條件。我們的結(jié)果表明當(dāng)我們檢查愛力諾力克鈣的抗病毒效果的時(shí)候，必須十分小心，因?yàn)椴粌H很多酶有可能被抑制，而且培養(yǎng)液中的細(xì)胞自身有可能受到藥劑的影響，這取決于藥劑的濃度和實(shí)驗(yàn)的原始記錄。

愛力諾力克鈣看來是一種低特量抑制劑。它看起來只和一定氨基酸的氨基發(fā)生反應(yīng)，