干擾素藥學院張倩倩1interferon(IFN)

干擾素藥學院1interferon(IFN)1病毒感染后的機體反應干擾素及白介素自然殺傷細胞T細胞免疫非特異性免疫特異性免疫病毒感染后的機體反應干擾素及白介素自然殺傷細胞T細胞免疫非特2

一干擾素的概念二干擾素的種類三干擾素的作用四干擾素抗病毒機理五生物學活性一干擾素的概念二干擾素的種類三3

一干擾素的概念概念：

干擾素（IFN）是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒反應，而產生的一組結構類似，功能相近的低分子糖蛋白。一干擾素的概念概念：4

二干擾素的種類二干擾素的種類5

三干擾素的作用一、Ⅰ型干擾素

（1）抗病毒和抗腫瘤1）誘導宿主細胞產生抗病毒蛋白，干擾病毒復制；2）增強NK細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞殺傷；3）促進MHC-Ⅰ類分子表達，增強CTL對病毒感染細胞和腫瘤等靶細胞的殺傷。

（2）免疫調節（較弱）：與Ⅱ型干擾素類似。三干擾素的作用一、Ⅰ型干擾素6

三干擾素的作用二、Ⅱ型干擾素（1）主要起免疫調節作用1）活化巨噬細胞；2）促進APC(s)表達MHC-Ⅱ類分子，提高抗原遞呈能力；3）促進MHC-Ⅰ類分子表達和增強CTL細胞的殺傷活性;4）增強NK細胞的殺傷活性；5）促進B細胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗腫瘤作用(與Ⅰ型干擾素類似，次要)。三干擾素的作用二、Ⅱ型干擾素7T細胞巨噬細胞B細胞粒細胞IFNNK細胞內皮細胞T細胞lNK細胞激活提高NK細胞活性抗病毒活性抑制細胞分裂抑制血細胞生成促進MHCⅠ和MHCⅡ分子表達多種細胞干擾素的作用T細胞巨噬細胞B細胞粒細胞IFNNK細胞內皮細胞T細胞8

四干擾素抗病毒機理最初感染的細胞由于病毒核酸剌激被誘導產生干擾素，它透過細胞膜向外擴散并進入血液循環進入其它細胞。干擾素不能直接阻止病毒吸附、穿入或釋放，而是作用于宿主細胞，使其產生抗病毒蛋白質，附著于細胞的核蛋白體上，選擇性地抑制病毒mRNA翻譯為病毒蛋白質，從而影響病毒結構蛋白和酶類的合成，使復制受到阻礙而呈現抗病毒的作用。四干擾素抗病毒機理最初感染的細胞由于病毒核酸剌激9

四干擾素抗病毒機理干擾素具有廣譜抗病毒作用，又具有細胞種屬特征。即某一種動物產生的干擾素只能保護同種屬或近緣種屬動物細胞。干擾素是一種活性很強的生物制劑，既能治療病毒性疾病，又具有抗腫瘤和調節免疫機能的作用。四干擾素抗病毒機理干擾素具有廣譜抗病毒作用，又具10四干擾素抗病毒機理四干擾素抗病毒機理11干擾素抗病毒作用干擾素抗病毒作用12作用機理 不是直接殺滅病毒IFN→

抗病毒蛋白基因→抗病毒蛋白(蛋白激酶,磷酸二脂酶)

↓ 降解病毒mRNA

抑制病毒蛋白合成抑制病毒組裝、釋放

↓

抑制病毒復制

中斷病毒感染；限制病毒擴散

↓作用機理 不是直接殺滅病毒IFN→抗病毒蛋白基因→13五生物學活性:廣譜的抗病毒作用，一種IFN可以抑制多種病毒；抑制病毒感染、阻止病毒在體內擴散、促進痊愈;調節免疫功能；抑制腫瘤細胞生長；五生物學活性:廣譜的抗病毒作用，一種IFN可以抑制多種14

IFN作用特點:產生的時間早；中斷受染細胞的病毒感染，限制病毒擴散；IFN誘導的抗病毒蛋白，只對病毒起作用，不影響宿主細胞蛋白質合成。

IFN作用特點:產生的時間早；15

謝謝謝謝16

17

18專題二抗體制藥第一節概述第二節單克隆抗體第三節基因工程抗體第四節噬菌體抗體工程第五節抗體診斷試劑和抗體藥物19專題二抗體制藥第一節概述1919第一節概述

1890年Behring和北里柴三郎發現白喉抗毒素,建立了血清療法,開創了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。20第一節概述2020抗體工程藥物的概念通過細胞工程或基因工程方法制備，用于治療的單克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體，以及抗體免疫偶聯物或抗體融合蛋白,稱為抗體工程藥物。又稱抗體藥物、單克隆抗體治療劑、抗體治療劑。抗體工程藥物的概念通過細胞工程或基因工程方法制備，用于治療的21抗原(antigen,Ag)---是指那些能夠刺激和/或誘導機體免疫系統發生免疫應答、產生抗體和/或致敏（效應）淋巴細胞，同時又能與免疫應答產物在體內外特異性結合，發生免疫反應的物質。如：病原微生物、免疫血清、藥物、疫苗對機體來說，抗原相當于一個國家已知的或潛在的、外部的或內部的“敵人”。抗原(antigen,Ag)2223免疫原性：指能刺激機體產生抗體和/或致敏淋巴細胞的性能。

反應原性：能與相應的抗體和/或淋巴細胞發生特異性結合，發生反應的性能。

23免疫原性：指能刺激機體產生抗體和/或致2324完全抗原：既具有免疫原性，又具有反應原性的抗原。如微生物、異種血清半抗原：又稱不完全抗原。是指其本身只有反應原性，但沒有免疫原性的簡單小分子的抗原物質。如某些藥物（青霉素等）、多糖、類脂。24完全抗原：既具有免疫原性，又具有反應原性的抗原。如微生物2425目前，在中草藥中發現廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，具有生化活性基因的化學成分都有可能成為半抗原，這些半抗原可與體內蛋白質結合成完全抗原，造成一些過敏反應。25目前，在中草藥中發現廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、2526抗原的特異性既表現在免疫原性上，也表現在反應原性上。沙門氏桿菌大腸桿菌抗大腸桿菌的抗體抗沙門氏桿菌的抗體結合結合26抗原的特異性既表現在免疫原性上，也表現在反應原性上。沙門26抗體是對其抗原有極強專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉印法檢測

特定抗原醫療 以毒素連結抗體攻擊

病變細胞檢驗 以ELISA偵測特定

病原體27抗體是對其抗原有極強專一性的研究 以免疫轉印法檢測特27免疫球蛋白的結構抗體：能與相應抗原特異性結合的具有

免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白的結構抗體：能與相應抗原特異性結合的具有28抗體的產生過程：

機體免疫系統受抗原物質刺激后，B淋巴細胞被激活，增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。抗體的產生過程：29

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范圍從150,000到950,000道爾頓。分五類：IgG在血清中含量最高，達75~80%,是抗感染的主要抗體;IgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為五聚體,是對一個抗原作出反應時產生的

第一個抗體；IgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參與局部的免疫反應;IgD在血清中含量很低;IgE在血清含量最少。免疫球蛋白IgGIgMIgAIgDIgE免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子30動物血清中產生抗體的時間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，IgＧ將取代IgM動物血清中產生抗體的時間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生31抗體研究的發展階段：①以1890年Behring發現白喉抗毒素為代表,用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體。②以1975年Milstein&Kohler創建雜交瘤技術制備單克隆抗體(McAb)為代表。③以1994年Winter,創建了噬菌體抗體庫(repertoireofantibodiesdisplayedonphages)技術,以基因工程方法制備抗體為代表。在此基礎上發展成抗體工程。抗體研究的發展階段：32多克隆抗體:

一種抗原具有多個抗原決定簇,每個抗原決定簇都能刺激一個B細胞產生一種抗體。這樣所獲得的免疫血清是多種抗體的混和物。單克隆抗體(MonoclonalantibodyMcAb):

由一個抗原決定簇刺激的、單一的B細胞和骨髓瘤細胞融合增殖后所產生的、高度均一的抗體。1234多克隆抗體:123433多克隆抗體和單克隆抗體PuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234BcellPuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234Bcell多克隆抗體和單克隆抗體PuresingleAbAfter34用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定。用于臨床治療，如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體制備導向藥物。但是要解決以下兩個問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。單克隆抗體的應用35用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關的抗35基因工程技術為解決這兩個問題提供了可能。1984年：人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結合試劑。已通過基因工程技術，制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子質量只有完整抗體分子的1/80~1/3，而且消除了鼠源性單克隆抗體的生物學活性如激活補體、促進吞噬功能（免疫調理）、抗體依賴細胞介導的細胞毒作用等，只保留同抗原特異性結合的活性。36基因工程技術為解決這兩個問題提供了可能。3636第二節單克隆抗體

McAb是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產生的，故稱為單克隆抗體。第二節單克隆抗體McAb是將抗體產生細胞與具有37注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養篩選，繼續培養足夠數量的、能產生特定抗體的細胞群體外培養（注射到小鼠腹腔）體內培養單克隆抗體注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培38傳統抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結B細胞多克隆抗體制備過程傳統抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾391234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開單克隆抗體制備過程1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+各抗401、抗原與動物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動物：BALB/c小鼠或Lou大鼠免疫方法：體內免疫和體外免疫2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養基本方法：取適量脾細胞（1*108）與骨髓瘤細胞（2*107~3*107）進行混合，在PEG作用下誘導它們融合，時間控制在2min以內，然后用培養液將PEG融合液緩慢稀釋1、抗原與動物免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原2、細胞融合41用于細胞融和的骨髓瘤細胞應具備融和率高，自身不分泌抗體，所產生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩定等特點。

PEG的相對分子質量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對分子質量4000為佳。相對分子質量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內的PEG都能使細胞發生融合。為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。用于細胞融和的骨髓瘤細胞應具備融和率高，自身不42（1）細胞融合液中的細胞類型：4或5種。（2）如何去除脾-瘤以外的融和細胞？HAT培養基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA（1）細胞融合液中的細胞類型：4或5種。HAT培養基：43HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻雜交瘤細胞：長期生長繁殖；利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNAHAT選擇作用：443、篩選陽性克隆與克隆化常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養液。軟瓊脂法：在培養液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養基是半固體狀態，可用吸管吸出，移入96孔板培養。3、篩選陽性克隆與克隆化常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊45培養板培養板46（1）免疫酶技術原理：將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合的技術。酶與抗體或抗原結合后，既不改變抗體或抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性，在相應而合適的作用底物參與下，使基質水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變為有色的氧化型，從而表明某種抗原或抗體的存在。

（1）免疫酶技術47細胞-干擾素醫學課件-48（2）免疫熒光技術原理：將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體（或抗原）結合，然后將熒光素標記的抗體或抗原作為標準試劑，用于檢測和鑒定抗原或抗體。

免疫熒光技術用于細胞抗原的抗體檢測,特別是檢測患者活檢組織標本。（2）免疫熒光技術原理：49細胞-干擾素醫學課件-50（3）放射免疫技術原理：將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。放射免疫測定原理示意圖（3）放射免疫技術原理：將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應514、單抗檢測RIA（放射免疫測定）ELISA（酶聯免疫吸附試驗）FACS（流式細胞儀）IFA（間接免疫熒光法）4、單抗檢測RIA（放射免疫測定）52酶聯免疫吸附法(ELISA)原理：先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，再將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發生反應，用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離的未結合成分，最后加入酶反應底物，根據底物被酶催化產生的顏色及其吸光度(A)值的大小進行定性或定量分析的方法。酶聯免疫吸附法(ELISA)原理：先將抗體或抗原包被到某種固53ELISAELISA54配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇5、雜交瘤細胞的凍存與復蘇細胞冷凍的意義：防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍55經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。6、單克隆抗體的大量制備經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大56可獲得10μg/ml的抗體。多采用RPMI1640培養液，添加10%~20%胎牛或小牛血清。但由于培養液中含有血清成分，總蛋白量可達100μg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發生支原體污染的原因，而且批間質量差異太大，直接影響雜交瘤細胞的生長。改良的方法有：無血清培養法、懸浮培養法、微載體懸浮培養法。無血清培養法：利用白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產量不高。懸浮培養法：連續懸浮培養的細胞密度可2*107/ml,收集的單克隆抗體可達400μg/ml。如在培養液中加入微載體，細胞密度可達108。（1）體外培養法：可獲得10μg/ml的抗體。多采用RPMI1640培養液，57基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細胞沉淀，取上清液凍存。優點：操作簡便，比較經濟，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株。缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。（2）動物體內誘生法可獲得10μm/ml的抗體。常用方法。基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPrist58腹腔注射法腹腔注射法597、單克隆抗體的純化根據Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法：體外診斷試劑IgG類-----沉淀處理+親和層析

IgM類------沉淀處理+凝膠過濾體內診斷試劑或治療用藥-----親和層析+陰離子交換層析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。7、單克隆抗體的純化根據Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化60鹽析沉淀親和層析離子交換層析

McAb的純化鹽析沉淀McAb的純化618、單克隆抗體的性質鑒定Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot8、單克隆抗體的性質鑒定Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELI62單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復性弱凝集反應和不呈現沉淀反應對環境敏感性單克隆抗體的特性高度特異性63A、McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內可產生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應，在人體內的半衰期只有5~6h，維持有效藥物作用靶組織時間；B、完整的抗體分子的相對分子質量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。McAb在免疫導向療法中存在的問題（障礙）：A、McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內可產生人抗鼠抗體（H64A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相對分子質量需要解決的問題：解決問題的方法或途徑—基因工程技術

1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質量只有完整抗體分子的1/80~1/3。A、降低McAb的免疫源性；需要解決的問題：解決問題的方法或65優點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療單克隆抗體的優點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體制備技術復雜、費時費工、價格較高優點：單克隆抗體的優點與局限性局限性：66中國人源基因工程抗體研究獲重大成果

中國預防醫科院病毒所青年科學家梁米芳研究員率領的課題組，在“治療用人源基因工程抗體基礎與應用研究”中取得多項重要成果。在世界上首先研制成功抗坦病毒、抗甲肝病毒、抗狂犬病毒人源基因工程抗體，并獲得擁有自主知識產權的全抗體表達載體系統。與血源制品比較，此抗體具有抗體含量高、無免疫源性、無污染源、可連續規模生產等優勢，是一類新興的特異性抗病毒感染的生物工程藥物。此成果為我國防治病毒性疾病探索出一條新的途經，具有良好的應用開發前景。

-2004中國人源基因工程抗體研究獲重大成果中國預防醫科院67原液保存

細菌疫苗工藝流程示意圖菌種篩選種子批的建立及檢定菌種接種原液合并半成品配置殺菌原液收獲擴大培養分裝包裝檢定中國疫苗研究：原液保存細菌疫苗工藝流程示意圖菌種篩選種子批的菌種接種68病毒原液保存

病毒疫苗工藝流程毒種篩選種子批的建立及檢定毒種接種#培養細胞原液合并半成品配置病毒滅活病毒的收獲過濾擴大細胞培養分裝包裝檢定原代細胞的制備或傳代細胞復蘇減毒活疫苗病毒原病毒疫苗工藝流程毒種篩選種子批的毒種接種#原液合并69第三節基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

指用基因工程方法，對抗體的基因進行重組、缺失、修飾改型等，構建載體，在受體細胞中表達，獲得抗體。第三節基因工程抗體基因工程抗體(Geneticengin70將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人Ab，再經雜交瘤技術，產生大量完全人源化抗體一、人源化抗體將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人71鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；

二是降低相對分子量，增加組織通透性原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區（V），同種性免疫源性則決定于抗體分子的穩定區（C）。在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的H和L鏈的V區基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達出完整的嵌合抗體.鼠源性單克隆抗體的改造目的和原理目的：一是降低免疫源性；

72人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區與人抗體的恒定區融合而得到的抗體。方法：將鼠源單抗的可變區基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。

特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結合抗原的能力（一）嵌合抗體人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區與人抗體的恒定區融合73細胞-干擾素醫學課件-74盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發展出CDR移植技術。

CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。（二）改型抗體盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發較75經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變結合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現在已有數百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數是改型抗體）經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力76人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法。77定點突變法是將人的可變區基因克隆，根據鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區基因的CDR序列變為鼠抗體的CDR序列，然后表達出改型抗體。研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。定點突變法是將人的可變區基因克隆，根據鼠抗體的CDR78Fab：抗原結合片斷Fv：可變區片段ScFv：單鏈可變區片段單域抗體最小識別單位二、小分子抗體分子量較小但具有抗原結合功能的分子片段。基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區片段，其相對分子質量僅為原抗體1/80~1/3。Fab：抗原結合片斷二、小分子抗體分子量較小但具有抗原結合79FvScFv單區抗體最小識別單位FabFvScFv單區抗體最小識別單位Fab80由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。(1)Fab由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。(181

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(282Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。單鏈抗體的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩定。83即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

(3)單域抗體VH即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，84約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構85可以用細菌發酵生產，成本低;分子小，穿透力強;不含Fc，沒有Fc帶來的效應;在體內循環的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。小分子抗體的優點及應用應用：用于腫瘤的導向治療腫瘤的影像分布基因治療優點：可以用細菌發酵生產，成本低;小分子抗體的優點及應用應用：優點86三、雙特異性抗體和多價抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。三、雙特異性抗體和多價抗體雙鏈抗體（Diabody）一87

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。

即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,將效應細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發分子結合,激活效應細胞,實現對腫瘤細胞的殺傷和裂解。雙特異性抗體(bispecificantibody88

Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質粒中,構建成雙鏈抗體的表達質粒,目前報道的表達質粒均為雙順反子。表達后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結,形成雙特異性抗體。Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區基89細胞-干擾素醫學課件-90所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環血液中的免疫效應細胞再導向至腫瘤細胞處,從而使效應細胞的抗腫瘤活性增強,發揮免疫導向作用,這是腫瘤治療的新突破。所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性91細胞-干擾素醫學課件-92分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。化學交聯BsAb分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗93將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應(HAMA)，因此不適用于臨床。細胞工程BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產94多采用抗體分子片段,如Fab，Fv或ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。基因工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab，Fv或ScFv,經基因95從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.（2）配基—Ig型嵌合抗體，如IL-2-Ig（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）四、抗體融合蛋白從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。（1）配基—配基型融合蛋白，96原核細胞表達：真核細胞表達：酵母、昆蟲細胞、中國倉鼠卵細胞、真菌等。轉基因植物表達：煙草葉和擬南芥植物。其產量可達葉片總蛋白量的1.3%。轉基因動物表達：單基因水平上做轉基因鼠。基因工程抗體的表達原核細胞表達：基因工程抗體的表達97第四節噬菌體抗體工程第四節噬菌體抗體工程98它是在PCR技術和PhageDisplay的基礎上實現的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。噬菌體抗體庫技術它是在PCR技術和PhageDisplay的基礎上99

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達106倍。該技術的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。噬菌體表面展示系統(phagesurfacedisplaysystem)1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面100用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人（一）基本原理和程序用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因101噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫102（二）噬菌體表面展示文庫技術的要點外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因g3或g8的先導系列的緊靠下游隨機克隆入相應載體形成組合文庫從免疫或未被免疫的B細胞中PCR擴增抗體全套基因片段（二）噬菌體表面展示文庫技術的要點外源基因表達多肽以融合蛋白103用固相化抗原經“親和結合一洗脫一擴增”數個循環直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。使翻譯出的抗體分泌到細菌的質周腔內，形成游離的抗體片段，經過純化即可獲得目的抗體。篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉入大腸桿菌，用固相化抗原經“親和結合一洗脫一擴增”數個循環直接、方便、簡104（三）噬菌體抗體庫技術的特點1、模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達到或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。（三）噬菌體抗體庫技術的特點1、模擬天然全套抗體庫1052、避開了人工免疫和雜交瘤技術由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術。3、可獲得高親和力的人源化抗體在噬菌體抗體庫技術中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。2、避開了人工免疫和雜交瘤技術3、可獲得高親和力的人源化抗體106將抗體的基因型和表型緊密聯系起來;可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術;抗體基因篩選的范圍廣;技術穩定、可靠、生產周期短;可規模化生產;適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產。該項技術的優點:將抗體的基因型和表型緊密聯系起來;該項技術的優點:107噬菌體抗體庫技術的發展具有很大優越性。它簡單易行，篩選容量大，效率高，繞過了細胞融合及免疫等步驟，而且在表型一基因型的統一和識別一增殖過程上模擬了B細胞的成熟過程，從而在實際應用上具有很大意義。噬菌體抗體庫技術的發展具有很大優越性。它簡單易行，篩108第五節抗體診斷試劑和抗體藥物抗原抗體特異性結合，在體內和體外均可呈現某種反應。在體內，可表現為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應條件不同，可發生凝集或沉淀等可見反應，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學診斷和血型測定，稱為血清學鑒定。抗體診斷藥物基本分為三類：血清學鑒定用的和免疫標記技術用的抗體制劑，以及體內導向診斷藥物。一、抗體診斷試劑第五節抗體診斷試劑和抗體藥物抗原抗體特異性結1091、血清學鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑直接凝集反應（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑（3）妊娠診斷試劑婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。（4）抗ABO血型系統血清1、血清學鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑直接1102、免疫標記技術用的抗體類試劑給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規不能觀察的反應得以顯現，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發病機制提供手段。2、免疫標記技術用的抗體類試劑給抗體標記放射性核素111（1）熒光抗體診斷試劑熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。（1）熒光抗體診斷試劑熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光112酶標診斷試劑a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診斷試劑b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診斷試劑c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑（2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標診斷試劑（2）免疫酶抗體診斷試劑：113把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質。（3）放射免疫用抗體診斷試劑常用的標記抗體試劑：a、HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記d、AFP放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1ng/ml把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩1143、導向診斷藥物由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導向藥物還未臨床廣泛應用。3、導向診斷藥物115二、抗體治療藥物以抗體為載體的導向治療藥物的研究已有20多年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數十種與腫瘤相關的抗原，受試病人超過數千例。但治療用的制劑尚沒有一種達到商品化的程度。在治療藥物中，單克隆抗體與毒素的偶聯物治療淋巴瘤效果最佳，但有效率僅30%二、抗體治療藥物以抗體為載體的導向治療藥物的研116目前的客觀現實是：研究進展迅速，但未達到常規治療的應用階段。障礙（原因）：抗體相對分子質量大，穿透力低，不能達到靶部位或攝取量低。鼠源性抗體的排斥反應。常用的抗癌藥物：

氨甲喋呤（methotrexate,MTX）、

阿霉素(adriamycin,ADM)絲裂霉素(mitomycin,MMC）、

環磷酰胺 (cyclophosphamide,CTX)、

新抑癌蛋白(neocarzinostatin,NCS)、

正定霉素(doxorubicin,DOX)等。目前的客觀現實是：研究進展迅速，但未達到常規治療的應用階段。117治療乳腺癌曲妥珠單抗藥物治療乳腺癌曲妥珠單抗藥物118我國第一個基因重組人源化單克隆抗體藥物－泰欣生（尼妥珠單抗）我國第一個基因重組人源化單克隆抗體藥物－泰欣生（尼妥珠單抗）119治療直腸、結腸癌的貝伐單抗瑞士羅氏生產的安維汀治療直腸、結腸癌的貝伐單抗瑞士羅氏生產的安維汀120抗體藥物－研制新藥的先鋒化學合成藥物天然來源藥物放射性核素基因組、蛋白組研究抗原、藥物靶點細胞因子、活性蛋白抗體及其片段抗體免疫偶聯物抗體融合蛋白抗體藥物－研制新藥的先鋒化學合成藥物天然來源藥物放射性核素基121小結

雜交瘤單克隆抗體制備技術的原理是利用聚乙二醇作為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一

體，在HAT選擇性培養基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經過反復的免疫學檢測篩選和單個細胞培養（克隆化）,最終獲得既能產生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤

細胞系，將這種細胞擴大培養，接種于小鼠腹腔，在其產生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。小結雜交瘤單克隆抗體制備技術的原理是利用聚乙二醇122

20世紀80年代誕生了應用DNA重組及蛋白工程技術對編碼抗體基因按不同需要進行改造和裝配，經導入適當的受體細胞后重新表達的抗體，稱為基因工程抗體，它具有如下優點：①通過基因工程技術的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應；②基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；③根據治療的需要，制備新型抗體；④可以采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達形式，大量表達抗體分子，大大降低了生產成本。20世紀80年代誕生了應用DNA重組及蛋白工程123

干擾素藥學院張倩倩124interferon(IFN)

干擾素藥學院1interferon(IFN)124病毒感染后的機體反應干擾素及白介素自然殺傷細胞T細胞免疫非特異性免疫特異性免疫病毒感染后的機體反應干擾素及白介素自然殺傷細胞T細胞免疫非特125

一干擾素的概念二干擾素的種類三干擾素的作用四干擾素抗病毒機理五生物學活性一干擾素的概念二干擾素的種類三126

一干擾素的概念概念：

干擾素（IFN）是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒反應，而產生的一組結構類似，功能相近的低分子糖蛋白。一干擾素的概念概念：127

二干擾素的種類二干擾素的種類128

三干擾素的作用一、Ⅰ型干擾素

（1）抗病毒和抗腫瘤1）誘導宿主細胞產生抗病毒蛋白，干擾病毒復制；2）增強NK細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞殺傷；3）促進MHC-Ⅰ類分子表達，增強CTL對病毒感染細胞和腫瘤等靶細胞的殺傷。

（2）免疫調節（較弱）：與Ⅱ型干擾素類似。三干擾素的作用一、Ⅰ型干擾素129

三干擾素的作用二、Ⅱ型干擾素（1）主要起免疫調節作用1）活化巨噬細胞；2）促進APC(s)表達MHC-Ⅱ類分子，提高抗原遞呈能力；3）促進MHC-Ⅰ類分子表達和增強CTL細胞的殺傷活性;4）增強NK細胞的殺傷活性；5）促進B細胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗腫瘤作用(與Ⅰ型干擾素類似，次要)。三干擾素的作用二、Ⅱ型干擾素130T細胞巨噬細胞B細胞粒細胞IFNNK細胞內皮細胞T細胞lNK細胞激活提高NK細胞活性抗病毒活性抑制細胞分裂抑制血細胞生成促進MHCⅠ和MHCⅡ分子表達多種細胞干擾素的作用T細胞巨噬細胞B細胞粒細胞IFNNK細胞內皮細胞T細胞131

四干擾素抗病毒機理最初感染的細胞由于病毒核酸剌激被誘導產生干擾素，它透過細胞膜向外擴散并進入血液循環進入其它細胞。干擾素不能直接阻止病毒吸附、穿入或釋放，而是作用于宿主細胞，使其產生抗病毒蛋白質，附著于細胞的核蛋白體上，選擇性地抑制病毒mRNA翻譯為病毒蛋白質，從而影響病毒結構蛋白和酶類的合成，使復制受到阻礙而呈現抗病毒的作用。四干擾素抗病毒機理最初感染的細胞由于病毒核酸剌激132

四干擾素抗病毒機理干擾素具有廣譜抗病毒作用，又具有細胞種屬特征。即某一種動物產生的干擾素只能保護同種屬或近緣種屬動物細胞。干擾素是一種活性很強的生物制劑，既能治療病毒性疾病，又具有抗腫瘤和調節免疫機能的作用。四干擾素抗病毒機理干擾素具有廣譜抗病毒作用，又具133四干擾素抗病毒機理四干擾素抗病毒機理134干擾素抗病毒作用干擾素抗病毒作用135作用機理 不是直接殺滅病毒IFN→

抗病毒蛋白基因→抗病毒蛋白(蛋白激酶,磷酸二脂酶)

↓ 降解病毒mRNA

抑制病毒蛋白合成抑制病毒組裝、釋放

↓

抑制病毒復制

中斷病毒感染；限制病毒擴散

↓作用機理 不是直接殺滅病毒IFN→抗病毒蛋白基因→136五生物學活性:廣譜的抗病毒作用，一種IFN可以抑制多種病毒；抑制病毒感染、阻止病毒在體內擴散、促進痊愈;調節免疫功能；抑制腫瘤細胞生長；五生物學活性:廣譜的抗病毒作用，一種IFN可以抑制多種137

IFN作用特點:產生的時間早；中斷受染細胞的病毒感染，限制病毒擴散；IFN誘導的抗病毒蛋白，只對病毒起作用，不影響宿主細胞蛋白質合成。

IFN作用特點:產生的時間早；138

謝謝謝謝139

140

141專題二抗體制藥第一節概述第二節單克隆抗體第三節基因工程抗體第四節噬菌體抗體工程第五節抗體診斷試劑和抗體藥物142專題二抗體制藥第一節概述19142第一節概述

1890年Behring和北里柴三郎發現白喉抗毒素,建立了血清療法,開創了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。143第一節概述20143抗體工程藥物的概念通過細胞工程或基因工程方法制備，用于治療的單克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體，以及抗體免疫偶聯物或抗體融合蛋白,稱為抗體工程藥物。又稱抗體藥物、單克隆抗體治療劑、抗體治療劑。抗體工程藥物的概念通過細胞工程或基因工程方法制備，用于治療的144抗原(antigen,Ag)---是指那些能夠刺激和/或誘導機體免疫系統發生免疫應答、產生抗體和/或致敏（效應）淋巴細胞，同時又能與免疫應答產物在體內外特異性結合，發生免疫反應的物質。如：病原微生物、免疫血清、藥物、疫苗對機體來說，抗原相當于一個國家已知的或潛在的、外部的或內部的“敵人”。抗原(antigen,Ag)145146免疫原性：指能刺激機體產生抗體和/或致敏淋巴細胞的性能。

反應原性：能與相應的抗體和/或淋巴細胞發生特異性結合，發生反應的性能。

23免疫原性：指能刺激機體產生抗體和/或致146147完全抗原：既具有免疫原性，又具有反應原性的抗原。如微生物、異種血清半抗原：又稱不完全抗原。是指其本身只有反應原性，但沒有免疫原性的簡單小分子的抗原物質。如某些藥物（青霉素等）、多糖、類脂。24完全抗原：既具有免疫原性，又具有反應原性的抗原。如微生物147148目前，在中草藥中發現廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，具有生化活性基因的化學成分都有可能成為半抗原，這些半抗原可與體內蛋白質結合成完全抗原，造成一些過敏反應。25目前，在中草藥中發現廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、148149抗原的特異性既表現在免疫原性上，也表現在反應原性上。沙門氏桿菌大腸桿菌抗大腸桿菌的抗體抗沙門氏桿菌的抗體結合結合26抗原的特異性既表現在免疫原性上，也表現在反應原性上。沙門149抗體是對其抗原有極強專一性的魔彈或巡弋飛彈研究 以免疫轉印法檢測

特定抗原醫療 以毒素連結抗體攻擊

病變細胞檢驗 以ELISA偵測特定

病原體150抗體是對其抗原有極強專一性的研究 以免疫轉印法檢測特150免疫球蛋白的結構抗體：能與相應抗原特異性結合的具有

免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白的結構抗體：能與相應抗原特異性結合的具有151抗體的產生過程：

機體免疫系統受抗原物質刺激后，B淋巴細胞被激活，增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。抗體的產生過程：152

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子量范圍從150,000到950,000道爾頓。分五類：IgG在血清中含量最高，達75~80%,是抗感染的主要抗體;IgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為五聚體,是對一個抗原作出反應時產生的

第一個抗體；IgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參與局部的免疫反應;IgD在血清中含量很低;IgE在血清含量最少。免疫球蛋白IgGIgMIgAIgDIgE免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)分子153動物血清中產生抗體的時間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生成；抗原再刺激后，IgＧ將取代IgM動物血清中產生抗體的時間示意圖抗原刺激的第一至三周，IgM生154抗體研究的發展階段：①以1890年Behring發現白喉抗毒素為代表,用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體。②以1975年Milstein&Kohler創建雜交瘤技術制備單克隆抗體(McAb)為代表。③以1994年Winter,創建了噬菌體抗體庫(repertoireofantibodiesdisplayedonphages)技術,以基因工程方法制備抗體為代表。在此基礎上發展成抗體工程。抗體研究的發展階段：155多克隆抗體:

一種抗原具有多個抗原決定簇,每個抗原決定簇都能刺激一個B細胞產生一種抗體。這樣所獲得的免疫血清是多種抗體的混和物。單克隆抗體(MonoclonalantibodyMcAb):

由一個抗原決定簇刺激的、單一的B細胞和骨髓瘤細胞融合增殖后所產生的、高度均一的抗體。1234多克隆抗體:1234156多克隆抗體和單克隆抗體PuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234BcellPuresingleAbAfterimmunization,themousespleencontainsBcellsproducingspecificantibodies.EachBcellproducesonlyonekindofantibody,whichbindstoitsspecificantigen.ConventionalantiserumisthemixtureofallantibodiesproducedbyBcellsfromspleen.IfasingleBcellwaspickedupandcultured,thenitwillproduceonlyonekindofantibody.ButBcellcannotsurvivewellintheculture.Eachhybridomalinecanproducepuresingleantibody,calledmonoclonalantibody.IfBcellisfusedwithmyeloma,thefusedcellmightbeculturedandproduceantibody.AdaptedfromMilstein(1980)ScientificAmerican,Oct.p.581234mmmm12341234MonoclonalantibodiesCellfusionSpleencells+MyelomaxAntiseumAntigenImmunizationAmixtureofallAb1234BALB/c12341234Bcell多克隆抗體和單克隆抗體PuresingleAbAfter157用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定。用于臨床治療，如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體制備導向藥物。但是要解決以下兩個問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。單克隆抗體的應用158用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關的抗158基因工程技術為解決這兩個問題提供了可能。1984年：人-鼠嵌合抗體1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結合試劑。已通過基因工程技術，制備出改形抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位。基本消除了單克隆抗體的鼠源性，相對分子質量只有完整抗體分子的1/80~1/3，而且消除了鼠源性單克隆抗體的生物學活性如激活補體、促進吞噬功能（免疫調理）、抗體依賴細胞介導的細胞毒作用等，只保留同抗原特異性結合的活性。159基因工程技術為解決這兩個問題提供了可能。36159第二節單克隆抗體

McAb是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定族的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產生的，故稱為單克隆抗體。第二節單克隆抗體M