重組DNA技術與基因工程5

2

3

4

1

6

重組DNA技術與基因工程的基本概念重組DNA技術所需的基本條件重組DNA技術的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構建外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在酵母中的表達重組DNA技術與基因工程523416重組DNA技A用于核酸操作的工具酶2

重組DNA技術所需的基本條件限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶A用于核酸操作的工具酶2重組DNA技術所需的基本限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的發現及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的發現及其生物功能識別雙鏈D限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的類型主要特性限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的命名屬名限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DEcoRI等產生的5’

粘性末端5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’

…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’

…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等產生的5’粘性末端5’…G-C-T-PstI等產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-PvuII等產生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII等產生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內切酶需要相似的反應條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作大部分限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5’CG3’序列中的C5位上引入甲基限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的甲限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩沖液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發生低特異性，即所謂的Staractivity現象

EcoRI在正常條件下識別并切割5’GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5’PuPuATPyPy3’或者5’AATT3’限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上缺口處的磷DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5’…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5’…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復與RNA鏈結合的DNADNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子DNA連接酶DNA連接酶的反應條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15℃反應1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶DNA連接酶的反應條件Tris-HCl50-DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mMDNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質：3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-OH5’pppdNMg2+3’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口前移標記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’Mg2+5’dNTP5’pppdA（a-32P-dATP）5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’Nicktranslation制備32P標記的探針DNaseIDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得C端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（KlenowDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5’…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（KlenowDNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內切酶產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5’…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5’

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’Mg2+5’pppdN5’

pppdA（a-32P-dATP）5’

G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolT4-DNApol5’

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉錄酶5’

DNA3’DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切單鏈DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5’…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5’

dNMPs或5’

NMPs核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切單核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5’…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5’nickgapS1Zn2+5’…G-C-T-C-A-G3’…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5’核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切帶核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5’

dNMPs或5’

NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環化AC核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）TdT的基本特性：來自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs5’

p3’

HOOH3’p5’TdTMg2+

dATP5’

p3’

HOAAAAAAAAAAAAOH3’p5’核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）TdT的基本特性：來TdT的基本特性：5’

p3’

HOOH3’p5’TdTCo2+

dATP5’

p3’

HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3’

p5’

5’

p3’

HOOH3’

p5’

TdTCo2+

dATP5’

p3’

HOAAAAAAAAAAAAAAOH3’

p5’

AAAAAAAAAAATdT的基本特性：5’p3’HOOH3’p5’Td核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5’

pOH3’

DNAorRNA5’

pppdN5’

pppNBAP/CIPOH3’

5’

HO5’

HOdN5’

HON核酸修飾酶堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5’

HO3’

HOOH3’

OH5’

T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5’

p3’

HOOH3’

p5’

用于探針的末端同位素標記：核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNPB用于基因克隆的載體2

重組DNA技術所需的基本條件質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）人造染色體載體載體的功能及特征B用于基因克隆的載體2重組DNA技術所需的基本條載體的功能及特征載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體的功能及特征載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源載體的功能及特征載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點載體的功能及特征載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親質粒質粒的基本特征質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并能被穩定遺傳的一類核酸分子；質粒常見于原核細菌和真菌中；絕大多數的質粒是DNA型的，絕大多數的天然DNA質粒具有共價封閉、環狀的分子結構，即cccDNA；質粒DNA的分子量范圍：1-300kb質粒質粒的基本特征質粒是生物細胞內固有的、能獨質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制；質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴緊型復制控制的質粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質粒10-60拷貝stringentplasmid質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：質粒能利用寄主細胞的DN質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制–質粒DNA復制啟動控制控制復制引物與模板的結合oriE.coliColE1

plasmid復制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制–質質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制–質粒DNA復制啟動控制控制復制起始因子與復制起始位點（ori）的結合PcopcopP/OrepreporiCopRep質粒質粒的基本特征質粒的自主復制性：拷貝數的控制機制–質質粒質粒的基本特征質粒的不相容性：任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，一般不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容成不相容性群。以大腸桿菌的質粒為例：質粒質粒的基本特征質粒的不相容性：任何兩種含有相似復制子結構質粒質粒的基本特征質粒的可轉移性：革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：接合型質粒：能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等；非接合型質粒：不能在天然條件下獨立地發生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。質粒質粒的基本特征質粒的可轉移性：革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩質粒質粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標記：野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。質粒質粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標記：野生型的質粒DNA上往質粒質粒的構建天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數幾個野生型質粒構建而成的：pSC101 8.8kb，拷貝數5，四環素抗性標記基因TcrColE1 6.5kb，拷貝數20-30，大腸桿菌內毒素標記基因E1RSF2124 ColE1衍生質粒，氨芐青霉素抗性標記基因Apr質粒質粒的構建天然存在的野生型質粒由于分子量大質粒質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數控制基因，拷貝數1000-3000，擴增基因低拷貝質粒來自pSC101，拷貝數小于10，表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭（polylinker）整合質粒裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選質粒質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：質粒重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制pBR322：

氯霉素可擴增拷貝數50-100/cell用于基因克隆質粒重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制pBR322：氯霉素質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：

拷貝數2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：拷貝數2質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：正選擇標記pET39：質粒重要的大腸桿菌質粒載體T7啟動子lac

操作子RBSDsbA編碼基因HisTag凝血酶切割位點STag腸激酶切割位點MCSHisTagT7終止子T7啟動子：為噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶特異性識別，因此相應的受體菌必須表DsbA：為大腸桿菌周質定位因子，可將重組表達產物定向高效地分泌到周質中。HisTag：為連續六個組氨酸序列，能特異性吸附含有鎳離子的層析介質上。凝血酶和腸激酶切割位點：用于從重組融合蛋白中回收目標蛋白。達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等。pET39：質粒重要的大腸桿菌質粒載體T7啟動子la質粒質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA：

氯化銫密度梯度離心法

質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間質粒質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒D質粒質粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體；加溶菌酶裂解細菌細胞壁；加CsCl和溴乙錠；超速離心過夜；在紫外燈下吸取cccDNA；稀釋沉淀cccDNA。proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質粒質粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：用含有EDT質粒質粒DNA的分離純化堿溶法：（質粒DNA純化試劑盒所采用的程序）用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體；加溶菌酶裂解細菌細胞壁；加NaOH和SDS的混合溶液，破膜釋放內含物；

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質；離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質；乙醇或異丙醇沉淀水相質粒DNA；用無DNase的RNase去除殘余的RNA。

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質粒質粒DNA的分離純化堿溶法：（質粒DNA純化試劑盒質粒質粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的加溶菌酶裂解細菌細胞壁；沸水浴40秒鐘；離心，用無菌牙簽挑去沉淀物；乙醇或異丙醇沉淀質粒DNA。緩沖液懸浮菌體；質粒質粒DNA的分離純化沸水浴法：用含有EDTA和Trit噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態還會相互轉化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞；自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學特性：

生物結構l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生l噬菌體生物學特性：

生物結構5’GGGCGGCGACCT3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAl噬菌體生物學特性：生物結構5’GGGCGGCGACC噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染周期體內包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度

野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：

插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度

插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度

取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DN噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：構建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株中后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DN噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DN噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養基中培養至對數生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養1小時

用新鮮培養基稀釋，繼續培養4-12小時。這時噬菌體顆粒

密度已達1013-1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解

超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉淀l-DNA

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達

外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為噬菌體或病毒DNA與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病

毒基因組DNA。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結構，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規的DNA重組。噬菌體或病毒DNA與動植物受體細胞相適應的載考斯質粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒和噬菌粒載體的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序列與質粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。考斯質粒l-DNA載體和M13-DNA載體的考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的構建：考斯質粒是一類人工構建的含pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI有l-DNAcos序列和質粒復制子的殊類型的載體，1978年由Collins由含cos序列的1.8kb的l片段和考斯質粒的裝載范圍為31-45kb。和Hohn發明構建。例如，pHC79質粒pBR322片段組合而成。考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的構建：考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易不能體內包裝，不裂解受體細胞考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的特點：能像l-DNA那人造染色體載體

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區、分配區、穩定區與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩定的復制并遺傳。人造染色體載體包括：人類人造染色體（HAC）噬菌體人造染色體（PAC）人造染色體載體人類、動物、植物的全基因組序列分人造染色體載體細菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，命名為pBACs，其裝載量范圍在50-300

kb之間。各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌中只能維持單一拷貝。pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結構構建動植物基因文庫人造染色體載體細菌人造染色體（BacterialArtif人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體一般含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復制子

酵母染色體的著絲粒序列

酵母系統的選擇標記大腸桿菌的復制子

大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為350-400kb。人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificia人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉化酵母菌重組酵母染色體人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificiaC用于基因轉移的受體菌或細胞2

重組DNA技術所需的基本條件各種基因工程受體的特性實驗室常用的基因工程受體受體細胞應具備的條件C用于基因轉移的受體菌或細胞2重組DNA技術所需受體細胞應具備的條件限制性缺陷型外切酶和內切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）具有較高的轉化效率具有與載體選擇標記互補的表型感染寄生缺陷型防止重組細菌擴散污染，生物武器除外

受體細胞應具備的條件限制性缺陷型外切酶和內切酶活性缺陷（re各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統完備，生長迅速，培養簡單，重組子穩定；適用于外源DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構建，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌。產結構復雜、種類繁多的內毒素；各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全，生長迅速，培適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌。遺傳欠穩定，載體受體系統欠完備；養簡單，不產內毒素；各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清楚，各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產者，分子遺傳相對操作簡便，不產內毒素；主要用于抗生素生產菌株的改良。遺傳不穩定，生長相對緩慢；各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產者，分子遺傳相對各種基因工程受體的特性酵母具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養簡單，外源基因表達系統完善，遺傳穩定；適用于外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構建、真核生物基因表達調控的研究，是內源性蛋白產物種類繁多且含量高；DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌。各種基因工程受體的特性酵母具有真核生物的特征各種基因工程受體的特性昆蟲細胞（家蠶）具有真核生物的特征，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養成本低廉，遺傳穩定；適用于真核生物基因的高效表達。

DNA重組操作系統欠完善；各種基因工程受體的特性昆蟲細胞（家蠶）具有真各種基因工程受體的特性哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO）

與人的親緣關系近，分子重組表達系統健全，具有合適的糖基化修飾系統；適用于哺乳類動物和人的基因表達調控研究、基因藥物的生產，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體。細胞培養條件苛刻，生長緩慢；各種基因工程受體的特性哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO各種基因工程受體的特性植物細胞（擬南芥、煙葉）

農作物的經濟意義重大，轉基因植物細胞易于分化，細胞培養簡單且成本低廉，具有光合作用；適用于高等植物基因表達調控的研究、基因藥物的生產，農作物品質的改良。遺傳操作繁瑣；各種基因工程受體的特性植物細胞（擬南芥、煙葉）農作2

重組DNA技術所需的基本條件C用于基因轉移的受體菌或細胞B用于基因克隆的載體A用于核酸操作的工具酶2重組DNA技術所需的基本條件C用于基因轉移的受重組DNA技術與基因工程5

2

3

4

1

6

重組DNA技術與基因工程的基本概念重組DNA技術所需的基本條件重組DNA技術的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構建外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在酵母中的表達重組DNA技術與基因工程523416重組DNA技A用于核酸操作的工具酶2

重組DNA技術所需的基本條件限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶A用于核酸操作的工具酶2重組DNA技術所需的基本限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的發現及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的發現及其生物功能識別雙鏈D限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的類型主要特性限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的命名屬名限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DEcoRI等產生的5’

粘性末端5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’

…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’

…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等產生的5’粘性末端5’…G-C-T-PstI等產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-PvuII等產生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII等產生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內切酶需要相似的反應條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作大部分限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、干燥限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5’CG3’序列中的C5位上引入甲基限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的甲限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩沖液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發生低特異性，即所謂的Staractivity現象

EcoRI在正常條件下識別并切割5’GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5’PuPuATPyPy3’或者5’AATT3’限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上缺口處的磷DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5’…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5’…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復與RNA鏈結合的DNADNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子：5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH