免疫組織化學2022/12/10免疫組織化學[1]免疫組織化學2022/12/10免疫組織化學[1]1何謂免疫組化免疫組織化學是指在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織呈色反應，借助可見的標記物，對相應的抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。免疫組織化學[1]何謂免疫組化免疫組織化學是指在組織細胞原位通過2免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體及純化標記物與抗體集合形成標記抗體標本的處理抗原抗體反應和呈色反應顯微鏡下觀察結果免疫組織化學[1]免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異3組織抗原抗體標記物

標記抗體1熒光2酶3親和技術4金標免疫組織化學[1]組織抗原抗體標記物標記抗體1熒光免疫組織化學[1]4組織抗原免疫細胞化學反應原理：＋標記抗體標記的抗原抗體復合物免疫組織化學[1]組織抗原免疫細胞化學反應原理：＋標記抗體標記的抗原抗體復合5間接法直接法

兩種免疫細胞化學反應方法免疫組織化學[1]間接法直接法兩種免疫細胞化學反應方法免疫組織化學[1]6標本的處理標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養細胞標本的固定與保存酶消化處理

組織材料處理是獲得良好免疫細胞組織化學分析的保障，必須保證要檢測的細胞或組織取材新鮮、固定即使及時、形態保存良好、抗原物質的抗原性不被破壞。免疫組織化學[1]標本的處理標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養細7標本的固定與保存

固定的目的：是細胞內蛋白質凝固，終止胞內酶活化反應，防止細胞自溶，保持細胞固有形態與結構，防止細胞脫落，去除干擾抗原抗體反應的類脂，最主要的是保存組織細胞的抗原性，在染色和反復清洗的過程中使抗原不致釋放。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質擴散（3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應免疫組織化學[1]標本的固定與保存固定的目的：是細胞內蛋白質凝固8標本的固定與保存抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質95％乙醇室溫，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h細菌丙酮、甲醇室溫，3～10min病毒丙酮，無水乙醇室溫，5～10min四氯化磺4℃，30～60min類脂質10％甲醛室溫，3～10min細胞懸液1％聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定免疫組織化學[1]標本的固定與保存抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質95％乙醇室溫9標本的固定與保存

冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的形成，避免組織細胞結構的破壞。石蠟切片是觀察組織細胞結構的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋材料的回顧性免疫組化研究，切片薄，有連續性，蠟塊可長期保存，但是抗原的保存量不如冰凍切片。免疫組織化學[1]標本的固定與保存冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中10酶消化處理石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固定過程中由于醛鍵形成致使某些抗原決定簇被封閉，染色不理想，甚至出現假陰性，因而在進行免疫組化反應之前，需要酶消化處理切片，可使抗原決定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。免疫組織化學[1]酶消化處理石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固11抗體處理與保存抗體是免疫組化技術的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價的第一抗體為多克隆抗體。抗體稀釋的原則是陽性（抗原）物質著色應鮮明，背景應錢或不著色。抗體效價越高，孵育時間越長，方法越敏感抗體稀釋度應越高。免疫組織化學[1]抗體處理與保存抗體是免疫組化技術的首要試劑，通常選用的高特異12免疫染色標記抗體與標本中抗原反應并形成抗原抗體復合物；用緩沖液沖洗去未結合的成分；直接在顯微鏡下觀察結果（免疫熒光直接法），或待標本顯色后再用顯微鏡觀察結果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫組化技術的關鍵步驟。免疫組織化學[1]免疫染色標記抗體與標本中抗原反應并形成抗原抗體復合物；免疫染13免疫染色

對一些特殊的標本需進一步進行處理來增加檢測的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限度的結合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術中非抗原抗體反應出現的陽性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體相同的動物源血清（非免疫血清）吸附封閉底物煮至上的帶電荷物質，然后再進行抗原抗體結合反應，必要時也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，減少非特異性染色。免疫組織化學[1]免疫染色對一些特殊的標本需進一步進行處理來增加14免疫組化染色中標識物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別機體內無同一物質或類似物質物理或化學性質穩定，可與抗原或抗體結合，其結合物也穩定

目前常用標識物質有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等免疫組織化學[1]免疫組化染色中標識物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別15設立對照實驗

為確定結果的可靠性，在實驗中必須設置對照。通常是針對第一抗體設立對照，包括陽性對照、陰性對照、替代對照、空白對照、自身對照和吸收試驗等。（1）陽性對照用一直抗原陽性的切片與待測標本同時進行免疫細胞化學染色，陽性對照應呈陽性結果，即為陽性對照。（2）陰性對照用不含一直抗原的標本作對照，實驗結果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結果。免疫組織化學[1]設立對照實驗為確定結果的可靠性，在實驗中必須設16免疫組化的結果判斷染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質細胞和間質均勻染色或更強顯色定位特定，具有結構性無特定部位，無結構性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規律，某一片均勻著色

免疫組織化學的結果判斷應非常嚴謹，陽性細胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細胞核型和細胞膜表面型。陽性細胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據。陽性細胞的染色常定位于細胞，并于陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞，兩者可由顯著區別。免疫組織化學[1]免疫組化的結果判斷染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞17幾種常用的免疫組化檢測技術熒光免疫組織化學技術酶免疫組織化學技術免疫金（銀）組織化學技術免疫標記電鏡技術……免疫組織化學[1]幾種常用的免疫組化檢測技術熒光免疫組織化學技術免疫組織化學[18

免疫熒光技術將熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質的定位

免疫熒光技術免疫組織化學[1]免疫熒光技術將熒光素作為標記物免疫熒光技術免疫組19

１.異硫氰酸熒光素FITC２.四乙基羅達明３.四甲基異硫氰酸羅達明４.藻紅蛋白

▲呈現不同的熒光：綠色熒光(FITC)

橙色熒光

橙紅色熒光

紅色熒光等

熒光素作為染料在激發光照射下能產生熒光的一類化合物免疫組織化學[1]１.異硫氰酸熒光素FITC熒光素免疫20

熒光：

在激發光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發出較激發光波長更長的可見光并隨照射停止而消失

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發光，如紫外光、藍紫光（有不同的波長范圍），使受檢標本內的熒光物質發出發射光免疫組織化學[1]免疫組織化學[1]21海馬細胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)

軸突終末蛋白紅色(突觸)免疫組織化學[1]海馬細胞免疫組織化學[1]22

培養的成纖維細胞微管呈綠色核呈藍色免疫組織化學[1]培養的成纖維細胞免疫組織化學23免疫組織化學技術的應用

熒光免疫組織化學技術主要用于病原體感染的早期診斷，自身抗體檢測，分析淋巴細胞表面標記物質及抗原、抗體的免疫組化定位等；在病原生物學方面，主要用于菌種的堅定和抗原結構的分析；在細胞免疫學檢測中，用以檢測拎包細胞表面的各種CD抗原、免疫球蛋白受體、HLA抗原和各種膜受體等。酶免疫組織化學技術主要用于組織切片或其它抗原的定位檢測。組織切片中的各類抗原性物質，如各類蛋白質、酶、激素、細胞、病毒、腫瘤抗原、姜細胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細胞表面標志等均可檢測。免疫標記電鏡技術由于需要電子顯微鏡，目前仍較多用于科研分析。免疫組織化學[1]免疫組織化學技術的應用熒光免疫組織化學技術主24免疫組化在臨床病理診斷中的應用標記淋巴造血組織及其腫瘤的細胞來源和細胞分化程度;協助腫瘤良惡性的診斷;鑒別低分化癌和肉瘤;鑒別轉移癌的性質;協助發現骨髓、淋巴結微小轉移癌灶;鑒別小細胞惡性腫瘤;癌組織耐藥基因的檢測;為癌癥患者治療方案的擬定提供依據;確定腫瘤組織的增殖活性;評估癌癥患者的預后;檢測病原體。免疫組織化學[1]免疫組化在臨床病理診斷中的應用標記淋巴造血組織及其腫瘤的細25鑒別低分化癌和低分化肉瘤鑒別低分化癌和惡性淋巴瘤鑒別微小轉移癌灶鑒別某些轉移癌的類型鑒別低分化癌的類型鑒別低分化肉瘤的類型免疫組織化學[1]鑒別低分化癌和低分化肉瘤鑒別低分化癌和惡性淋巴瘤免疫組織26演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain2022/12/10免疫組織化學[1]演講完畢，謝謝聽講!再見，seeyouagain202227免疫組織化學2022/12/10免疫組織化學[1]免疫組織化學2022/12/10免疫組織化學[1]28何謂免疫組化免疫組織化學是指在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織呈色反應，借助可見的標記物，對相應的抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。免疫組織化學[1]何謂免疫組化免疫組織化學是指在組織細胞原位通過29免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體及純化標記物與抗體集合形成標記抗體標本的處理抗原抗體反應和呈色反應顯微鏡下觀察結果免疫組織化學[1]免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異30組織抗原抗體標記物

標記抗體1熒光2酶3親和技術4金標免疫組織化學[1]組織抗原抗體標記物標記抗體1熒光免疫組織化學[1]31組織抗原免疫細胞化學反應原理：＋標記抗體標記的抗原抗體復合物免疫組織化學[1]組織抗原免疫細胞化學反應原理：＋標記抗體標記的抗原抗體復合32間接法直接法

兩種免疫細胞化學反應方法免疫組織化學[1]間接法直接法兩種免疫細胞化學反應方法免疫組織化學[1]33標本的處理標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養細胞標本的固定與保存酶消化處理

組織材料處理是獲得良好免疫細胞組織化學分析的保障，必須保證要檢測的細胞或組織取材新鮮、固定即使及時、形態保存良好、抗原物質的抗原性不被破壞。免疫組織化學[1]標本的處理標本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培養細34標本的固定與保存

固定的目的：是細胞內蛋白質凝固，終止胞內酶活化反應，防止細胞自溶，保持細胞固有形態與結構，防止細胞脫落，去除干擾抗原抗體反應的類脂，最主要的是保存組織細胞的抗原性，在染色和反復清洗的過程中使抗原不致釋放。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質擴散（3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應免疫組織化學[1]標本的固定與保存固定的目的：是細胞內蛋白質凝固35標本的固定與保存抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質95％乙醇室溫，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h細菌丙酮、甲醇室溫，3～10min病毒丙酮，無水乙醇室溫，5～10min四氯化磺4℃，30～60min類脂質10％甲醛室溫，3～10min細胞懸液1％聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定免疫組織化學[1]標本的固定與保存抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質95％乙醇室溫36標本的固定與保存

冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的形成，避免組織細胞結構的破壞。石蠟切片是觀察組織細胞結構的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋材料的回顧性免疫組化研究，切片薄，有連續性，蠟塊可長期保存，但是抗原的保存量不如冰凍切片。免疫組織化學[1]標本的固定與保存冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中37酶消化處理石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固定過程中由于醛鍵形成致使某些抗原決定簇被封閉，染色不理想，甚至出現假陰性，因而在進行免疫組化反應之前，需要酶消化處理切片，可使抗原決定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。免疫組織化學[1]酶消化處理石蠟包埋材料大都用甲醛固定保存，固38抗體處理與保存抗體是免疫組化技術的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價的第一抗體為多克隆抗體。抗體稀釋的原則是陽性（抗原）物質著色應鮮明，背景應錢或不著色。抗體效價越高，孵育時間越長，方法越敏感抗體稀釋度應越高。免疫組織化學[1]抗體處理與保存抗體是免疫組化技術的首要試劑，通常選用的高特異39免疫染色標記抗體與標本中抗原反應并形成抗原抗體復合物；用緩沖液沖洗去未結合的成分；直接在顯微鏡下觀察結果（免疫熒光直接法），或待標本顯色后再用顯微鏡觀察結果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫組化技術的關鍵步驟。免疫組織化學[1]免疫染色標記抗體與標本中抗原反應并形成抗原抗體復合物；免疫染40免疫染色

對一些特殊的標本需進一步進行處理來增加檢測的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限度的結合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術中非抗原抗體反應出現的陽性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體相同的動物源血清（非免疫血清）吸附封閉底物煮至上的帶電荷物質，然后再進行抗原抗體結合反應，必要時也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，減少非特異性染色。免疫組織化學[1]免疫染色對一些特殊的標本需進一步進行處理來增加41免疫組化染色中標識物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別機體內無同一物質或類似物質物理或化學性質穩定，可與抗原或抗體結合，其結合物也穩定

目前常用標識物質有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等免疫組織化學[1]免疫組化染色中標識物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別42設立對照實驗

為確定結果的可靠性，在實驗中必須設置對照。通常是針對第一抗體設立對照，包括陽性對照、陰性對照、替代對照、空白對照、自身對照和吸收試驗等。（1）陽性對照用一直抗原陽性的切片與待測標本同時進行免疫細胞化學染色，陽性對照應呈陽性結果，即為陽性對照。（2）陰性對照用不含一直抗原的標本作對照，實驗結果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結果。免疫組織化學[1]設立對照實驗為確定結果的可靠性，在實驗中必須設43免疫組化的結果判斷染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質細胞和間質均勻染色或更強顯色定位特定，具有結構性無特定部位，無結構性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規律，某一片均勻著色

免疫組織化學的結果判斷應非常嚴謹，陽性細胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細胞核型和細胞膜表面型。陽性細胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的依據。陽性細胞的染色常定位于細胞，并于陰性細胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞，兩者可由顯著區別。免疫組織化學[1]免疫組化的結果判斷染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞44幾種常用的免疫組化檢測技術熒光免疫組織化學技術酶免疫組織化學技術免疫金（銀）組織化學技術免疫標記電鏡技術……免疫組織化學[1]幾種常用的免疫組化檢測技術熒光免疫組織化學技術免疫組織化學[45

免疫熒光技術將熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質的定位

免疫熒光技術免疫組織化學[1]免疫熒光技術將熒光素作為標記物免疫熒光技術免疫組46

１.異硫氰酸熒光素FITC２.四乙基羅達明３.四甲基異硫氰酸羅達明４.藻紅蛋白

▲呈現不同的熒光：綠色熒光(FITC)

橙色熒光

橙紅色熒光

紅色熒光等

熒光素作為染料在激發光照射下能產生熒光的一類化合物免疫組織化學[1]１.異硫氰酸熒光素FITC熒光素免疫47

熒光：

在激發光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發出較激發光波長更長的可見光并隨照射停止而消失

熒光顯微鏡：

熒光顯微鏡的光源提供各種激發光，如紫外光、藍紫光（有不同的波長范圍），使受檢標本內的熒光物質發出發射光免疫組織化學[1]免疫組織化學[1]48海馬細胞

微管蛋白綠色(胞體、樹突)