常用化學藥品檢驗方法

檢驗儀器的使用化學藥品檢驗室內容：高效液相色譜儀器（高效液相）色譜理論滴定分析法高效液相色譜儀一、結構示意圖.二、部件介紹

一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。 現在的儀器還一般配置有在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱等。制備型HPLC儀還配備有自動餾分收集裝置。

進樣器主要部件為定量環及六通閥。使用時應注意：1樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損2進樣量應不大于定量環體積的50%3每次分析結束后應沖洗進樣閥，現在大部分進樣器能自動實現此功能。部分自動進樣器還能實現柱前衍生化等操作。（Agilent）色譜柱色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快等。使用色譜柱時應注意事項：1避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。2應逐漸改變溶劑的組成，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。3一般不能反沖，否則會迅速降低柱效。4使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。5流動相應先脫氣，避免氣泡進入柱體。6測試基質復雜的樣品時，應用保護柱。7定期用強溶劑沖洗色譜柱，清除駐留在柱內的雜質。8保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇后塞緊。

高效液相色譜的主要類型及其分離原理類型（按固定相分子聚集狀態和分離機制分）：分配色譜(液-液色譜)；吸附色譜(液-固色譜)；離子交換色譜；空間排阻色譜；親和色譜等。一、液-液色譜（一）反相鍵合相色譜化學鍵合相：利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面特點：不易流失熱穩定性好化學性能好載樣量大適于梯度洗脫1分離機制：分配+吸附

疏溶劑理論

流動相與溶質排斥力越強，作用時間↑，k↑，組分tR↑流動相與溶質排斥力越弱，作用時間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（十八烷基Octadecylsilyl，簡稱ODS）3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水

流動相極性>固定相極性（RP）底劑+有機調節劑（極性調節劑）例：水（緩沖鹽溶液）+甲醇，乙腈，THF4．流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小），分離物質也相似氨基鍵合相與硅膠性質差別大，堿性，分析極性大物質、酚、羧酸、核苷酸、糖類、氨基酸等（也可用作反相固定相，氨基柱不能用于分離甾酮、還原糖）三.離子交換色譜法

1.分離機制；離子與離子之間的電荷吸引力

2.適用范圍；凡能在溶劑中電離的物質一般均可用該法進行分離。3.交換：KX=[-NR4+X-][Cl-]/[-NR4+Cl-][X-]DX=[-NR4+X-]/[X-]=KX[-NR4+Cl-]/[Cl-]4.結論：a.分配系數D愈大，表示溶質的離子與離子交換劑的相互作用愈強。b.親合力高的，在柱中保留值就愈大。

5.應用：a.分離離子或可離解的化合物。b.主要用于分析有機酸、氨基酸、核酸、多肽等。離子對色譜分離過程示意圖四、離子色譜法

1.固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季銨基（陰離子交換樹脂）。流動相:電解質溶液檢測器:電導檢測器，安培主配件：抑制柱2.流程圖：fig3-23.分類a.雙柱型：化學抑制型離子色譜法；b.單柱型：非抑制型，用低電導的洗脫液；4.分離機制（陰離子為例）

被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。5.應用：

從無機和有機陰離子到金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、氨基酸、多肽、核酸等均可用該法分析。離子色譜中發生的基本過程就是離子交換，因此，離子色譜本質上就是離子交換色譜。在離子色譜的基本組成中，重要的和與其他高效液相色譜不同的就是抑制器和電導檢測器，離子色譜用的泵是PEEK材料襯里的不銹鋼泵。藥典品種應用離子色譜法：陽離子交換柱山梨醇及制劑甘油果糖氯化鈉注射液甘露醇及制劑利巴韋林及制劑鹽酸二甲雙胍及制劑蘋果酸及制劑富馬酸及制劑陰離子交換柱肝素鈉及制劑帕米磷酸二鈉及制劑氯膦酸二鈉及制劑硫酸軟骨素鈉及制劑色譜柱類型品種個數陽離子交換柱23個陰離子交換柱14個五、空間排阻色譜法

1.固定相：凝膠

2.機制：類似于分子篩作用，分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流體力學體積和分子大小有關.3.分離示意圖，fig3-3

a.排斥極限A點;b.全滲透極限B點相對分子質量介于上述兩個極限之間的化合物，將按相對分子質量降低的次序被洗脫.

4.常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

門冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度門冬酰胺酶（歐文）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度注射用門冬酰胺酶（埃希）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度注射用門冬酰胺酶（歐文）分子量5000~60000色譜親水改性硅膠,UV,純度抑肽酶親水的改性硅膠，高分子蛋白質注射用抑肽酶親水的改性硅膠，高分子蛋白質烏司他丁親水改性硅膠，有關物質烏司他丁溶液親水改性硅膠，有關物質胰島素親水改性硅膠，高分子蛋白質中性胰島素注射液親水改性硅膠，高分子蛋白質精蛋白鋅胰島素注射液親水改性硅膠，高分子蛋白質2010版藥典二部采用高效凝膠色譜的品種右旋糖酐20親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐20葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐20氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐40氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70葡萄糖注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐70氯化鈉注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐鐵親水性球形高聚物，分子量與分子量分布右旋糖酐鐵注射液親水性球形高聚物，分子量與分子量分布頭孢地嗪鈉球狀蛋白色譜用親水硅膠（分子量1000~10000），有關物質注射用頭孢地嗪鈉球狀蛋白色譜用親水硅膠（分子量1000~10000），有關物質2010版藥典二部采用高效凝膠色譜的品種無定形硅膠和鍵合相硅膠示意圖：填料發展史色譜法的應用：液相色譜常用檢測器光學檢測器：紫外、熒光、示差折光、蒸發光散射（通用型檢測器）電化學檢測器：極譜、庫侖、安培電學檢測器：電導、介電常數質譜檢測器選擇性檢測器：靈敏度較高色譜法的應用：蒸發光散射檢測器優點：適用于沒有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待測物，使用UV時靈敏度更低；無需衍生化而直接測定，避免了衍生帶來的誤差。可以應用有強紫外吸收的試劑，如氯仿、丙酮等。適用于組分復雜樣品的分析，可以進行梯度洗脫，基線平穩。通用型檢測器，只要待測物揮發性低于溶劑，即可適用。對不同物質，ELSD相應因子的變化比其它檢測器要小得多。對環境影響不靈敏，室溫下即可操作。沒有溶劑前緣峰，適用于保留時間短的物質的檢測。與LC-MS的色譜條件一致，可直接進行方法轉換。色譜法的應用：蒸發光散射檢測器影響ELSD響應的因素載氣流速、霧化器設計與溫度、流動相的組成和流速等影響霧化過程。被分析物的濃度和體積質量決定了進入光散射池的氣溶膠中的顆粒的直徑。被分析物的折射指數、光源發出的光的強度和波長、光電倍增管的位置等影響散射光強度。光電倍增管的靈敏度和入射光的強度決定了檢測的效率，反映為實驗者所觀測的峰面積。2010版藥典二部應用蒸發光散射檢測器的品種妥布霉素硫酸慶大霉素妥布霉素滴眼液硫酸慶大霉素注射液硫酸妥布霉素注射液硫酸奈替米星硫酸小諾霉素硫酸奈替米星注射液硫酸小諾霉素口服溶液硫酸依替米星硫酸小諾霉素片硫酸依替米星注射液硫酸小諾霉素注射液注射用硫酸依替米星硫酸巴龍霉素硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射用硫酸核糖霉素硫酸卡那霉素注射液硫酸鏈霉素硫酸卡那霉素滴眼液注射用硫酸鏈霉素注射用硫酸卡那霉素大豆磷脂硫酸西索米星膽固醇硫酸西索米星注射液蛋黃卵磷脂色譜法的應用：蒸發光散射檢測器圖硫酸核糖霉素有關物質色譜圖（蒸發管溫度：110℃，不分流模式）總雜質：4.18%蒸發光散射檢測器應用要點：謹慎使用，充分優化實驗條件。企業質控人員和藥檢所人員均需要。漂移管溫度的優化：溫度對響應值的影響無明顯的規律性。最優溫度為在流動相基本揮發的基礎上，產生可接受噪音的最低溫度。霧化氣流速的優化：流速越大，響應值越低。最優氣體流速應是在可接受噪音的基礎上，產生最大檢測響應值的最低氣體流速。色譜法的應用：示差折光檢測器原理：連續測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。優點：通用型檢測器缺點：1）對溫度變化敏感

2）對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測

3）屬于中等靈敏度的檢測器山梨醇山梨醇注射液甘露醇甘露醇注射液乳果糖口服溶液葡甲胺麥芽糖乳糖倍他環糊精羥丙基倍他環糊精色譜法的應用：電導檢測器原理：根據物質在某些介質中電離后所產生的電導變化來測定電離物質含量。優點：對流動相流速和壓力的改變不敏感，可用于梯度洗脫。缺點：對溫度變化敏感（每升高1度，電導率增加2%-2.5%)。廣泛應用于離子色譜。主要用于檢測水溶性無機和有機離子。帕米膦酸二鈉注射液注射用帕米膦酸二鈉鹽酸頭孢吡肟注射用鹽酸頭孢吡肟氯膦酸二鈉氯膦酸二鈉注射液氯膦酸二鈉膠囊幾種檢測器主要特性比較表檢測器檢測信號選擇性流速影響檢出限g/ml梯度洗脫UV吸光度有無10-10適宜FD熒光強度有無10-13適宜AD電流有有10-13不宜ELSD散射光強度無－10-9適宜RID折光率無無10-7不宜液相色譜法流動相1.重要性：GC載氣僅三四種，要提高柱效選擇性，主要改變固定相的性質；LC則不同，當固定相選定時，流動相的種類，配比能顯著地影響分離效果，因此流動相的選擇很重要。2.選擇流動相應注意的因素3.溶劑的選擇：a.依據：溶劑的極性是重要依據。b.溶劑極性順序，水最大，正已烷最小。c.采用多元組合溶劑系統作為流動相（底液和洗脫液）d.根據不同的方法選擇合適的底液和洗脫液

具體操作時還應注意的事項①流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。②開機后把要用到的管路進行purge（脫氣）處理。

③增加流速應以0.1ml/min的增量逐步進行，一般不超過0.5ml/min，反之亦然。否則易使柱床下塌。

④裝柱時注意流向，接口處不要留有空隙產生氣泡。

⑤樣品液請注意濾過后進樣，注意樣品溶劑的揮發性。

⑥測定完畢請用（甲醇：水=10:90）沖柱1小時，再用（甲醇：水=90:10）沖柱30分鐘，長時間不用應最后再沖15分鐘純甲醇。對于含碳量高、封尾充分的柱，特別注意應先用含5~10%甲醇的水沖洗，再用甲醇沖洗。重溫一下學校里學過的色譜理論知識色譜法中的主要參數和關系式

分配系數Kp和容量因子K'（1）分配系數Kp：定溫定壓下物質在固定相和流動相中的濃度比。

KP＝[A]s/[A]m（s－固定相；m－流動相）（2）容量因子K'：分配系數與兩相體積有關的參數，表示溶質A在兩相中的質量比。

K'=[mA]s/[mA]m=KP×VS/VmＫ`應為1~10Ｒ≥１.5兩個組分能完全分開（3）分離度Ｒ——色譜柱的總分離效能指標

定義：相鄰兩個峰的保留值之差與兩峰寬度平均值之比式中：分子反映了溶質在兩相中分配行為對分離的影響，是色譜分離的熱力學因素。分母反映了動態過程溶質區帶的擴寬對分離的影響，是色譜分離的動力學因素。從中得到：兩溶質保留時間相差越大，色譜峰越窄，分離越好。a:柱效因子：塔板數決定，n越大，柱效越高分離的越好。(色譜柱)分離度與柱效能、選擇性的關系

b：選擇因子：tR’(２)與t’R（1）相差越大，r2,1越大，分的越好。(樣品)C：容量因子：k’大一些對分析有利;太大，tR長；柱容量合適,分的才好。(流動相)一般１＜k’＜１０色譜法的基本理論一、塔板理論

色譜技術發展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經驗理論－塔板理論用于色譜分析法。塔板理論把色譜柱比作一個分餾塔，假設柱內有n個塔板，每個塔板高度稱為理論塔板高度，用H表示，在每個塔板內，試樣各組分在兩相中分配并達到平衡，最后，揮發度大的組分和揮發度小的組分彼此分離，揮發度大的最先從塔頂（即柱后）逸出。盡管這個理論并不完全符合色譜柱的分離過程，色譜分離和一般的分餾塔分離有著重大的差別，但是因為這個比喻形象簡明，因此幾十年來一直沿用。一、塔板理論塔板理論公式H=L/n*n=5.54(tR/Wh/2)2

=16(tR/W)2

二、速率理論—范第姆特方程

用塔板理論來說明色譜柱內各組分的分離過程并不完全合理，因為色譜柱內并沒有塔板，當同一試樣進入同一色譜柱，當流動相速度變化時，得到不同的色譜圖。測得的

n（塔板數）和H（柱效）也不同，充分說明塔板理論不足以說明色譜柱的分離過程。1956年，荷蘭學者范第姆特（VanDeomter）提出一個描述色譜柱分離過程中復雜因素使色譜峰變寬而致柱效降低（即：使H增大）影響的方程。此方程經簡化后寫為:該式稱為速率方程（范氏方程）。

u為流動相線速度cm.s-1，線速度=柱長/死時間速率理論—范第姆特方程

（1）提出了影響Ｈ的三項因素：A渦流擴散項，B分子擴散項，C傳質阻力項。（2）在流動相流速一定時，當Ａ、Ｂ、Ｃ最小時，Ｈ小，n才最高，柱效高。當Ａ、Ｂ、Ｃ最大時，Ｈ大，n才最小，柱效低。（1）渦流擴散項A在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴散。

A＝2λdpA與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規則因子λ有關。減小Ａ：固定相顆粒應適當細小、填充要均勻。待測組分是以“塞子”的形式被流動相帶入色譜柱的，在“塞子”前后存在濃度梯度，由濃→稀方向擴散，產生了縱向擴散，使色譜峰展寬。（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

由于溶質區帶前后存在著濃度差，因而產生縱向擴散使區帶（色譜峰）擴寬。由于分子在液體中的擴散速率大約是在氣體中的1/105，所以該項對液相色譜來說很小，而對氣相色譜則很重要。擴散的嚴重與否，關鍵是取決于流動相的線速度。減小縱向擴散項Ｂ／u采取措施（針對氣相色譜）①適當提高流動相流速u，減小保留時間②用相對分子質量較大的氣體作流動相。

B＝2γDgDg∝③適當降低柱溫Ｔc。（3）傳質阻力項Cu傳質阻力系數C包括兩部分，Ｃ＝Ｃg+Cl兩項組成Cg—流動相傳質阻力系數

組分從流動相移動到固定相表面進行兩相之間的質量交換時所受到的阻力，質量交換慢，引起色譜峰變寬。gCl—固定相傳質阻力系數

即組分從兩相界面移動到固定相內部，達分配平衡后，又返回到兩相界面，在這過程中所受到的阻力為固定相傳質阻力。2組分在固定相中擴散系數固定液膜厚度減小Ｃ采取措施：①采用粒度小的填充物；②Dl越大越好，增加柱溫是提高Dl的方法之一。

液相色譜條件的試驗評價基線柱效分離度峰的對稱性（T、S、AS）結果的重復性（RSD）系統適用性試驗系統適用性試驗是在正式檢測之前進行預試驗，對目前實驗條件所產生的分離效果及測定結果進行評價，確認儀器狀態及實驗條件達到一定要求后才可進行有效的測定。如系統適用性試驗達不到要求，應對條件進行調整使最終符合要求。

藥典正文給出的條件，在不改變性質的基礎上可按具體實驗情況作出適當的調整,以符合系統適用性試驗的要求。代表性質的有：色譜柱的填體，流動相的成份，檢測波長等。

常作出調整的有：流速，流動相中水相與有機相的配比等。

測定精度的控制1.儀器狀態良好,通過檢定/校準

a.基線b.流速穩定性c.最低檢測限d.結果重現性2.色譜柱狀態良好3.流動相的配制

試藥選用化學純以上,最好是分析純,水用重蒸餾水,有機溶劑選用符合色譜要求的試劑，流動相用前經脫氣處理。4.合理設定參數；5.符合系統適用性試驗要求；6.溶液配制按容量分析要求,并注意溶液的穩定性；7.用外標法測定時儀器最好配有定量環或自動進樣,沒有配備的儀器最好選用內標法；8.適當的保留時間；9.其他

開頭幾份結果一般不要；對供試品色譜圖不完全了解之前應先走一份時間較長的圖譜；進行雙份平行試驗。滴定分析法滴定分析是化學分析中的一類重要的分析方法。此類分析方法是將一種已知濃度的液體即滴定溶液用滴定管加到被測物質的溶液中，直到所加滴定液和被測組分按化學計量反應完全為止。優點：精密度和準確度高，操作簡便，至今仍是組分單一原料藥含量測定的首選方法；快速經濟、儀器簡單。缺點：專屬性不足，對組分較多的制劑，需較繁瑣的前處理，可損失一定的精密度和準確度。滴定分析法

滴定分析應符合以下條件：-a、反應應朝一個方向完全進行（完全、>99.9%）；-b、反應嚴格按化學計量式進行；-c、反應迅速，必要時通過加熱或加催化劑等方法加速反應；-d、共存物不得干擾測定，或能用適當方法消除；-e、確定等當點的方法簡單靈敏；-f、標化滴定液所用基準物質易得，且符合純度高、組分恒定且與化學式符合、性質穩定（標化時無副反應）等。滴定分析法分類根據化學反應不同-分酸堿滴定、沉淀滴定、絡合滴定、氧化還原滴定；按滴定方式-分直接滴定和剩余滴定（也稱回滴定、間接滴定）。滴定分析法操作注意事項

滴定液消耗體積：若使用50ml滴定管，最好在30～40ml范圍內；用25ml滴定管，最好在20～25ml范圍內，減少讀數引起得相對誤差。如：滴定管體積讀數誤差一般認為是0.02ml，如果消耗滴定液體積為10ml，則其相對誤差為0.02÷10×100％＝0.2%；體積為20ml，其相對誤差為0.1%。滴定速度：不可過快，每秒放出3～4滴為宜，即“成滴不成串”，過快液體來不及自管壁流下而致讀數不準，滴定至近終點時，速度要更慢，懸掛在滴定管尖端的液滴必須與錐形瓶壁接觸使之落下并用洗瓶沖洗錐形瓶壁。滴定管內壁應潔凈：以不掛水珠為宜，用前用滴定液少許沖洗2～3次。滴定分析法操作注意事項儀器要求：所用容量儀器均應符合計量要求，用于原料藥含量、仲裁品種、邊緣品種等測定時，應使用帶校正值的容量儀器。其校正值與標示值之比的絕對值大于0.05%時，應在計算中采用校正值予以補償。溫度要求：對某些熱膨脹系數大的滴定液如高氯酸滴定液，滴定溫度與標化溫度不一致時，如溫度相差在10℃以下，高氯酸滴定液的濃度應進行必要的校正，溫度相差超過10℃，應重新標定。滴定液濃度要求：F值應在0.95~1.05之間

F=實際濃度/理論濃度滴定分析法計算直接滴定法

-原料：（Ｖ－Ｖ空白