項目八水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-1現(xiàn)場調(diào)查一、異常現(xiàn)象二、池水理化狀態(tài)三、飼養(yǎng)管理情況任務(wù)8-1現(xiàn)場調(diào)查一、異常現(xiàn)象異常現(xiàn)象--當(dāng)水產(chǎn)動物患病后，通常體色、游動、攝食發(fā)生異常變化，出現(xiàn)各種異常現(xiàn)象。（1）活力和游泳行為患病的個體常離群獨游于水面或水層中，活力差，反應(yīng)也較遲鈍；有的在水面上打轉(zhuǎn)或上下翻動，有的側(cè)臥或匍匐于水底。（2）攝食和生長患病的個體體質(zhì)消瘦，很少進食；在魚苗、蝦苗、貝苗期，還可觀察到消化道內(nèi)無食物。（3）體色和肢體患病的個體外表失去光澤，體色暗淡或褪色。魚類爛鰭、鱗片脫落或豎起等；蝦類附肢變紅或殘缺，甲殼潰瘍；貝類外套膜萎縮、足部潰爛或出現(xiàn)膿包等。異常現(xiàn)象--當(dāng)水產(chǎn)動物患病后，通常體色、游動、攝食發(fā)生異常變異常現(xiàn)象微生物疾病：充血、出血、變黑、瘦弱和發(fā)炎等癥狀。寄生蟲疾病：煩躁不安、死亡率不高。化學(xué)因子：跳躍、沖撞等興奮現(xiàn)象。異常現(xiàn)象池水理化狀態(tài)

實地觀察養(yǎng)殖環(huán)境如池塘的面積、結(jié)構(gòu)、進排水系統(tǒng)、土質(zhì)和水深等；檢查養(yǎng)殖水體的水色是否呈現(xiàn)濃綠、黑褐、污濁，是否有氣泡上浮等不良現(xiàn)象；檢查養(yǎng)殖水質(zhì)如透明度、溫度、鹽度、pH、溶解氧、氨氮是否在養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的承受范圍；檢查池中底泥有無過多的有機物質(zhì)沉積，使底泥變黑變臭等；還應(yīng)了解池塘中生物的優(yōu)勢種類和數(shù)量。池水理化狀態(tài)實地觀察養(yǎng)殖環(huán)境如池塘的面積、結(jié)構(gòu)、進排水系池水理化狀態(tài)溶解氧低—浮頭缺氧—泛池酸性水—嗜酸性卵藻的爆發(fā)硬度高—小三毛金藻大量繁殖—魚中毒死亡重金屬—彎體病池水理化狀態(tài)溶解氧低—浮頭缺氧—泛池飼養(yǎng)管理情況1、檢查養(yǎng)殖池的放養(yǎng)密度是否過大；每天投餌的數(shù)量、次數(shù)和時間是否適宜；餌料的質(zhì)量及營養(yǎng)成分是否安全；殘余餌料的清除是否及時；換水或加水的數(shù)量和間隔的時間是否合理；使用的工具是否消毒等。2、了解水產(chǎn)動物發(fā)病的時間，發(fā)病率，有無死亡，死亡的數(shù)量等；有無進行藥物治療，用藥的種類、數(shù)量、方法和治療效果；有無采取其他措施，如灌水或換水；該病過去是否發(fā)生過，曾發(fā)生的疾病種類、經(jīng)過等情況。飼養(yǎng)管理情況1、檢查養(yǎng)殖池的放養(yǎng)密度是否過大；每天投餌的數(shù)量飼養(yǎng)管理情況----向池水投入大量未發(fā)酵的人、畜糞便或尿液。池水有機物增多—溶解氧—魚缺氧死亡池水有機物增多—池水發(fā)臭—鰓霉病池水有機物增多—池水發(fā)臭—病原微生物----飼養(yǎng)不當(dāng)長期缺乏飼料水質(zhì)較瘦—萎癟病、跑馬病飼養(yǎng)管理情況----向池水投入大量未發(fā)酵的人、畜糞便或尿液。任務(wù)8-2魚體檢查一、目檢二、鏡檢（一）檢查方法：（二）檢查部位：任務(wù)8-2魚體檢查一、目檢一、目檢

所謂目檢，就是用肉眼對患病個體的體表直接進行觀察。觀察水產(chǎn)動物體色、體表、附肢、口腔和鰓有無異常；檢查體表、鰭（附肢）、鰓、口腔上有無大型寄生蟲。一、目檢所謂目檢，就是用肉眼對患病個體的體表直接進行觀察體表：檢查魚體左右兩側(cè)。將病魚或剛死的魚置于白瓷盤中，按順序仔細觀察。鰓：重點檢查鰓絲。注意鰓蓋是否張開，鰓蓋表皮是否腐爛或變成透明。內(nèi)臟：檢查腸道為主。剖開后檢查是否有腹水和肉眼可見的大型寄生蟲。其次檢查內(nèi)臟，肝、膽、鰾等外觀是否正常。再進行分離剖檢。體表：二、鏡檢

鏡檢時，取樣要有代表性，供鏡檢的病料能代表一個養(yǎng)殖水體中患病的群體。鏡檢應(yīng)按先體外后體內(nèi)[體表、鰓、血液（血淋巴）、消化道、肝（肝胰腺）、脾、腎、心臟、肌肉、性腺]的順序，取下各器官、組織，置于不同的器皿內(nèi)。從患病個體病變處中刮取黏液或取部分組織，制成水浸片后用光學(xué)顯微鏡檢查。對可疑的病變組織或難以辨認的病原體，要用相應(yīng)的固定液或保存液固定或保存，以供進一步進行病理學(xué)診斷。二、鏡檢

鏡檢時，取樣要有代表性，供鏡檢的病料能代表一個養(yǎng)檢查方法：1、玻片壓縮法將要檢查的器官及組織的一部分或黏液、腸內(nèi)含物，放在載玻片上，滴入少許清水或生理鹽水，用另一玻片將它壓成透明的薄層，然后放在解剖鏡或低倍鏡下檢查。2、載玻片法將要檢查的小塊組織或小滴內(nèi)含物放在載玻片上，滴入清水或生理鹽水，蓋上蓋玻片，輕輕地壓平后放在低倍鏡下檢查。檢查方法：檢查部位1、黏液用剖解刀刮取少許黏液，用顯微鏡或解剖鏡檢查。2、鼻腔肉眼觀察有無寄生蟲或病狀，然后用小鑷子或微吸管從鼻腔取少量內(nèi)含物，用顯微鏡檢查。隨后用吸管吸取少許清水注入鼻孔中，再將液體吸出，放在培養(yǎng)皿里，用低倍鏡或解剖鏡觀察。3、血液

（1）鰓：鰓動脈取血，直接鏡檢。

（2）心臟：心臟直接取血，用尖細管插入心臟，吸取血液。

檢查部位4、鰓取出鰓片放在培養(yǎng)皿里，仔細觀察鰓上有肉眼可見寄生蟲、鰓顏色或其他病象。5、口腔

先用肉眼仔細觀察上下顎，觀察有無寄生蟲。6、體腔

沿腹線剪開魚腹，再將剪刀移至肛門，朝向側(cè)線，沿體腔的后邊剪斷，再與側(cè)線平行地向前一直剪到鰓蓋的后角，剪斷肩帶骨，然后再向下剪開鰓腔膜，直到腹面的切口，將整塊體壁剪下，體腔里的器官即可顯露出來。4、鰓7.脂肪先用肉眼觀察，如果發(fā)現(xiàn)白點，可能是黏孢子蟲，須在顯微鏡下壓片檢查。8.胃腸盡量除盡凈腸外壁所有的脂肪組織，把腸前后伸直，擺在解剖盤上。有些魚例如鱅、鰱魚，腸特別長，可把腸作盤繞壯擺好，先用肉眼檢查，腸外壁上往往有許多小白點，通常是黏孢子蟲的胞囊。肉眼檢查完畢后，把腸分成前（胃）、中、后腸三段，在各段上各取一點，用剪刀開一個小小的切口（與腸平行），用鑷子從切口取一小滴內(nèi)含物放在載玻片上，滴上一小滴生理鹽水，蓋上玻片。7.脂肪9.肝先肉眼觀察肝臟外表，注意其顏色及有無潰爛、病變、白點和瘤等現(xiàn)象。如果有白點，往往·是黏孢子蟲或球蟲。然后用鑷子從肝上取少許組織放在載玻片，蓋上蓋玻片，輕輕壓平，在低倍鏡和高倍鏡下檢查。10.脾鏡檢脾臟少許組織，往往可發(fā)現(xiàn)黏孢子或胞囊，有時也可發(fā)現(xiàn)吸蟲的囊蚴。11.膽囊取出膽囊后，放在培養(yǎng)皿里，先觀察外表，注意它的顏色有無變化，有無其他可疑病象等，然后取出一部分膽囊壁，放在載玻片上，蓋上蓋玻片，壓平，放在顯微鏡下觀察。9.肝12.心臟取出心臟放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿里。13.鰾用鑷子剝?nèi)△B的內(nèi)壁和外壁的薄膜，放在載玻片上排平，滴入少許生理鹽水，在顯微鏡下觀察。14.腎取腎應(yīng)當(dāng)完整，分前、中、后三段檢查，各查兩片。15.膀胱完整地取出膀胱放在玻片上，沒有膀胱的角，則檢查輸尿管。水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件16.性腺取出左、右兩個性腺，先用肉眼觀察它的外表。17.眼用彎頭鑷子從眼窩里挖出眼睛，放在玻璃皿或玻片上，剖開鞏膜，放在玻璃體和水晶體，在低倍顯微鏡下檢查，可發(fā)現(xiàn)吸蟲幼蟲、黏孢子蟲。18.腦打開腦腔，用吸管吸出油脂物質(zhì)，灰白色的腦即顯露出來。16.性腺19.脊髓把頭部與軀干交接處脊椎骨剪斷，再把身體的尾部與軀干交接處的脊椎骨也剪斷，用鑷子從前端的斷口插入脊髓腔，把脊髓夾住，慢慢地把脊髓整條拉出來，分前、中、后等部分檢查，可發(fā)現(xiàn)黏孢子蟲和復(fù)殖吸蟲的幼蟲。20.肌肉首先剖開一部分皮膚，再用鑷子把皮膚剝?nèi)ィ萌庋蹤z查后，先在前、中、后等部分分取一小片肌肉放在載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕壓平，在顯微鏡下觀察，再用壓縮法檢查。水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-2魚體檢查（三）檢查注意事項1、用活或剛死的魚檢查2、保持魚體濕潤3、取出的內(nèi)臟器官除保持濕潤外，還要保持器官的完整4、用過的工具要洗干凈后再使用5、一時無法確定的病原體或病象要保留好標(biāo)本任務(wù)8-2魚體檢查（三）檢查注意事項任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷與病毒的檢測一、細菌性疾病的診斷病原分離——純化培養(yǎng)——人工感染——病原種類鑒定任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷與病毒的檢測細菌性疾病的診斷一、病料的采集與準(zhǔn)備

采集樣本應(yīng)注意：①嚴格無菌操作，盡量避免標(biāo)本被雜菌污染；②采集處于不同發(fā)病時期的樣本和健康對照樣本；③樣本必須新鮮，盡快送檢；④盛裝樣本的容器中必須加原塘水；⑤對疑似烈性傳染病或人畜共患病標(biāo)本，嚴格按相應(yīng)的生物安全規(guī)定包裝、冷藏、專人遞送；⑥樣本應(yīng)做好標(biāo)記，并在相應(yīng)檢驗單中詳細填寫檢驗?zāi)康摹颖痉N類、臨診診斷初步結(jié)果等。細菌性疾病的診斷二、細菌的分離1.細菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查

凡在形態(tài)和染色性上具有特征的致病菌（如病魚腦中的鏈球菌），樣本直接涂片染色（如革蘭氏染色法）后，顯微鏡觀察可以進行初步診斷。很多細菌僅憑形態(tài)學(xué)不能作出確切診斷，需經(jīng)細菌的分離培養(yǎng)，并進行生化反應(yīng)和血清學(xué)等進一步鑒定，才能明確感染的細菌。2.分離培養(yǎng)

原則上應(yīng)對所有送檢樣本做分離培養(yǎng)，獲得單個菌落后進行純培養(yǎng)，從而對細菌做進一步鑒定。分離培養(yǎng)后，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色、表面形狀、透明度和溶血性等對細菌作出初步識別，同時，取單個菌落再次進行革蘭氏染色鏡檢觀察。二、細菌的分離三、病原菌的鑒定1.動物回歸試驗將分離的細菌重新感染健康魚，如果發(fā)生同樣的癥狀，且從這些發(fā)病的魚體上能再度分離培養(yǎng)出這種細菌來，則證明分離的細菌為病原菌（柯赫法則，Kochpostulates）。2.病原菌的分子診斷常用的方法主要有PCR技術(shù)和核酸雜交技術(shù)，具體方法同病毒性疾病的診斷。其中PCR技術(shù)常采用細菌的16SrDNA分子鑒定技術(shù)，引物為細菌的通用引物（27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；1492R：5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3'）。但該方法一般只能準(zhǔn)確鑒定到屬。三、病原菌的鑒定3.病原菌的生化鑒定

利用各種細菌的生化反應(yīng)，可對分離到的細菌進行鑒定。目前，多種微量、快速、半自動和全自動的細菌檢測系統(tǒng)和儀器已廣泛應(yīng)用于臨診，能較準(zhǔn)確地鑒定出臨診上常見的致病菌。但由于目前這些檢測儀器中的細菌數(shù)據(jù)庫主要針對的是人類和哺乳類動物的病原菌，對一些水生動物病原菌的信息沒有包含進去，因此，有些時候還需要參考《伯吉細菌鑒定手冊》。3.病原菌的生化鑒定 4.病原菌的血清學(xué)診斷

有些細菌即使進行生化試驗也難以鑒別，但可根據(jù)其抗原成分（包括菌體抗原、鞭毛抗原）不同，采用血清學(xué)方法進行鑒別。利用已知的特異性抗體檢測未知細菌抗原，可以確定菌種或菌型。常用的免疫檢測技術(shù)，有凝集反應(yīng)、免疫標(biāo)記抗體技術(shù)等。（1）凝集反應(yīng)

細菌、紅細胞等顆粒性抗原，或吸附在紅細胞、乳膠顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)可分為直接凝集試驗、間接凝集試驗。4.病原菌的血清學(xué)診斷①直接凝集試驗

A.玻片法

主要用于細菌的為定性試驗。將含有已知抗體的診斷血清（適當(dāng)稀釋）與待檢菌液各滴一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速。也可用已知的診斷抗原懸液，檢測待檢血清中是否存在相應(yīng)抗體，間接判斷動物是否被細菌感染。B.試管法

一種定量試驗，用以檢測血清中是否存在相應(yīng)抗體和測定血清的抗體效價（滴度），可作臨床診斷或流行病學(xué)調(diào)查。將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后加入等量抗原，置37℃水浴觀察數(shù)小時，視不同凝集程度記錄為++++（100%凝集）、+++（75%凝集）、++（50%凝集）、+（25%凝集）和-（不凝集）。①直接凝集試驗 ②間接凝集試驗

常用的載體有綿羊紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒等。抗原多為可溶性蛋白質(zhì)，如細菌裂解物或浸出液、病毒、寄生蟲分泌物、裂解物或浸出液，以及各種蛋白質(zhì)抗原。應(yīng)用較多的是間接血凝試驗和乳膠凝集試驗，即以紅細胞或乳膠顆粒為載體，將可溶性抗原或抗體致敏于紅細胞或乳膠顆粒表面，用于檢測相應(yīng)抗體或抗原。②間接凝集試驗 (2)免疫標(biāo)記抗體技術(shù)

主要有免疫熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，具體同病毒性疾病的血清學(xué)檢測。(2)免疫標(biāo)記抗體技術(shù) 四、藥物敏感性試驗

在確定病原菌后，臨診上按常規(guī)用藥又沒有明顯療效時，有必要做抗菌藥物敏感試驗。藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素藥物的微生物學(xué)試驗。其大致方法是：取含致病菌的液體培養(yǎng)基均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)一定時間后觀察結(jié)果。由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關(guān)系。近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、準(zhǔn)確。四、藥物敏感性試驗 水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷

與病毒的檢測二、病毒檢測方法1、根據(jù)癥狀診斷2、組織學(xué)檢測3、電鏡檢查4、試劑盒等快速診斷任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷

與病毒的檢測二、病毒檢測方法一、病料的采集與準(zhǔn)備

一般采集瀕死或者出現(xiàn)臨床癥狀的水生動物的組織病料，最好在魚樣本采集之后24h內(nèi)進行病毒的提取，如果溫度保持0~4℃在48h以內(nèi)也可以。把臨床樣本冷凍貯存在-80~-20℃，可以保存更長時間，但要避免樣品的反復(fù)凍融。要對已發(fā)生的疾病進行診斷，建議最少采集100個幼體標(biāo)本，50個后期幼體，10個稚體或成體標(biāo)本。如果臨床癥狀明顯，可采集更多的數(shù)量。病毒性疾病的診斷一、病料的采集與準(zhǔn)備病毒性疾病的診斷二、病毒的分離鑒定1.病毒的分離與培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)是用于魚類病毒分離與培養(yǎng)最常用的方法，不同病毒有不同的敏感細胞系，但對于蝦蟹類和貝類病毒而言，目前還沒有被正式確認的細胞系，因此，蝦蟹類和貝類病毒的增殖培養(yǎng)，是用已知的易感宿主進行病毒的體內(nèi)擴增。常用的魚類細胞系，主要有鯉上皮瘤細胞（EPC）、大麻哈魚胚胎細胞（CHSE-214）、胖頭肌肉細胞（FHM）、虹鱒性腺細胞（RTG-2）、草魚性腺細胞（CO）、草魚腎臟細胞（CIK）、鲇性腺細胞（CCO）、藍太陽魚鰓細胞（BF-2）、錦鯉鰭條細胞（KF）、鱸鰭細胞（GF）、鯉腦細胞（CCB）等。二、病毒的分離鑒定（1）病毒的提取

用研缽、研桿或電攪拌器將樣品勻漿成糊狀，按1∶10的最終稀釋度重懸于培養(yǎng)液中，于2~5℃下在冷凍離心機中2000~4000g，離心15min，收集上清液，加入抗生素。（2）細胞的接種

接種用的細胞必須是24h之內(nèi)培養(yǎng)的單層細胞。接種量和培養(yǎng)基的容量比例約為1∶10，在40~150倍的顯微鏡下定期觀察是否出現(xiàn)CPE（細胞病變效應(yīng)），如果觀察到明顯的CPE，可進一步進行病毒的鑒定。（1）病毒的提取CPE（細胞病變效應(yīng)）CPE（細胞病變效應(yīng)）2.病毒的鑒定（1）病毒形態(tài)學(xué)鑒定

可通過電子顯微鏡觀察病毒的形態(tài)和大小。（2）病毒的血清學(xué)鑒定

病毒分離后，可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體，對病毒株進行血清學(xué)鑒定，以確定病毒的種類、血清型及其亞型。（3）分子生物學(xué)鑒定

可采用PCR技術(shù)擴增病毒的特定基因，也可采用核酸雜交技術(shù)，鑒定分離的病毒。2.病毒的鑒定三、病毒感染單位的測定

測定樣本中病毒濃度，即病毒滴度，是病毒學(xué)中最重要的技術(shù)之一。常用于病毒滴度測定的技術(shù)，有空斑試驗、終點稀釋法、熒光-斑點試驗和轉(zhuǎn)化試驗等，最常用的是前兩者。三、病毒感染單位的測定1.空斑試驗

空斑試驗是一種可靠的病毒滴度測定方法，通過病毒接種細胞上覆蓋瓊脂限制病毒自由擴散，使病毒只限于感染周圍細胞，形成感染病毒的斑點即空斑。通過中性紅或結(jié)晶紫對感染細胞染色，活細胞可著色，病毒感染死亡細胞則因不能著色而形成透明空斑。根據(jù)待測樣品的稀釋度和空斑數(shù)，可計算出單位體積病毒液的空斑形成單位（PFU），得到病毒滴度。

空斑試驗是純化和滴定病毒的重要手段，但有些病毒或毒株不能形成空斑，不適用于空斑測定。1.空斑試驗空斑試驗空斑試驗2.終點稀釋法

終點稀釋法是用確定病毒對動物的毒力和滴度的重要方法，可測定幾乎所有種類的病毒，包括某些不能形成空斑的病毒。通常可選擇4~6個稀釋度，接種一定數(shù)量的細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游铮總€稀釋度做3~6個重復(fù)。

采用細胞培養(yǎng)測定病毒時，一般用半數(shù)感染量（TCID50）作為病毒感染的滴度；用雞胚或動物測定時，可測定半數(shù)致死量（LD50；對于水生動物病毒，一般采用半數(shù)致死量（LD50）和半數(shù)感染量（TCID50）作為病毒滴度的測定方法。2.終點稀釋法四、病毒感染的血清學(xué)診斷1.病毒中和試驗

根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗稱為中和試驗，能判定被檢血清中的抗體中和病毒的能力——中和效價。2.免疫熒光抗體技術(shù)

用熒光素對抗體進行標(biāo)記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原的方法。四、病毒感染的血清學(xué)診斷3.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項診斷技術(shù)。其原理是用已知酶標(biāo)抗體檢測未知抗原（病毒），包括四種基本方法，即直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。4.免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)

病毒蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印到對蛋白質(zhì)有很強親和性的濾膜（如硝酸纖維素濾膜）上，經(jīng)免疫染色（如免疫酶染色）檢測結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 五、病毒感染的分子診斷1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及序列分析

PCR用于DNA病毒的檢測，如果是RNA病毒，則需在擴增之前進行反轉(zhuǎn)錄。2.核酸雜交

也稱為原位雜交，包括DNA雜交（Southern雜交）和RNA雜交（Nouthern雜交）。原理是用標(biāo)記的病毒核酸序列探針檢測結(jié)合到濾膜上的病毒DNA或RNA，用于檢測DNA病毒或RNA病毒。3.DNA芯片

該技術(shù)是將病毒DNA片段有序地固定于支持物（如玻片、硅片）的表面，組成密集二維分子排列，然后與標(biāo)記的待測樣本中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描，對雜交信號的強度進行快速、并行和高效地檢測分析，從而可檢測樣品中靶分子的數(shù)量。該技術(shù)可用于大批量樣本的檢測和不同病毒病的鑒別診斷。五、病毒感染的分子診斷任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)一、免疫診斷技術(shù)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、補體結(jié)合試驗4、中和反應(yīng)5、酶聯(lián)免疫吸附試驗6、免疫熒光技術(shù)任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)一、免疫診斷技術(shù)凝集反應(yīng)一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原

(完整的病原微生物或紅細胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩類。間接凝集反應(yīng)：反應(yīng)將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。凝集反應(yīng)一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原(完整的病原微生物或紅細免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測。其原理是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在有電解質(zhì)存在的情況下，按適當(dāng)比例所形成的可見沉淀物現(xiàn)象。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)計的沉淀實驗主要包括絮狀沉淀試驗，環(huán)狀沉淀試驗和凝膠內(nèi)的沉淀試驗。沉淀反應(yīng)分兩個階段，第一階段發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合，第二階段形成可見的免疫復(fù)合物。免疫沉淀反應(yīng)主要用于抗原或者抗體的定性檢測。補體結(jié)合試驗利用抗原抗體復(fù)合物同補體結(jié)合，把含有已知濃度的補體反應(yīng)液中的補體消耗掉使?jié)舛葴p低的現(xiàn)象，以檢出抗原或抗體的試驗，為高敏度檢出方法之一，特別是根據(jù)抗原物質(zhì)的特性，抗原抗體反應(yīng)不能用沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)觀察時也可以利用此法。補體結(jié)合試驗利用抗原抗體復(fù)合物同補體結(jié)合，把含有已知濃度的補中和反應(yīng)特異性抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，能抑制抗原的多種生物活性的反應(yīng)。（毒性、酶活性和病毒感染性等）中和反應(yīng)特異性抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合后，能抑制抗原的多種生物活性酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(以下簡稱ELISA)：是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(以下簡稱ELISA)：免疫熒光技術(shù)將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。

免疫熒光技術(shù)將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)二、分子診斷技術(shù)1、聚合酶鏈反應(yīng)2、核酸分子雜交技術(shù)任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)二、分子診斷技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），又稱無細胞克隆技術(shù)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過活細胞，操作簡便，在數(shù)小時內(nèi)可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerase核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏補充：寄生蟲性疾病的診斷

病原體檢查是寄生蟲病最可靠的診斷方法，但應(yīng)注意在有些情況下動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)寄生蟲，并不一定就引起寄生蟲病。當(dāng)寄生蟲感染數(shù)量較少時，多不引起明顯的臨診癥狀；有些條件性致病寄生蟲，在動物機體免疫功能正常的情況下，也不致病。因此，在判斷某種疾病是否由寄生蟲感染所引起時，除了檢查病原體外，還應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料、臨診癥狀和病理解剖變化等綜合考慮。補充：寄生蟲性疾病的診斷一、體表寄生蟲感染的診斷

寄生于水生動物體表和鰓上的寄生蟲種類比較多，主要有鞭毛蟲、孢子蟲、纖毛蟲、單殖吸蟲、線蟲和甲殼類等。個體較大的寄生蟲，通過肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)，進行進一步鑒別時需取蟲體在顯微鏡下根據(jù)蟲體形態(tài)特征進行鑒別。原蟲和吸蟲類個體較小，常需刮取體表黏液或取其鰓絲進行組織壓片后顯微鏡下觀察，根據(jù)蟲體或蟲卵形態(tài)特征進行鑒別。一、體表寄生蟲感染的診斷二、體內(nèi)寄生蟲感染的診斷

寄生于水生動物體內(nèi)的寄生蟲種類，主要有孢子蟲、復(fù)殖吸蟲、絳蟲和棘頭蟲等。對于它們的檢查，也采用肉眼觀察和顯微鏡鏡檢觀察相結(jié)合的方法。個體較大的，剖開魚腹，取出腸道，通過肉眼觀察即可發(fā)現(xiàn)。原蟲和吸蟲類個體較小，常需取動物組織或孢囊壓片后顯微鏡下觀察，根據(jù)蟲體或蟲卵的形態(tài)特征進行鑒別；對于一些在血液內(nèi)的寄生蟲，則需進行血液涂片顯微觀察；對于在眼睛內(nèi)的寄生蟲，則需將病魚眼睛挖出，剪破后取出水晶體放在生理鹽水中，刮下水晶體表面一層，用顯微鏡檢查，或在光線亮的地方用肉眼仔細觀察。二、體內(nèi)寄生蟲感染的診斷本章結(jié)束本章結(jié)束項目八水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-1現(xiàn)場調(diào)查一、異常現(xiàn)象二、池水理化狀態(tài)三、飼養(yǎng)管理情況任務(wù)8-1現(xiàn)場調(diào)查一、異常現(xiàn)象異常現(xiàn)象--當(dāng)水產(chǎn)動物患病后，通常體色、游動、攝食發(fā)生異常變化，出現(xiàn)各種異常現(xiàn)象。（1）活力和游泳行為患病的個體常離群獨游于水面或水層中，活力差，反應(yīng)也較遲鈍；有的在水面上打轉(zhuǎn)或上下翻動，有的側(cè)臥或匍匐于水底。（2）攝食和生長患病的個體體質(zhì)消瘦，很少進食；在魚苗、蝦苗、貝苗期，還可觀察到消化道內(nèi)無食物。（3）體色和肢體患病的個體外表失去光澤，體色暗淡或褪色。魚類爛鰭、鱗片脫落或豎起等；蝦類附肢變紅或殘缺，甲殼潰瘍；貝類外套膜萎縮、足部潰爛或出現(xiàn)膿包等。異常現(xiàn)象--當(dāng)水產(chǎn)動物患病后，通常體色、游動、攝食發(fā)生異常變異常現(xiàn)象微生物疾病：充血、出血、變黑、瘦弱和發(fā)炎等癥狀。寄生蟲疾病：煩躁不安、死亡率不高。化學(xué)因子：跳躍、沖撞等興奮現(xiàn)象。異常現(xiàn)象池水理化狀態(tài)

實地觀察養(yǎng)殖環(huán)境如池塘的面積、結(jié)構(gòu)、進排水系統(tǒng)、土質(zhì)和水深等；檢查養(yǎng)殖水體的水色是否呈現(xiàn)濃綠、黑褐、污濁，是否有氣泡上浮等不良現(xiàn)象；檢查養(yǎng)殖水質(zhì)如透明度、溫度、鹽度、pH、溶解氧、氨氮是否在養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的承受范圍；檢查池中底泥有無過多的有機物質(zhì)沉積，使底泥變黑變臭等；還應(yīng)了解池塘中生物的優(yōu)勢種類和數(shù)量。池水理化狀態(tài)實地觀察養(yǎng)殖環(huán)境如池塘的面積、結(jié)構(gòu)、進排水系池水理化狀態(tài)溶解氧低—浮頭缺氧—泛池酸性水—嗜酸性卵藻的爆發(fā)硬度高—小三毛金藻大量繁殖—魚中毒死亡重金屬—彎體病池水理化狀態(tài)溶解氧低—浮頭缺氧—泛池飼養(yǎng)管理情況1、檢查養(yǎng)殖池的放養(yǎng)密度是否過大；每天投餌的數(shù)量、次數(shù)和時間是否適宜；餌料的質(zhì)量及營養(yǎng)成分是否安全；殘余餌料的清除是否及時；換水或加水的數(shù)量和間隔的時間是否合理；使用的工具是否消毒等。2、了解水產(chǎn)動物發(fā)病的時間，發(fā)病率，有無死亡，死亡的數(shù)量等；有無進行藥物治療，用藥的種類、數(shù)量、方法和治療效果；有無采取其他措施，如灌水或換水；該病過去是否發(fā)生過，曾發(fā)生的疾病種類、經(jīng)過等情況。飼養(yǎng)管理情況1、檢查養(yǎng)殖池的放養(yǎng)密度是否過大；每天投餌的數(shù)量飼養(yǎng)管理情況----向池水投入大量未發(fā)酵的人、畜糞便或尿液。池水有機物增多—溶解氧—魚缺氧死亡池水有機物增多—池水發(fā)臭—鰓霉病池水有機物增多—池水發(fā)臭—病原微生物----飼養(yǎng)不當(dāng)長期缺乏飼料水質(zhì)較瘦—萎癟病、跑馬病飼養(yǎng)管理情況----向池水投入大量未發(fā)酵的人、畜糞便或尿液。任務(wù)8-2魚體檢查一、目檢二、鏡檢（一）檢查方法：（二）檢查部位：任務(wù)8-2魚體檢查一、目檢一、目檢

所謂目檢，就是用肉眼對患病個體的體表直接進行觀察。觀察水產(chǎn)動物體色、體表、附肢、口腔和鰓有無異常；檢查體表、鰭（附肢）、鰓、口腔上有無大型寄生蟲。一、目檢所謂目檢，就是用肉眼對患病個體的體表直接進行觀察體表：檢查魚體左右兩側(cè)。將病魚或剛死的魚置于白瓷盤中，按順序仔細觀察。鰓：重點檢查鰓絲。注意鰓蓋是否張開，鰓蓋表皮是否腐爛或變成透明。內(nèi)臟：檢查腸道為主。剖開后檢查是否有腹水和肉眼可見的大型寄生蟲。其次檢查內(nèi)臟，肝、膽、鰾等外觀是否正常。再進行分離剖檢。體表：二、鏡檢

鏡檢時，取樣要有代表性，供鏡檢的病料能代表一個養(yǎng)殖水體中患病的群體。鏡檢應(yīng)按先體外后體內(nèi)[體表、鰓、血液（血淋巴）、消化道、肝（肝胰腺）、脾、腎、心臟、肌肉、性腺]的順序，取下各器官、組織，置于不同的器皿內(nèi)。從患病個體病變處中刮取黏液或取部分組織，制成水浸片后用光學(xué)顯微鏡檢查。對可疑的病變組織或難以辨認的病原體，要用相應(yīng)的固定液或保存液固定或保存，以供進一步進行病理學(xué)診斷。二、鏡檢

鏡檢時，取樣要有代表性，供鏡檢的病料能代表一個養(yǎng)檢查方法：1、玻片壓縮法將要檢查的器官及組織的一部分或黏液、腸內(nèi)含物，放在載玻片上，滴入少許清水或生理鹽水，用另一玻片將它壓成透明的薄層，然后放在解剖鏡或低倍鏡下檢查。2、載玻片法將要檢查的小塊組織或小滴內(nèi)含物放在載玻片上，滴入清水或生理鹽水，蓋上蓋玻片，輕輕地壓平后放在低倍鏡下檢查。檢查方法：檢查部位1、黏液用剖解刀刮取少許黏液，用顯微鏡或解剖鏡檢查。2、鼻腔肉眼觀察有無寄生蟲或病狀，然后用小鑷子或微吸管從鼻腔取少量內(nèi)含物，用顯微鏡檢查。隨后用吸管吸取少許清水注入鼻孔中，再將液體吸出，放在培養(yǎng)皿里，用低倍鏡或解剖鏡觀察。3、血液

（1）鰓：鰓動脈取血，直接鏡檢。

（2）心臟：心臟直接取血，用尖細管插入心臟，吸取血液。

檢查部位4、鰓取出鰓片放在培養(yǎng)皿里，仔細觀察鰓上有肉眼可見寄生蟲、鰓顏色或其他病象。5、口腔

先用肉眼仔細觀察上下顎，觀察有無寄生蟲。6、體腔

沿腹線剪開魚腹，再將剪刀移至肛門，朝向側(cè)線，沿體腔的后邊剪斷，再與側(cè)線平行地向前一直剪到鰓蓋的后角，剪斷肩帶骨，然后再向下剪開鰓腔膜，直到腹面的切口，將整塊體壁剪下，體腔里的器官即可顯露出來。4、鰓7.脂肪先用肉眼觀察，如果發(fā)現(xiàn)白點，可能是黏孢子蟲，須在顯微鏡下壓片檢查。8.胃腸盡量除盡凈腸外壁所有的脂肪組織，把腸前后伸直，擺在解剖盤上。有些魚例如鱅、鰱魚，腸特別長，可把腸作盤繞壯擺好，先用肉眼檢查，腸外壁上往往有許多小白點，通常是黏孢子蟲的胞囊。肉眼檢查完畢后，把腸分成前（胃）、中、后腸三段，在各段上各取一點，用剪刀開一個小小的切口（與腸平行），用鑷子從切口取一小滴內(nèi)含物放在載玻片上，滴上一小滴生理鹽水，蓋上玻片。7.脂肪9.肝先肉眼觀察肝臟外表，注意其顏色及有無潰爛、病變、白點和瘤等現(xiàn)象。如果有白點，往往·是黏孢子蟲或球蟲。然后用鑷子從肝上取少許組織放在載玻片，蓋上蓋玻片，輕輕壓平，在低倍鏡和高倍鏡下檢查。10.脾鏡檢脾臟少許組織，往往可發(fā)現(xiàn)黏孢子或胞囊，有時也可發(fā)現(xiàn)吸蟲的囊蚴。11.膽囊取出膽囊后，放在培養(yǎng)皿里，先觀察外表，注意它的顏色有無變化，有無其他可疑病象等，然后取出一部分膽囊壁，放在載玻片上，蓋上蓋玻片，壓平，放在顯微鏡下觀察。9.肝12.心臟取出心臟放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿里。13.鰾用鑷子剝?nèi)△B的內(nèi)壁和外壁的薄膜，放在載玻片上排平，滴入少許生理鹽水，在顯微鏡下觀察。14.腎取腎應(yīng)當(dāng)完整，分前、中、后三段檢查，各查兩片。15.膀胱完整地取出膀胱放在玻片上，沒有膀胱的角，則檢查輸尿管。水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件16.性腺取出左、右兩個性腺，先用肉眼觀察它的外表。17.眼用彎頭鑷子從眼窩里挖出眼睛，放在玻璃皿或玻片上，剖開鞏膜，放在玻璃體和水晶體，在低倍顯微鏡下檢查，可發(fā)現(xiàn)吸蟲幼蟲、黏孢子蟲。18.腦打開腦腔，用吸管吸出油脂物質(zhì)，灰白色的腦即顯露出來。16.性腺19.脊髓把頭部與軀干交接處脊椎骨剪斷，再把身體的尾部與軀干交接處的脊椎骨也剪斷，用鑷子從前端的斷口插入脊髓腔，把脊髓夾住，慢慢地把脊髓整條拉出來，分前、中、后等部分檢查，可發(fā)現(xiàn)黏孢子蟲和復(fù)殖吸蟲的幼蟲。20.肌肉首先剖開一部分皮膚，再用鑷子把皮膚剝?nèi)ィ萌庋蹤z查后，先在前、中、后等部分分取一小片肌肉放在載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕壓平，在顯微鏡下觀察，再用壓縮法檢查。水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-2魚體檢查（三）檢查注意事項1、用活或剛死的魚檢查2、保持魚體濕潤3、取出的內(nèi)臟器官除保持濕潤外，還要保持器官的完整4、用過的工具要洗干凈后再使用5、一時無法確定的病原體或病象要保留好標(biāo)本任務(wù)8-2魚體檢查（三）檢查注意事項任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷與病毒的檢測一、細菌性疾病的診斷病原分離——純化培養(yǎng)——人工感染——病原種類鑒定任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷與病毒的檢測細菌性疾病的診斷一、病料的采集與準(zhǔn)備

采集樣本應(yīng)注意：①嚴格無菌操作，盡量避免標(biāo)本被雜菌污染；②采集處于不同發(fā)病時期的樣本和健康對照樣本；③樣本必須新鮮，盡快送檢；④盛裝樣本的容器中必須加原塘水；⑤對疑似烈性傳染病或人畜共患病標(biāo)本，嚴格按相應(yīng)的生物安全規(guī)定包裝、冷藏、專人遞送；⑥樣本應(yīng)做好標(biāo)記，并在相應(yīng)檢驗單中詳細填寫檢驗?zāi)康摹颖痉N類、臨診診斷初步結(jié)果等。細菌性疾病的診斷二、細菌的分離1.細菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查

凡在形態(tài)和染色性上具有特征的致病菌（如病魚腦中的鏈球菌），樣本直接涂片染色（如革蘭氏染色法）后，顯微鏡觀察可以進行初步診斷。很多細菌僅憑形態(tài)學(xué)不能作出確切診斷，需經(jīng)細菌的分離培養(yǎng)，并進行生化反應(yīng)和血清學(xué)等進一步鑒定，才能明確感染的細菌。2.分離培養(yǎng)

原則上應(yīng)對所有送檢樣本做分離培養(yǎng)，獲得單個菌落后進行純培養(yǎng)，從而對細菌做進一步鑒定。分離培養(yǎng)后，根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、顏色、表面形狀、透明度和溶血性等對細菌作出初步識別，同時，取單個菌落再次進行革蘭氏染色鏡檢觀察。二、細菌的分離三、病原菌的鑒定1.動物回歸試驗將分離的細菌重新感染健康魚，如果發(fā)生同樣的癥狀，且從這些發(fā)病的魚體上能再度分離培養(yǎng)出這種細菌來，則證明分離的細菌為病原菌（柯赫法則，Kochpostulates）。2.病原菌的分子診斷常用的方法主要有PCR技術(shù)和核酸雜交技術(shù)，具體方法同病毒性疾病的診斷。其中PCR技術(shù)常采用細菌的16SrDNA分子鑒定技術(shù)，引物為細菌的通用引物（27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；1492R：5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3'）。但該方法一般只能準(zhǔn)確鑒定到屬。三、病原菌的鑒定3.病原菌的生化鑒定

利用各種細菌的生化反應(yīng)，可對分離到的細菌進行鑒定。目前，多種微量、快速、半自動和全自動的細菌檢測系統(tǒng)和儀器已廣泛應(yīng)用于臨診，能較準(zhǔn)確地鑒定出臨診上常見的致病菌。但由于目前這些檢測儀器中的細菌數(shù)據(jù)庫主要針對的是人類和哺乳類動物的病原菌，對一些水生動物病原菌的信息沒有包含進去，因此，有些時候還需要參考《伯吉細菌鑒定手冊》。3.病原菌的生化鑒定 4.病原菌的血清學(xué)診斷

有些細菌即使進行生化試驗也難以鑒別，但可根據(jù)其抗原成分（包括菌體抗原、鞭毛抗原）不同，采用血清學(xué)方法進行鑒別。利用已知的特異性抗體檢測未知細菌抗原，可以確定菌種或菌型。常用的免疫檢測技術(shù)，有凝集反應(yīng)、免疫標(biāo)記抗體技術(shù)等。（1）凝集反應(yīng)

細菌、紅細胞等顆粒性抗原，或吸附在紅細胞、乳膠顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)可分為直接凝集試驗、間接凝集試驗。4.病原菌的血清學(xué)診斷①直接凝集試驗

A.玻片法

主要用于細菌的為定性試驗。將含有已知抗體的診斷血清（適當(dāng)稀釋）與待檢菌液各滴一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便、快速。也可用已知的診斷抗原懸液，檢測待檢血清中是否存在相應(yīng)抗體，間接判斷動物是否被細菌感染。B.試管法

一種定量試驗，用以檢測血清中是否存在相應(yīng)抗體和測定血清的抗體效價（滴度），可作臨床診斷或流行病學(xué)調(diào)查。將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后加入等量抗原，置37℃水浴觀察數(shù)小時，視不同凝集程度記錄為++++（100%凝集）、+++（75%凝集）、++（50%凝集）、+（25%凝集）和-（不凝集）。①直接凝集試驗 ②間接凝集試驗

常用的載體有綿羊紅細胞、聚苯乙烯乳膠顆粒等。抗原多為可溶性蛋白質(zhì)，如細菌裂解物或浸出液、病毒、寄生蟲分泌物、裂解物或浸出液，以及各種蛋白質(zhì)抗原。應(yīng)用較多的是間接血凝試驗和乳膠凝集試驗，即以紅細胞或乳膠顆粒為載體，將可溶性抗原或抗體致敏于紅細胞或乳膠顆粒表面，用于檢測相應(yīng)抗體或抗原。②間接凝集試驗 (2)免疫標(biāo)記抗體技術(shù)

主要有免疫熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗等，具體同病毒性疾病的血清學(xué)檢測。(2)免疫標(biāo)記抗體技術(shù) 四、藥物敏感性試驗

在確定病原菌后，臨診上按常規(guī)用藥又沒有明顯療效時，有必要做抗菌藥物敏感試驗。藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素藥物的微生物學(xué)試驗。其大致方法是：取含致病菌的液體培養(yǎng)基均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)一定時間后觀察結(jié)果。由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關(guān)系。近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、準(zhǔn)確。四、藥物敏感性試驗 水產(chǎn)動物疾病防治--項目八-水產(chǎn)動物疾病檢查與診斷技術(shù)(樊敏歡)1分析課件任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷

與病毒的檢測二、病毒檢測方法1、根據(jù)癥狀診斷2、組織學(xué)檢測3、電鏡檢查4、試劑盒等快速診斷任務(wù)8-3細菌性疾病的診斷

與病毒的檢測二、病毒檢測方法一、病料的采集與準(zhǔn)備

一般采集瀕死或者出現(xiàn)臨床癥狀的水生動物的組織病料，最好在魚樣本采集之后24h內(nèi)進行病毒的提取，如果溫度保持0~4℃在48h以內(nèi)也可以。把臨床樣本冷凍貯存在-80~-20℃，可以保存更長時間，但要避免樣品的反復(fù)凍融。要對已發(fā)生的疾病進行診斷，建議最少采集100個幼體標(biāo)本，50個后期幼體，10個稚體或成體標(biāo)本。如果臨床癥狀明顯，可采集更多的數(shù)量。病毒性疾病的診斷一、病料的采集與準(zhǔn)備病毒性疾病的診斷二、病毒的分離鑒定1.病毒的分離與培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)是用于魚類病毒分離與培養(yǎng)最常用的方法，不同病毒有不同的敏感細胞系，但對于蝦蟹類和貝類病毒而言，目前還沒有被正式確認的細胞系，因此，蝦蟹類和貝類病毒的增殖培養(yǎng)，是用已知的易感宿主進行病毒的體內(nèi)擴增。常用的魚類細胞系，主要有鯉上皮瘤細胞（EPC）、大麻哈魚胚胎細胞（CHSE-214）、胖頭肌肉細胞（FHM）、虹鱒性腺細胞（RTG-2）、草魚性腺細胞（CO）、草魚腎臟細胞（CIK）、鲇性腺細胞（CCO）、藍太陽魚鰓細胞（BF-2）、錦鯉鰭條細胞（KF）、鱸鰭細胞（GF）、鯉腦細胞（CCB）等。二、病毒的分離鑒定（1）病毒的提取

用研缽、研桿或電攪拌器將樣品勻漿成糊狀，按1∶10的最終稀釋度重懸于培養(yǎng)液中，于2~5℃下在冷凍離心機中2000~4000g，離心15min，收集上清液，加入抗生素。（2）細胞的接種

接種用的細胞必須是24h之內(nèi)培養(yǎng)的單層細胞。接種量和培養(yǎng)基的容量比例約為1∶10，在40~150倍的顯微鏡下定期觀察是否出現(xiàn)CPE（細胞病變效應(yīng)），如果觀察到明顯的CPE，可進一步進行病毒的鑒定。（1）病毒的提取CPE（細胞病變效應(yīng)）CPE（細胞病變效應(yīng)）2.病毒的鑒定（1）病毒形態(tài)學(xué)鑒定

可通過電子顯微鏡觀察病毒的形態(tài)和大小。（2）病毒的血清學(xué)鑒定

病毒分離后，可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體，對病毒株進行血清學(xué)鑒定，以確定病毒的種類、血清型及其亞型。（3）分子生物學(xué)鑒定

可采用PCR技術(shù)擴增病毒的特定基因，也可采用核酸雜交技術(shù)，鑒定分離的病毒。2.病毒的鑒定三、病毒感染單位的測定

測定樣本中病毒濃度，即病毒滴度，是病毒學(xué)中最重要的技術(shù)之一。常用于病毒滴度測定的技術(shù)，有空斑試驗、終點稀釋法、熒光-斑點試驗和轉(zhuǎn)化試驗等，最常用的是前兩者。三、病毒感染單位的測定1.空斑試驗

空斑試驗是一種可靠的病毒滴度測定方法，通過病毒接種細胞上覆蓋瓊脂限制病毒自由擴散，使病毒只限于感染周圍細胞，形成感染病毒的斑點即空斑。通過中性紅或結(jié)晶紫對感染細胞染色，活細胞可著色，病毒感染死亡細胞則因不能著色而形成透明空斑。根據(jù)待測樣品的稀釋度和空斑數(shù)，可計算出單位體積病毒液的空斑形成單位（PFU），得到病毒滴度。

空斑試驗是純化和滴定病毒的重要手段，但有些病毒或毒株不能形成空斑，不適用于空斑測定。1.空斑試驗空斑試驗空斑試驗2.終點稀釋法

終點稀釋法是用確定病毒對動物的毒力和滴度的重要方法，可測定幾乎所有種類的病毒，包括某些不能形成空斑的病毒。通常可選擇4~6個稀釋度，接種一定數(shù)量的細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游铮總€稀釋度做3~6個重復(fù)。

采用細胞培養(yǎng)測定病毒時，一般用半數(shù)感染量（TCID50）作為病毒感染的滴度；用雞胚或動物測定時，可測定半數(shù)致死量（LD50；對于水生動物病毒，一般采用半數(shù)致死量（LD50）和半數(shù)感染量（TCID50）作為病毒滴度的測定方法。2.終點稀釋法四、病毒感染的血清學(xué)診斷1.病毒中和試驗

根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗稱為中和試驗，能判定被檢血清中的抗體中和病毒的能力——中和效價。2.免疫熒光抗體技術(shù)

用熒光素對抗體進行標(biāo)記，然后用熒光顯微鏡觀察熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原的方法。四、病毒感染的血清學(xué)診斷3.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項診斷技術(shù)。其原理是用已知酶標(biāo)抗體檢測未知抗原（病毒），包括四種基本方法，即直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。4.免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)

病毒蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印到對蛋白質(zhì)有很強親和性的濾膜（如硝酸纖維素濾膜）上，經(jīng)免疫染色（如免疫酶染色）檢測結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 五、病毒感染的分子診斷1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及序列分析

PCR用于DNA病毒的檢測，如果是RNA病毒，則需在擴增之前進行反轉(zhuǎn)錄。2.核酸雜交

也稱為原位雜交，包括DNA雜交（Southern雜交）和RNA雜交（Nouthern雜交）。原理是用標(biāo)記的病毒核酸序列探針檢測結(jié)合到濾膜上的病毒DNA或RNA，用于檢測DNA病毒或RNA病毒。3.DNA芯片

該技術(shù)是將病毒DNA片段有序地固定于支持物（如玻片、硅片）的表面，組成密集二維分子排列，然后與標(biāo)記的待測樣本中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描，對雜交信號的強度進行快速、并行和高效地檢測分析，從而可檢測樣品中靶分子的數(shù)量。該技術(shù)可用于大批量樣本的檢測和不同病毒病的鑒別診斷。五、病毒感染的分子診斷任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)一、免疫診斷技術(shù)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、補體結(jié)合試驗4、中和反應(yīng)5、酶聯(lián)免疫吸附試驗6、免疫熒光技術(shù)任務(wù)8-4

免疫診斷技術(shù)與分子診斷技術(shù)一、免疫診斷技術(shù)凝集反應(yīng)一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原

(完整的病原微生物或紅細胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出