6/6研究生分子生物學知識點分子生物學知識點總結

1.蛋白質組(proteome)：proteinsexpressedbyagenome,即基因組表達的

全套蛋白質。蛋白質組學（Protemics）則是以蛋白質組為研究對象，從整體角度，分析細胞或組織內蛋白質構成的動態(tài)變化和活動規(guī)律的科學。（相互作用網絡PPI）

2.表達蛋白質組學研究的基本流程：蛋白樣品的制備及定量-總蛋白的雙向凝

膠電泳（染色）-凝膠分析軟件分析-膠內酶解（胰肽酶）-質譜分析（肽質量指紋圖譜）-數據庫搜索鑒定蛋白性質

3.雙向凝膠電泳：相互垂直的兩個方向上，分別基于蛋白質不同的等電點和分

子量，先經等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)，再經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）把復雜的蛋白質成分分離。

4.比較蛋白質組學：通過比較同一個體腫瘤細胞（組織）與正常細胞（組織）

之間蛋白質在表達數量、表達位置和修飾狀態(tài)上的差異，發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)病或者發(fā)展有關的分子標記，用來作為腫瘤診斷的腫瘤相關蛋白。

5.軟電離：所謂“軟電離”是指樣品分子電離時保留整個分子的完整性，不會

形成碎片離子。

6.腫瘤血清蛋白質分析方法（tumorserologicproteomeanalysis，SERPA）：

是從腫瘤免疫學觀點出發(fā)建立的一種蛋白質組學和腫瘤免疫學相結合的方法。

SERPA其實驗過程如下：

①雙向電泳分離腫瘤組織（細胞）總蛋白質；

②轉膜；

③建立westernblotting蛋白質印跡反應圖譜（與患者或正常人血清反應）；

④軟件分析確定差異反應的蛋白質斑點；

⑤質譜鑒定和生物信息對腫瘤組織平行膠(replicagel)中相應的差異蛋白

質點進行鑒定，篩選出腫瘤分子標志物；

⑥用ELISA、免疫組化等方法對該分子標志物進行原位驗證，或者進一步分

析該蛋白功能，研究其在腫瘤進展中發(fā)揮的作用。

7.蛋白質芯片：是將大量蛋白質分子按預先設置的排列固定于一種載體表面，

形成微陣列，根據蛋白質分子間特異性結合的原理，構建微流體生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對生物分子的準確、快速、大信息量的檢測。

8.功能蛋白質組學：是指對蛋白質間、蛋白質與DNA/RNA間的相互作用的研究。

以細胞內與某個功能有關或某種條件下的一群蛋白質為主要研究內容，由此建立細胞內外信號傳遞的復雜網絡。研究方法主要有：

●蛋白質芯片技術

目前常用蛋白質芯片有：

1.SELDI-TOF-MS蛋白質芯片

2.抗體芯片

3.靶蛋白質芯片

4.液相蛋白質芯片

●噬菌體展示技術

●酵母雙雜交系統(tǒng)

●免疫共沉淀

9.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗體和抗原之間的專一性作用

為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

10.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理：根據蛋白質分子量不同分離復雜蛋白質

成分。1.制備凝膠試劑：丙烯酰胺（單體）；亞甲雙丙烯酰胺（膠聯(lián)劑）二者比例29：1；母液濃度30%；過硫酸銨（引發(fā)劑引發(fā)交聯(lián)）；N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（TEMED）(加速劑)十二烷基磺酸鈉（SDS）（陰離子變性劑）2.蛋白上樣緩沖液3.電泳緩沖液4.考馬斯亮藍R250染色液5.脫色液

11.Westernblotting基本原理:將SDS分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素

膜(nitrocellulosemembrane)上,在膜上進行固相免疫化學染色,原位顯示蛋白質帶,從而在已知分子量的基礎上對蛋白質進行定性、定量分析。

12.Southwesternblotting基本原理:細胞核蛋白提取物經SDS后,轉移

至NCM上,然后用標記的DNA探針檢測轉移至膜上的蛋白質。細胞死亡形式

表現(xiàn)Celldeath

細胞壞死

Apoptosis

PCD:

細胞生命現(xiàn)象不可逆的停止細胞結構和功能的不可逆喪失。細胞死亡并非與機體死亡同步。正常組織中也發(fā)生細胞死亡，它是維持組織機能和形態(tài)所必需的。細胞受到外來的急性的強力的致病因素作用下，細胞正常代謝活動被強行中斷而引起的“意外”的、被動性死亡過程；只見于病理情況下。細胞腫脹，線粒體和內質網腫脹。核染色質隨機降解呈絮狀,蛋白合成減少。細胞膜、溶酶體破裂,細胞內容物流出,引起周圍炎癥指在一定的生理和病理條件下，多細胞有機體為調控機體發(fā)育、維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制并遵循一定程序的細胞主動性死亡過程.又程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD).凋亡小體：胞膜皺縮內陷、反折，包圍凝集斷裂的染色質、胞質、細胞器等形成芽狀、泡狀突起并分離脫落，形成一些有膜包被，內涵物不外溢的小塊，稱凋亡小體（apoptoticbody）。多細胞生物體在生長發(fā)育過程中，細胞在基因調控下，按照一定時空順序發(fā)生的受到嚴格程序控制的生理性死亡。“特殊的定時自殺”PCDApoptosis功能性概念發(fā)育學概念形態(tài)學概念僅存在于發(fā)育細胞可存在于發(fā)育和成體細胞

大部分凋亡是PCD。PCD的最終結果是凋亡

某些凋亡是非程序性。如細胞毒物誘導的凋亡

13.凋亡的生物學意義1、確保正常生長發(fā)育、2、維持內環(huán)境穩(wěn)定、3、防御功能

14.細胞凋亡的形態(tài)學特征：細胞皺縮;2.細胞質濃縮;3.染色質邊集核膜下，呈塊狀、新月形，4.凋亡小體形成；5.凋

亡小體內有結構完整的細胞器。

細胞凋亡的生化特征：染色質DNA片段化內源性核酸內切酶活化，將核小體間的連接DNA降解，形成長度為

180～200bp整倍數的寡聚核苷酸片段。在瓊脂糖凝膠電泳中呈特征性的“梯狀”條帶（DNAladder：細胞凋亡時DNA在核小體間斷裂(DNAfragmentation)形成一些

DNA片斷，經過提取和純化后在凝膠電泳上產生n條梯狀條帶，故稱之為DNALadder，是判斷DNA損傷的重要標準）

15.Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一組對底物的天冬氨酸部位

有特異水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。

Caspase功能：1.細胞骨架蛋白和核纖層蛋白，導致細胞解體成凋亡小體

2激活DNA酶（Caspase-activatedDNase，CAD）。CAD:Caspase激活的DNA

酶正常情況下CAD與其抑制劑ICAD結合，在胞質內，無活性。凋亡時Caspase水解ICAD,游離的CAD有活性，進入胞核，切割DNA。

3滅活凋亡抑制物:如Bcl-2、ICAD

4水解與DNA損傷修復相關的酶和蛋白質

如聚ADP核糖多聚酶（poly-ADP-ribosepolymerase,PARP）

16.死亡受體途徑外源性途徑：死亡受體TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、

DR5等是一類通過與相應配體結合，傳遞細胞凋亡信號的細胞膜蛋白。

通路（pathway）死亡配體（細胞外）-死亡受體（細胞膜）--相關蛋白（中介蛋白，細胞質內）--激活Caspase8—激活Caspase3細胞凋亡

17.線粒體損傷途徑內源性途徑：線粒體是細胞生命活動的控制中心，它不僅

是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡的調控中心。

①釋放細胞色素C（Cyt.c）

②釋放凋亡誘導因子（apoptosisinducingfactor，AIF）和限制性核酸內切酶G（EndoG）③釋放Smac/Diablo(thesecondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,Smac)(directIAPbingdingprotein,Diablo)④釋放活性氧ROS18.細胞周期：

1.G1期（first）從到前的一段時期，又

稱合成前期，此期主要合成RNA和。該期特

點是活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體

積顯著增大。這一期的主要意義在于為下階

段S期的DNA復制作好物質和能量的準備。

2.S期（synthesis）即DNA合成期，在此

期，除了合成DNA外，同時還要合成。DNA復

制所需要的酶都在這一時期合成。

3.G2期（secondgap）期為DNA合成后期，是有絲分裂的準備期。在這一時

期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括和等。

4.M期：細胞分裂期。

19.細胞周期蛋白或周期素（Cyclins)：一類結構類似、能結合并調節(jié)CDK活性

的蛋白家族，哺乳動物至少有10種，14個成員（cyclinA、B1-2、C、D1-

3、E、F、G1-2、H、I、K）。cyclins-CDKs-CKIs系統(tǒng)

20.HIF-1a：幾乎參與了對糖酵解每一步的調控；PI3K/Akt途徑；Myc；P53等

21.Cyclin：周期素/周期蛋白，是CDK（周期素依賴的蛋白激酶）的調節(jié)亞基，

分別在細胞周期的不同時期積累，激活CDK，使其具有催化關鍵底物的磷酸化修飾并調節(jié)其活性。參與細胞周期中不同時相的調節(jié)。

/S檢驗點：在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restrictionpoint)，22.G

1

控制細胞由靜止狀態(tài)的G

進入DNA合成期，相關的事件包括：DNA是否損傷？

1

細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？

23.cyclinbox：各類周期蛋白均含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周

期蛋白盒(cyclinbox)，是與CDK相互作用的活性區(qū)域。

24.RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是將雙鏈RNA導入細胞內引起特異基

因的mRNA降解的一種細胞反應過程。屬于轉錄后基因沉默的一種。

25.試述CDK1活性的調控機制？

CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調節(jié)。激活因素中，目前認為CDK與周期素的結合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸化是較為重要的兩種調節(jié)因素。抑制因素中，CDK的N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的結合是主要的調節(jié)因素。磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依賴于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就與這兩個酶的激活相關。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK（CDKactivitingkinase），是另一種蛋白激酶CDK7-CyclinH復合物。當磷酸酶-1將此位點的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。磷酸化修飾的抑制作用在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14和Tyr15磷酸化的是兩種不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的為蛋白激酶Myt1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。

26.DNA損傷又稱基因突變：是DNA復制過程中發(fā)生的DNA核苷酸序列的改變，

從分子水平看是DNA分子堿基順序或數目的改變。突變的形式包括：替換、插入、缺失、重排。

27.突變形式：（一）點突變：指DNA分子上一個堿基對的變異，堿基替換包括：

轉換（同型）、顛換（異型）典型疾病：鐮刀型細胞貧血，堿基顛換AT-TA；

（二）插入和缺失-框移突變（frame-shiftmutation）:缺失和插入引起的三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質氨基酸種類、排列順序發(fā)生改變。

(地中海貧血)

（三）重排：指DNA分子內發(fā)生較大片段的交換，也稱重組。移位的DNA片段可在新位點顛倒方向反置（倒位），也可在染色體之間發(fā)生交換重組。

突變的意義：產生新基因，出現(xiàn)新性狀，為生物進化提供了最原始、最根本的的材料，是進化的分子基礎

28.DNA損傷的修復：指針對已發(fā)生的缺陷而進行的補救機制。

直接修復：修復酶識別出損傷部位直接修復，不用切除DNA或切除堿基。包括1.光修復、2.鏈斷裂的直接重接、3.堿基的直接插入、4.轉甲基作用

切除修復(excissionrepair)：在DNA內切酶、外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等多種酶的共同作用下，先將DNA受損的單鏈部位切除，然后以另一條鏈為模板，合成一段正確配對的堿基序列來修補缺口。DNA損傷最普遍的修復形式。

切除修復的特點：（1）切除修復利用的是化學能ATP，也叫暗修復。（2）修復

發(fā)生在復制前。（3）修復的對象是親代DNA。

重組修復：當DNA損傷較大、較嚴重，無法及時修復或缺乏切除修復酶系統(tǒng)，可跳躍損傷部位復制，子鏈形成缺口，復制結束后，在重組基因rec編碼的酶（Rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA連接酶等的作用下，將無損母鏈的DNA片段移到子鏈缺口，進行重組修復。發(fā)生在復制后，故又稱“復制后修復”

DNA損傷重組修復的過程及特點：過程：（1）復制：損傷母鏈復制時，越過損傷部位，子鏈對應位點留下空缺；無損母鏈復制成完整雙鏈。

(2)重組：空缺誘導產生重組酶(Rec蛋白)，RecA與空缺區(qū)結合，并催化子鏈空缺與無損母鏈相應片段重組交換(RecBCD蛋白);有缺子鏈與無損母鏈重組，空缺轉移到無損母鏈，有缺子鏈完整，損傷母鏈仍然保留。

(3)再合成：轉移后的母鏈空缺以新的互補子鏈為模板，在DNA聚合酶和連接酶的催化下，重新修復缺口;

DNA鏈的損傷并未除去，隨著復制的繼續(xù)，損傷ＤＮＡ鏈將在群體中逐步“稀釋”。修復發(fā)生在復制后，對象是子代DNA.

SOS修復：DNA嚴重損傷難以復制或DNA復制系統(tǒng)受抑制的緊急情況下，為了保證DNA鏈的完整性，應急產生校對功能低的修復酶，采用填補任意堿基的修復方式。

這是具有差錯的修復，是對極為不利的外界環(huán)境的應急反應，故稱SOS修復，也稱差錯傾向修復。SOS反應廣泛存在于原核生物和真核生物。細胞能存活，但變異率高，DNA保留錯誤較多，會引起廣泛、長期的突變。自然界也因此而變得生物種類繁多。

信號轉導通路★★★

29.受體：是細胞膜上或細胞內可以特異地識別與結合化學信號物質（配體）并

能激發(fā)靶細胞產生特異生物效應的特殊蛋白質分子。

G蛋白：廣義的G蛋白是指所有能與GTP或GDP結合的蛋白質。細胞信號轉導中扮演重要角色的G蛋白主要有兩類：異三聚體G蛋白（與膜受體偶聯(lián)，位于細胞膜內側，由三個亞基組成，一般稱為經典G蛋白或大G蛋白。）、單體G蛋白（存在于不同的細胞部位的小分子量G蛋白，也稱為“小G蛋白”，是單亞基蛋白。Ras是第一個被發(fā)現(xiàn)的小G蛋白。）

SH2結構