血小板抗原及其抗體檢測

尹國才珠海保亞美投資有限公司技術部TE84605763Gene-ProbeGTIDiagnostics內容一、珠海保亞美投資有限公司業務簡介二、血小板抗原三、血小板抗原抗體分析四、GTI血小板檢測產品的用途一、珠海保亞美投資有限公司簡介主要專業產品血液中心、輸血科、血庫及檢驗科等輸血實驗室設備與試劑。中國總代理

GTIDiagnostics：Gene-ProbeGTIDiaMed（達亞美）：Bio-Rad（伯樂）GTIProductsBloodBankProducts:

Mace1Mace2PakPlusPakAutoPak12Pak12GPak2LEPak1GranTypeThromboType

CoagulationProducts:PF4EnhancedFVIIIAntibodyScreen

TransplantationProducts:QuikScreenB-ScreenQuik-IDClassIQuik-IDClassIIMicroAMS(供者HLA與受者血清相配)HLAEZTypeHLATypingTraysComplementTitrationTraysHLAControlSeraEmptyTypingTrays

Equipment/Software:EZTypeSystemWinQIDLotFilesWholeBloodRedBloodCellswhiteBloodCellsPlatelet-RichPlasma血液制品PlateletsFreshFrozenPlasma血小板？血液中由巨核細胞產生的小細胞碎片。大小1～5um不等,

100~300x109/L。正常人每日消耗數百萬Plt。參與血栓、血塊形成。二、血小板抗原血小板相關抗原:與其他細胞表面或組織共有的抗原

.-白細胞抗原（HLA系統,HLA-I）.-紅細胞抗原（血型系統,ABH、Lewis、I及P）.血小板特異性抗原(HPA):血小板特有的抗原決定簇,在血小板和巨核細胞上表達,屬于雙等位共顯性遺傳,表現血小板獨特的遺傳多態性,HPA多態性分布存在種族差異。-血小板表面膜糖蛋白Glycoprotein(GP).-共鑒定出24個抗原，23個已被正式命名.主要HPA的載體蛋白與功能GPIIb/IIIa：是纖維蛋白原、纖維連接蛋白、玻連蛋白(vitronectin)，vonWillebrandfactor（假性血管性血友病因子,vWF）等分子的受體。GPIb/IX：是vWF受體,參與粘附受損內皮細胞。GPIa/IIa：參與粘附膠原蛋白。GPIV（CD36

）：是I&IV型膠原、氧化型LDL、長鏈脂肪酸、瘧原蟲感染RBC的受體。表達于單核細胞,毛細血管內皮細胞,紅細胞母細胞,脂肪細胞和血小板,IsoantigenNaka–1989。結合ECM，參與血小板粘附。HPA15(CD109):中國人多態性明顯。表達于內皮細胞,激活的T細胞和血小板。參與細胞活化、增殖和信號傳遞。主要的多態性靶HPA：7個系統，HPA-1~6,15HPA4HPA5HPA1HPA2HPA3中國人HPA等位基因頻率Primo?Ro?man,TransplantImmunologyVolume10;2002,Pages165-181EuropeanBioinformaticsInstituteDatabaseCD36(GPIV)抗原Platelets:亞洲人:3-11%北美:2.5%非洲:7.8%高加索人:0.06%I型:AbsentfromPlateletsandMonocytes

–輸血或懷孕存在免疫應答風險II型:AbsentfromPlateletsonlyHPA與相關疾病HPA蛋白多肽表達缺陷致?。骸狦lanzman’sThrombocytopenia（血小板無力癥）：1918年由Glanzmann報道，故本病又稱“Glanzmann病”(GT)，是一種遺傳性出血病，為PlateletGPIIb/IIIa和纖維蛋白原受體缺乏?！狟ernardSouliersyndrome（伯-蘇綜合征，巨血小板綜合征）：血小板GPIb/IX/V缺乏。HPA抗體致病：免疫損傷Plt。－新生兒同種異體免疫性血小板減少癥（NeonatalAlloimmuneThrombocytopenia，NAITP）

－血小板輸注無效（PlateletTransfusionRefractoriness，RTP）－輸血后紫癜（Post-TransfusionPurpura，PTP）－自身免疫性血小板減少癥（AutoimmuneThrombocytopenia，AITP）

－肝素或藥物誘導的血小板減少癥（Heparinor

Drug-InducedThrombocytopenia

HITP或DITP)

－移植排斥●●●●●●血小板抗原同種免疫的反應機制

血小板糖蛋白被自身或同種異基因效應T細胞和B細胞所識別，產生相應的抗體，結合到相應的血小板抗原上。巨噬細胞表面的Fc受體與抗體分子的Fc片段結合后，在脾臟內血小板被巨噬細胞吞噬，引起血小板減少癥。自身免疫的作用靶通常是非多態性的血小板GP和磷脂。同種免疫反應通常是由GPⅡb/Ⅲa，GPⅠb/Ⅸ，GPⅠa-Ⅱa，GPⅣ和HLA-I類分子上的同種異體特異性抗原引起的，在臨床上引發NAITP，PTP，PTR。NAITPEthiologyplateletplateletplatelet血小板輸注無效（PTR）血小板輸注無效是由于患者反復輸注血小板而產生了血小板同種抗體，導致再次輸入血小板時，發生免疫反應。主要是由未除盡白細胞和血小板HLA抗原以及少數HPA抗原引起的免疫應答反應，產生相應的抗體。產生免疫性抗體的病人中,50%-80%為HLA抗體，同時，也有17%-25%的HPA抗體出現，其臨床效應為縮短輸注血小板的壽命。在日本人中HPA-2b是引起血小板輸注無效的主要原因之一。

PTR以預防為主:輸注HPA同型Plt可預防產生HPA抗體；輸注去白Plt可有效預防HLA抗體的產生，杜絕大部分的PTR；對已經發生PTR的患者，可輸注“配合”的濃縮血小板，臨床療效理想。ModelofPathogenesisinHITPVisentinetal,inHeparin-InducedThrombocytopenia;4thed.NewYork:InformaHealthcare,20076b移植排斥在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相關排斥反應的原因之一。盡管供者與病人的HLA完全相配，仍有近25%的骨髓移植會發生移植物與宿主之間的排斥反應。這些現象是由次要組織相容性抗原（mHA）不合引起的。HPA分布可能比預想的要廣泛，故推測，在移植中，HPA抗原起次要組織相容性抗原的作用。Balduini等在70例臨床HLA相配兒童的骨髓移植中，研究了HPA-1，-2，-3和-5的相容性。結果提示：當受者接受HLA相配的供者骨髓時，HPA-3可作為mHA起作用。Kekomaki等對比研究了166對腎臟移植-受體的HPA-1，-2，-3，-5的相容性，結果表明：當HPA-5a/5a病人接受HPA-5b陽性供者的腎時，HPA-5b作為mHA在急性血管排斥反應中起作用。1、HPA和HLA抗原基因分型技術限制性片段長度多態性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）序列特異性寡核苷酸探針技術（SequenceSpecificOligonucleotide,SSO）序列特異引物PCR技術（PCRSequenceSpecificPrimer,PCR-SSP）GTI基因分型試劑盒THROMBOTYPE?aprimersNegativeControlMasterMix(1+tubes)1a2a3a4a6a15a5aempty1a2a3a4a6a15a5aemptybprimersMasterMix(for14+PCRs)

2XPCRReagentTaqpolymeraseSampleDNAWater(tovolume)1b2b3b4b5b6b15bemptyDistributetoPrimer-loadedPCRTubes1b2b3b4b5bPlateletAntigenGenotyping:PCR-SSPHPA-5b/b(Bra/a)HPA-5a/b(Bra/b)HPA-5a/a(Brb/b)產品檢測項目（每盒檢測標本數）THROMBOTYPE血小板7種等位基因型檢測(8)MACE?1HLA-I和GPIIb/IIIa交叉配型(45)MACE?2GPIa/IIa,Ib/IX,IV交叉配型(30)PAK?12PAK?12G檢測GPIIb/IIIa,Ia/IIa，Ib/IX和HLA-I的抗體(IgG,IgA,IgM)或單獨IgG型抗體(5)

PAK?2-LEGPIIb/IIIa,Ia/IIa，Ib/IX和HLA-I的IgG型抗體(8)PAK?1檢測GPIIb/IIIa上的特異表位抗體(8)PAKPLUS?鑒定GPIIb/IIIa,Ia/IIa的特異表位抗體，篩選血小板Ib/IX,IV,HLA-I抗體(8)PF4Enhanced?檢測PF4/肝素復合物的抗體(8)GTIDiagnosticsPLT檢測試劑盒PLT抗體檢測試劑盒MACEI&MACEII：－交叉配型－規格：MACE?1：45個測試/盒；MACE?2：30個測試/盒。

－ELISA方法檢測IgG抗體:MACE?1:GPIIb/IIIaandHLA-I。MACE?2:GPIa/IIa、Ib/IX、IV。MACE?實驗操作與原理1

洗滌PLT,制備50%PLT懸液.2PLT與患者血清或血漿在管內發生反應,若有相應抗體,則結合到PLT上形成復合分子.3

洗滌去掉其中未結合的Ig.4

裂解PLT,游離出抗原-抗體復合分子.5

加裂解液到相應的微孔內,孔壁上包被的抗體可結合(抓獲)其中的抗原或抗原-抗體復合分子.6

洗滌,去掉未結合的Ig.7

加酶標二抗(anti-Ig),結合到抗原-抗體復合分子上,形成一條反應鏈;病人血液中無相應的抗體,則反應鏈不成立.8

洗滌去掉未結合的二抗.9

加底物顯色.10

終止反應,測OD值,判斷結果.ELISAforPlateletAntibodyDetectionPAK?PLUS－鑒定針對特異表位的抗體：5份樣品/盒。

－ELISA方法檢測針對特異表位的抗體(IgG,A,M):PAK?2-LE

－篩查針對常見HPA抗原蛋白的抗體：11份樣品/盒。

－ELISA方法檢測針對特異表位的IgG抗體:GPIIb/IIIaGPIa/IIaGPIb/IXHLA-I固相紅細胞粘附實驗（SPRCA）AHG致敏紅細胞作為指示細胞CommercialAssay(CaptureP);Rapidtest。敏感性和特異性低。使用完整血小板作為抗原，不能分辨抗體類別主觀性比較強，通過紅細胞的凝集作為判斷標準。試劑有效期短。Capture-P?YYYYYYYYYYYYCapture-P?Aspecificplateletbindingagentiscovalentlyboundto

thewellsbythemanufacturer.孔內包被有血小板特異性結合試劑YYYYYYYYYYYYCapture-P?Paternalplatelets,

donorplatelets,orthe

patient'splateletsare

addedtothewells.孔內加入父母、供者或病人的PLTYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P?Thepatient'sserumorantibodyofknownspecificityisaddedto

thewells.孔內加入病人血清或已知的特異性抗體YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P?YYYYIndicatorcellsconsistingofredcellswithattachedrabbitanti-humanare

added.添加結合有兔抗人IgG的指示RBCYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P?

Inthepresenceof

anti-plateletantibodies,theredcellscoatthewellandahazypatternisseen.陽性反應結果YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYCapture-P?Intheabsenceof

anti-platelet

antibodies,thered

cellsformabuttononthebottomofthewell.陰性反應結果FCA、LuminexandIFA包被珠或Plt與血清孵育洗滌標記抗體與致敏珠子或Plt孵育洗滌熒光鏡檢或流式檢測收集數據Luminex100分析數據靶抗原包被珠或血小板HumanAntibodyFromSeraAnti-HumanIgGConjugate(PE)多態性血小板靶抗原藕聯珠Luminex100/200法IaIIaConjugatedBeadsHPA5a(Brb)HPA5b(Bra)IIbIIIaConjugatedBeadsHPA1a(PlA1)/3a(Baka)HPA1b(PlA2)/3a(Baka)HPA1a(PlA1)/3b(Bakb)IbIXConjugatedBeadsHPA2a(Kob)HPA2b(Koa)OtherConjugatedBeadControlBeadsNegative(Albumin)Positive(IgG)ClassIGPIVCD109檢測Plt抗體的上市品種GTI:?PAK-PlusTM,PAK-AutoTM,PAK-LX,MACE-1TM,MACE-2TM,

PF4-Enhanced?IMMUCOR:?Capture-PTM,Capture-PReadyScreenTMSTAGO:?HITTMDiaMed:?ID-HAT?HPA-1aTypingBiotest:?Thrombomatch?HPA-1aTyping3、

HLA同種異體抗體不同HLA分子誘導抗體反應的能力不同同種異體免疫的發生和持續不可預測單一HLA分子誘導的抗體能與多種HLA反應(CREGs)有輸血史、做過移植和懷過孕的人群，抗HLA-I的陽性率超過1/3.HLA抗體檢測與鑒定方法補體依賴直接CDCAHG放大的CDC敏感性不理想僅能檢測補體結合抗體固相ELISA（GTI）FlowPRAandspecificitybeadsLuminexliquidarrays敏感能檢測補體結合和非結合抗體HLA抗篩方法SensitivityThroughputAutomation