基于DNA測(cè)序的微生物鑒定技術(shù)介紹技術(shù)支持黃志zhi.huang@The

worldleader

inserving

science賽默飛世爾：服務(wù)于科學(xué)的全球頂尖企業(yè)公司規(guī)模?6.5萬(wàn)名員工，50個(gè)國(guó)家?

年銷售收入200億美元涉及的領(lǐng)域?

科學(xué)研究領(lǐng)域?

專業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域旗下主要品牌?

實(shí)驗(yàn)室全方位供應(yīng)商2ThermoFisher

微生物整體解決方案樣品采集鑒定/分型樣品制備增菌檢測(cè)確認(rèn)藥敏3ThermoFisher

提供最全面的核酸檢測(cè)解決方案基因芯片4基因芯片基因測(cè)序的技術(shù)進(jìn)化5微生物鑒定/分型發(fā)展的三個(gè)階段第一階段：表型?

培養(yǎng)、格蘭氏染色、生理生化反應(yīng)、形態(tài)學(xué)、脂肪酸、核蛋白第二階段：核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性

(進(jìn)入分子生物學(xué)技術(shù)時(shí)代）?

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)?

隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)?

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)?

細(xì)菌核糖體基因分型(Ribotyping)?

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)?

重復(fù)序列擴(kuò)增(rep-PCR)第三階段：基因序列分析（基于測(cè)序技術(shù)，確定目標(biāo)基因每個(gè)堿基的組成序列）?

靶向測(cè)序：16SRNA測(cè)序?

全基因組測(cè)序6MicroSEQ?

ID

微生物鑒定系統(tǒng)技術(shù)基礎(chǔ)：基于16S核糖體RNA的基因測(cè)序的鑒定方法?

細(xì)菌命名學(xué)的新標(biāo)準(zhǔn)?

依據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，采用16SrDNA序列分型?

提供更高的分類學(xué)信息?

快速準(zhǔn)確提供鑒定結(jié)果?

客觀性，重現(xiàn)性好?

方便不同團(tuán)體、實(shí)驗(yàn)室間信息共享和交流DNA序列測(cè)定成為微生物鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)8基于16S核糖體基因測(cè)序的鑒定方法——《中國(guó)藥典2015》推薦9核糖體RNA的結(jié)構(gòu)RNA

(核糖體RNA)細(xì)菌:DNA

(染色質(zhì)/體)

真菌:16SrDNA

(E.

coli:

1541

bp)LSUrDNA10MicroSEQ

ID細(xì)菌鑒定16SrRNA

Gene5001541MicroSEQ?

500System

作為日常檢測(cè)作為補(bǔ)充檢測(cè)MicroSEQ?

FullGene

System11MicroSEQ

ID真菌鑒定●

用于酵母和真菌鑒定●

26S大亞基D2區(qū)(LSUD2)of

rRNA

Gene●

序列長(zhǎng)度300-500bp

用于真菌鑒定12MicroSEQ

ID

系統(tǒng)構(gòu)成Applied

Biosystems?3500

and

3500XLDNA

sequencing

instruments?

FAST

Bacterial

500

16SID

Kit?

FAST

Fungal

D2

ID

Kit?

FullGene

16SID

kit?

MicroSEQID

Software?

Validated

Bacterial

andFungal

librariesPCRThermalCycler13MicroSEQ

ID

微生物快速鑒定系統(tǒng)操作流程5小時(shí)完成鑒定14鑒定軟件:自動(dòng)獲得準(zhǔn)確的種級(jí)別微生物鑒定結(jié)果15經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫(kù)?

經(jīng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)?

16S

500:

2100

entries?

16S

全基因:

1262

entries?

D2(真菌):

1300

entries?

16S

增補(bǔ)數(shù)據(jù)庫(kù):

7000entries?

不定期更新?

新增加的菌?

最新的命名原則?

包括諸多環(huán)境分離菌的信息最大，最全面且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫(kù)16MicroSEQ

ID鑒定技術(shù)的特點(diǎn)?

可以鑒定細(xì)菌和真菌?

不需要事前掌握待檢微生物的信息?

無(wú)需革蘭氏染色?

無(wú)需鑒定經(jīng)驗(yàn)，判斷客觀?

準(zhǔn)確?

穩(wěn)定?

簡(jiǎn)單將不能或難以鑒定的微生物種類從20％

下降到2％！17MicroSEQ?

微生物鑒定系統(tǒng)全球頂級(jí)制藥企業(yè)的共同選擇！?

全球前10強(qiáng):全部采用?

全球前25強(qiáng):

23家采用?

全球前25強(qiáng):

20家在不同子工廠中同步使用*Listof

Top

50

Pharma

fromPharmaceutical

Executive,May2017一專多能的儀器平臺(tái)毛細(xì)管電泳儀器平臺(tái)MicroSEQ?ID序列測(cè)定AFLP/MLVA片段分析菌種鑒定溯源分型19菌株分型的分子平臺(tái)?

測(cè)序檢測(cè)?

MLST?

片段分析?

AFLP?

MLVA20Ion半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)原理123dNTPH+?QAdddNTPsthat

buildthe

DNA

sequenceIons

get

released

whenDNA

bases

are

matchedSequence

output

isgeneratedby

the

detection

system

芯片上存在上百萬(wàn)個(gè)微小測(cè)序孔

每個(gè)測(cè)序孔中含有一個(gè)微珠，微珠上聯(lián)接了待測(cè)序的模板DNA片段

測(cè)序開始時(shí)，依次摻入堿基，隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子并檢測(cè)21賽默飛最新型高通量測(cè)序平臺(tái)：Ion

GeneStudio

S5

系列Ion

GeneStudio?

S5Ion

GeneStudio?

S5PlusIon

GeneStudio?

S5PrimeNewNewFast.Flexible.Powerful.NewIon510?

Chip2–3

M

readsUp

to

400

bpIon520?

Chip3–6

M

readsUp

to

600

bpIon530?

Chip15–20

M

readsUp

to

600

bpIon540?

Chip

Ion550?

Chip60–80

M

reads

100–130M

readsUp

to

200

bpUp

to

200

bp22更長(zhǎng)讀長(zhǎng)：600bpIsothermalAmplificationIon

Chef

SystemIon

520

Chip3.1MReadsIon

530

Chip15.0MReadsThecontent

providedhereinmay

relate

to

products

that

havenot

been

officiallyreleasedandissubject

to

change

without

notice23完整而快速的高通量測(cè)序方案讓未知微生物無(wú)處遁形Ampliconclean-upandlibraryReversetranscriptionandPCRRNAextractionPreparetemplateRunsequenceAnalyzedataconstruction1hour4hours3hours5–11

hours2.5hours5hoursMagMAX?-96Viral

RNAIsolationKitPathAmpFluReagentsIon

Xpress?

PlusFragmentIon

ChefSystemorIon

OneTouch?2SystemIon

S5SystemorIon

PGMSystemTorrentSuite?Software,PathogenDetector

pluginLibrary

Kit48小時(shí)內(nèi)完成從樣本到微生物全基因組測(cè)序的工作24宏基因組復(fù)雜的樣本，混合的微生物，包括食品、嘔吐物、糞便、土壤等25Ion

16S

Metagenomics

Kit:

Primer

SetsPrimer

Sets?

Set

V2-4-8?

Set

V3-6,7-916SgeneV1V5V7V8V9V2V3V4V620080010001400

154214006001200.

Stringent

Bioinformatic

Assay

Design:

Analyses

against

the

entire

GreenGenes

database

as

wellas

the

26Kspecies

of

primary

metagenomic

interest..

BroadCoverage

Primer

Sets:

Addresses

multiple

groups

of

organisms

using

amulti-ampliconapproach

(amplicon

sizes

200-300bp

range).

Maximum

Read

Length:Uses400bp

sequencing

chemistry26兩種測(cè)序方案互為補(bǔ)充Ion16S

Metagenomics

KitonIon

S5/S5XL

SystemsApplied

Biosy