第七章表達序列分析生物信息學第七章表達序列分析生物信息學1表達序列標簽(ExpressedSequenceTag,EST)是由大規模隨機挑取的cDNA克隆測序得到的組織或細胞基因組的表達序列標簽表達序列標簽（EST）表達序列標簽(ExpressedSeque2EST的概念EST是指通過對cDNA文庫隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為60～500bp.EST是基因的“窗口”，可代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因，故被稱之為“表達序列標記”EST的概念EST是指通過對cDNA文庫隨機挑取的克隆進3

EST技術的形成和發展

上世紀80年代，對cDNA序列進行大規模測序的想法就曾提出，但反對者認為cDNA序列缺少重要的基因調控區域的信息。

EST技術應用的首次報道是Adams(1991)等從三種人腦組織cDNA文庫隨機挑取609個克隆進行測序,得到一組人腦組織的EST，分析結果表明其中36個代表已知基因，337個代表未知基因。運用自動化測序技術,大規模生產EST序列。EST技術的形成和發展4/projects/dbEST//pr5表達序列分析課件6體內：翻譯體外研究：反轉錄連接，轉化文庫構建技術已經成熟測序成本已經大大降低大數據量分析理念已經形成EST技術流程體內：翻譯體外研究：反轉錄連接，轉化文庫構建技術已經成熟測序7◆

非標準化的cDNA文庫的構建。

可用于基因表達量的分析◆

經標準化或扣除雜交處理的cDNA文庫。

富集表達豐度較低的基因

A.cDNA文庫構建◆非標準化的cDNA文庫的構建。A.cDNA文庫構建8cDNA文庫的構建cDNA文庫的構建9隨機挑取克隆進行5’或3’端測序序列前處理聚類和拼接基因注釋及功能分類后續分析B.序列測定及數據分析隨機挑取克隆進行5’或3’端測序序列前處理聚類和拼接基因注釋10測序方向的原則①EST編碼蛋白質的信息應滿足同源序列比較分析②決定于用EST來進行研究的目的測序方向的原則11測序方向的選擇◆5’端5’上游非翻譯區較短且含有較多的調控信息。一般在尋找新基因或研究基因差異表達時用5’端EST較好，而且從5’端測序有利于將EST拼接成較長的基因序列。◆3’端3’端mRNA有一20－200bp的polyA結構，同時靠近ployA又有特異性的非編碼區，所以從3’端測得EST含有編碼的信息較少，但研究非編碼區有品種的特異性，可以作為STS標記．◆兩端測序獲得更全面的信息。測序方向的選擇12(1)去除低質量的序列(2)應用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽數據組中不屬于表達的基因的贗象序列(artifactualsequences)。●載體序列(/repository/vector)

●重復序列(RepBase，)●污染序列(如核糖體RNA、細菌或其它物種的基因組DNA等)(3)去除其中的鑲嵌克隆：Back-to-backpoly(A)+tails;Linker-to-linkerinmiddleofthesequence.(4)最后去除長度小于100bp的序列。序列前處理(1)去除低質量的序列序列前處理13聚類的目的就是將來自同一個基因或同一個轉錄本的具有重疊部分(overlapping)的ESTs整合至單一的簇(cluster)中。聚類作用：產生較長的一致性序列(consensussequence)，用于注釋。降低數據的冗余，糾正錯誤數據。可以用于檢測選擇性剪切。ESTs聚類的數據庫主要有三個：UniGene(/UniGene)TIGRGeneIndices(/tdb/tgi/)STACK(http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html)

ESTs的聚類和拼接聚類的目的就是將來自同一個基因或同一個轉錄本的具14◆looseclustering●產生的一致性序列比較長●表達基因ESTs數據的覆蓋率高●含有同一基因不同的轉錄形式，如各種選擇性剪接體●每一類中可能包含旁系同源基因的轉錄本●序列的保真度低◆stringentclustering●產生的一致性序列比較短●表達基因ESTs數據的覆蓋率低●因此所含有的同一基因的不同轉錄形式少●序列保真度高不嚴格的和嚴格的聚類不嚴格的和嚴格的聚類15利用cDNA克隆的信息和5’、3’端的序列信息，不同的Cluster可以連接在一起。Cluster的拼接利用cDNA克隆的信息和5’、3’端的序列信息，不同的Clu16常用的拼接軟件◆Phrap(/phredphrapconsed.html)◆CAP3(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)◆d2_cluster(http://www.sanbi.ac.za/)常用的拼接軟件◆Phrap(http://w17(1)注釋：◆序列聯配

Blastn:searchnucleotidedatabasesusinganucleotidequery.

Blastx:searchproteindatabasesusingatranslatednucleotidequery.◆蛋白質功能域搜索(二結構比對)

Pfam:

ThePfamdatabaseisalargecollectionofproteinfamilies,eachrepresentedbymultiplesequencealignmentsandhiddenMarkovmodels.

Interpro:

InterProisanintegrateddatabaseofpredictiveprotein"signatures"usedfortheclassificationandautomaticannotationofproteinsandgenomes.基因注釋及功能分類(1)注釋：基因注釋及功能分類18(2)基因功能分類：◆手工分類

大部分以Adams1995年的文章中的采用分類體系為標準。【Adams.MD,etal.Initialassessmentofhumangenediversityandexpressionpatternsbasedupon83millionnucleotidesofcDNAsequence.Nature.1995377(6547Suppl):3-174】◆計算機批量處理利用標準基因詞匯體系GeneOntology，進行近似的分類。(/)基因注釋及功能分類(2)基因功能分類：基因注釋及功能分類19生物過程分子功能細胞組件基因本體（GeneOntology，GO）

生物過程基因本體20/GO.downloads.annotations.shtml

/GO21◆比較基因組學分析◆基因表達譜分析◆新基因研究◆基因可變剪切分析◆實驗驗證

?MicroArray

?GeneChip

?RT-PCR

?Northernblotting后續分析◆比較基因組學分析后續分析22

表達序列標簽（EST）數據的應用表達序列標簽（EST）23利用對某一特異組織或某一生長發育階段的cDNA文庫,進行隨機部分測序所得的ESTs,作為查詢項在dbEST中進行同源查找,同時將由ESTs序列按密碼子推出的氨基酸序列作為查詢項在蛋白質信息資源數據庫中進行同源查找。如果該ESTs序列在以上數據庫中存在同源序列,可對該ESTs所代表基因的功能進行分析及鑒定。如果不存在同源序列,則該ESTs所代表的基因有可能是新基因。1.ESTs與新基因識別1.ESTs與新基因識別24表達序列分析課件25表達序列分析課件26轉錄圖譜為染色體DNA某一區段內，所有可轉錄序列的分布圖，ESTs作為轉錄基因的產物，可直接用于構建轉錄圖譜。由于ESTs具有很高的多態性可用作分子標記，用于建立遺傳連鎖圖譜。建染色體物理圖譜需要大量的單拷貝序列標記位點(STS)作為界標，由于大多數基因是單拷貝的，因此ESTs可以充當STS構建物理圖譜。2.ESTs與遺傳學圖譜的構建2.ESTs與遺傳學圖譜的構建27序列標簽位點(sequence-taggedsites,STS)：已知核苷酸序列的DNA片段，是基因組中任何單拷貝的短DNA序列，長度在100～500bp之間來自mRNA的3’非翻譯區的ESTs更適合做為STSs，用于基因圖譜的繪制。優點：●由于沒有內含子的存在，因此在cDNA及基因組模板中其PCR產物的大小相同。●與編碼區具有很強的保守性不同，3’UTRs序列的保守性較差，因此很容易將單個基因與編碼序列關系非常緊密的相似基因家族成員分開。2.ESTs與遺傳學圖譜的構建序列標簽位點(sequence-taggedsites,28由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立時所采樣品特定發育時期和生理狀態下的一個基因的部分序列。大于90％的已經注釋的基因都能在EST庫中檢測到。ESTs可以做為其它基因預測算法的補充。3.ESTs與基因預測由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立29通過對ESTs重疊群組裝，對大量重復的ESTs進行序列比較，可以從ESTs數據庫中篩選另一種以測序為核心的分子標記SNPs。來自不同個體的ESTs可用于發現基因組中轉錄區域存在的SNPs。注意區別真正的SNPs和由于測序錯誤而引起的本身不存在的SNPs。解決這一問題可以通過：●提高ESTs分析的準確性。●對所發現的SNPs進行實驗驗證。4.ESTs與單核苷酸多態性(SNPs)通過對ESTs重疊群組裝，對大量重復的ESTs進行序列比較30

某一時期基因表達的數量通常占全部基因的15%,細胞的分化由基因特異性的時空表達決定。利用未經標準化和差減雜交的cDNA文庫EST可以分析特定組織的基因表達譜。近年來對基因差異表達研究的方法有ESTs法、差減雜交法和mRNA差異顯示技術。其中以ESTs法穩定性最高,分析規模最大。5.ESTs與基因的差異表達某一時期基因表達的數量通常占全部基因的15%,細胞的分化由31癌癥基因組解析計劃(CancerGenomeAnatomyProject,CGAP)為研究癌癥的分子機理，美國國家癌癥研究所NCI的CGAP計劃，構建了很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的cDNA文庫，并進行了大規模的EST測序。CGAP網站提供了多種工具用以分析不同文庫間基因表達的差異，如：●DigitalGeneExpressionDisplayer(DGED)●cDNAxProfiler5.ESTs與基因的差異表達癌癥基因組解析計劃5.ESTs與基因的差異表達32DNA芯片是指將許多許多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段(包括cDNA)固定在芯片的每個預先設置的區域內,將待測樣本標記后同芯片進行雜交,通過雜交信息的分析來檢測基因的功能和基因組研究的分析系統。ESTs是用于制備DNA芯片的很好基因資源。由于ESTs直接來源于cDNA,因此ESTs文庫可代表cDNA文庫用于制備DNA芯片所需的探針庫。6.ESTs與DNA芯片的制備綠色:基因表達↓紅色:基因表達↑

黃色:基因表達相當DNA芯片是指將許多許多特定的DNA寡核苷酸或DNA片33基因芯片或微陣列技術流程….….Clone反轉錄（可選）讀取光密度聚類分析（非同源功能注釋）標記雜交反轉錄EST分析………….………….………….GeneChip0.10.060.050.04…000.070.01…表達量矩陣G1,G3,G5G2,G4G6,G9…利用EST，SAGE分析結果制作芯片（研究已發現的基因）連接，轉化原位合成

基因芯片或微陣列技術流程….Clone反轉錄（可選）讀取光密34基因表達系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)技術,能同時對上千個轉錄物進行研究，是一種用于定量及高通量基因表達分析的實驗方法。7.ESTs與基因表達系列分析基因表達系列分析(SerialAnalysisofGe35SAGE的原理：（1）一個9-14堿基的短核苷酸序列標簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認一種轉錄物。一個9堿基順序能夠分辨262,144個不同的轉錄物,而人類基因組估計僅能編碼80,000種轉錄物，所以理論上每一個9堿基標簽能夠代表一種轉錄物的特征序列。（2）將短片段標簽相互連接形成長的DNA分子，對該克隆進行測序得到大量連續的單個標簽，可對數以千計的mRNA轉錄本進行分析。（3）特定的序列標簽的出現次數就反應了對應的基因的表達豐度。7.ESTs與基因表達系列分析SAGE的原理：7.ESTs與基因表達系列分析36反轉錄酶切連接測序單條測序＝對30－40條EST測序分析由于采樣量大大提高，可對低表達基因進行分析：基因表達量分析、尋找新基因等等實驗步驟較長要求較高SAGE技術流程反轉錄酶切連接測序單條測序＝對30－40條EST測序分析由于378.電子克隆利用計算機技術，依托現有的網絡資源EST數據庫、核苷酸數據庫、蛋白質數據庫、基因組數據庫等，采用生物信息學方法(包括同源性檢索、聚類、序列拼裝等)延伸EST序列，以期獲得部分乃至全長cDNA序列的一種方法。8.電子克隆利用計算機技術，依托現有的網絡資源EST數據庫、385’3’estSearchinestdatabaseSearchinestdatabaseSearchinestdatabaseSearchinestdatabase5’3’CompletecDNA簡單電子克隆模式圖

5’3’estSearchinestdatabaseS39ESTs很短，沒有給出完整的表達序列。

低豐度表達基因不易獲得。由于只是一輪測序結果，出錯率達2%-5%。

有時有載體序列和核外mRNA來源的cDNA污染或是基因組DNA的污染。

有時出現鑲嵌克隆。序列的冗余，導致所需要處理的數據量很大。ESTs數據的不足ESTs很短，沒有給出完整的表達序列。ESTs數據的不足40謝謝謝謝41單核苷酸多態性（SNP）(singlenucleotidepolymorphism)在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性單核苷酸多態性（SNP）42第七章表達序列分析生物信息學第七章表達序列分析生物信息學43表達序列標簽(ExpressedSequenceTag,EST)是由大規模隨機挑取的cDNA克隆測序得到的組織或細胞基因組的表達序列標簽表達序列標簽（EST）表達序列標簽(ExpressedSeque44EST的概念EST是指通過對cDNA文庫隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為60～500bp.EST是基因的“窗口”，可代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因，故被稱之為“表達序列標記”EST的概念EST是指通過對cDNA文庫隨機挑取的克隆進45

EST技術的形成和發展

上世紀80年代，對cDNA序列進行大規模測序的想法就曾提出，但反對者認為cDNA序列缺少重要的基因調控區域的信息。

EST技術應用的首次報道是Adams(1991)等從三種人腦組織cDNA文庫隨機挑取609個克隆進行測序,得到一組人腦組織的EST，分析結果表明其中36個代表已知基因，337個代表未知基因。運用自動化測序技術,大規模生產EST序列。EST技術的形成和發展46/projects/dbEST//pr47表達序列分析課件48體內：翻譯體外研究：反轉錄連接，轉化文庫構建技術已經成熟測序成本已經大大降低大數據量分析理念已經形成EST技術流程體內：翻譯體外研究：反轉錄連接，轉化文庫構建技術已經成熟測序49◆

非標準化的cDNA文庫的構建。

可用于基因表達量的分析◆

經標準化或扣除雜交處理的cDNA文庫。

富集表達豐度較低的基因

A.cDNA文庫構建◆非標準化的cDNA文庫的構建。A.cDNA文庫構建50cDNA文庫的構建cDNA文庫的構建51隨機挑取克隆進行5’或3’端測序序列前處理聚類和拼接基因注釋及功能分類后續分析B.序列測定及數據分析隨機挑取克隆進行5’或3’端測序序列前處理聚類和拼接基因注釋52測序方向的原則①EST編碼蛋白質的信息應滿足同源序列比較分析②決定于用EST來進行研究的目的測序方向的原則53測序方向的選擇◆5’端5’上游非翻譯區較短且含有較多的調控信息。一般在尋找新基因或研究基因差異表達時用5’端EST較好，而且從5’端測序有利于將EST拼接成較長的基因序列。◆3’端3’端mRNA有一20－200bp的polyA結構，同時靠近ployA又有特異性的非編碼區，所以從3’端測得EST含有編碼的信息較少，但研究非編碼區有品種的特異性，可以作為STS標記．◆兩端測序獲得更全面的信息。測序方向的選擇54(1)去除低質量的序列(2)應用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽數據組中不屬于表達的基因的贗象序列(artifactualsequences)。●載體序列(/repository/vector)

●重復序列(RepBase，)●污染序列(如核糖體RNA、細菌或其它物種的基因組DNA等)(3)去除其中的鑲嵌克隆：Back-to-backpoly(A)+tails;Linker-to-linkerinmiddleofthesequence.(4)最后去除長度小于100bp的序列。序列前處理(1)去除低質量的序列序列前處理55聚類的目的就是將來自同一個基因或同一個轉錄本的具有重疊部分(overlapping)的ESTs整合至單一的簇(cluster)中。聚類作用：產生較長的一致性序列(consensussequence)，用于注釋。降低數據的冗余，糾正錯誤數據。可以用于檢測選擇性剪切。ESTs聚類的數據庫主要有三個：UniGene(/UniGene)TIGRGeneIndices(/tdb/tgi/)STACK(http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html)

ESTs的聚類和拼接聚類的目的就是將來自同一個基因或同一個轉錄本的具56◆looseclustering●產生的一致性序列比較長●表達基因ESTs數據的覆蓋率高●含有同一基因不同的轉錄形式，如各種選擇性剪接體●每一類中可能包含旁系同源基因的轉錄本●序列的保真度低◆stringentclustering●產生的一致性序列比較短●表達基因ESTs數據的覆蓋率低●因此所含有的同一基因的不同轉錄形式少●序列保真度高不嚴格的和嚴格的聚類不嚴格的和嚴格的聚類57利用cDNA克隆的信息和5’、3’端的序列信息，不同的Cluster可以連接在一起。Cluster的拼接利用cDNA克隆的信息和5’、3’端的序列信息，不同的Clu58常用的拼接軟件◆Phrap(/phredphrapconsed.html)◆CAP3(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)◆d2_cluster(http://www.sanbi.ac.za/)常用的拼接軟件◆Phrap(http://w59(1)注釋：◆序列聯配

Blastn:searchnucleotidedatabasesusinganucleotidequery.

Blastx:searchproteindatabasesusingatranslatednucleotidequery.◆蛋白質功能域搜索(二結構比對)

Pfam:

ThePfamdatabaseisalargecollectionofproteinfamilies,eachrepresentedbymultiplesequencealignmentsandhiddenMarkovmodels.

Interpro:

InterProisanintegrateddatabaseofpredictiveprotein"signatures"usedfortheclassificationandautomaticannotationofproteinsandgenomes.基因注釋及功能分類(1)注釋：基因注釋及功能分類60(2)基因功能分類：◆手工分類

大部分以Adams1995年的文章中的采用分類體系為標準。【Adams.MD,etal.Initialassessmentofhumangenediversityandexpressionpatternsbasedupon83millionnucleotidesofcDNAsequence.Nature.1995377(6547Suppl):3-174】◆計算機批量處理利用標準基因詞匯體系GeneOntology，進行近似的分類。(/)基因注釋及功能分類(2)基因功能分類：基因注釋及功能分類61生物過程分子功能細胞組件基因本體（GeneOntology，GO）

生物過程基因本體62/GO.downloads.annotations.shtml

/GO63◆比較基因組學分析◆基因表達譜分析◆新基因研究◆基因可變剪切分析◆實驗驗證

?MicroArray

?GeneChip

?RT-PCR

?Northernblotting后續分析◆比較基因組學分析后續分析64

表達序列標簽（EST）數據的應用表達序列標簽（EST）65利用對某一特異組織或某一生長發育階段的cDNA文庫,進行隨機部分測序所得的ESTs,作為查詢項在dbEST中進行同源查找,同時將由ESTs序列按密碼子推出的氨基酸序列作為查詢項在蛋白質信息資源數據庫中進行同源查找。如果該ESTs序列在以上數據庫中存在同源序列,可對該ESTs所代表基因的功能進行分析及鑒定。如果不存在同源序列,則該ESTs所代表的基因有可能是新基因。1.ESTs與新基因識別1.ESTs與新基因識別66表達序列分析課件67表達序列分析課件68轉錄圖譜為染色體DNA某一區段內，所有可轉錄序列的分布圖，ESTs作為轉錄基因的產物，可直接用于構建轉錄圖譜。由于ESTs具有很高的多態性可用作分子標記，用于建立遺傳連鎖圖譜。建染色體物理圖譜需要大量的單拷貝序列標記位點(STS)作為界標，由于大多數基因是單拷貝的，因此ESTs可以充當STS構建物理圖譜。2.ESTs與遺傳學圖譜的構建2.ESTs與遺傳學圖譜的構建69序列標簽位點(sequence-taggedsites,STS)：已知核苷酸序列的DNA片段，是基因組中任何單拷貝的短DNA序列，長度在100～500bp之間來自mRNA的3’非翻譯區的ESTs更適合做為STSs，用于基因圖譜的繪制。優點：●由于沒有內含子的存在，因此在cDNA及基因組模板中其PCR產物的大小相同。●與編碼區具有很強的保守性不同，3’UTRs序列的保守性較差，因此很容易將單個基因與編碼序列關系非常緊密的相似基因家族成員分開。2.ESTs與遺傳學圖譜的構建序列標簽位點(sequence-taggedsites,70由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立時所采樣品特定發育時期和生理狀態下的一個基因的部分序列。大于90％的已經注釋的基因都能在EST庫中檢測到。ESTs可以做為其它基因預測算法的補充。3.ESTs與基因預測由于EST來源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫建立71通過對ESTs重疊群組裝，對大量重復的ESTs進行序列比較，可以從ESTs數據庫中篩選另一種以測序為核心的分子標記SNPs。來自不同個體的ESTs可用于發現基因組中轉錄區域存在的SNPs。注意區別真正的SNPs和由于測序錯誤而引起的本身不存在的SNPs。解決這一問題可以通過：●提高ESTs分析的準確性。●對所發現的SNPs進行實驗驗證。4.ESTs與單核苷酸多態性(SNPs)通過對ESTs重疊群組裝，對大量重復的ESTs進行序列比較72

某一時期基因表達的數量通常占全部基因的15%,細胞的分化由基因特異性的時空表達決定。利用未經標準化和差減雜交的cDNA文庫EST可以分析特定組織的基因表達譜。近年來對基因差異表達研究的方法有ESTs法、差減雜交法和mRNA差異顯示技術。其中以ESTs法穩定性最高,分析規模最大。5.ESTs與基因的差異表達某一時期基因表達的數量通常占全部基因的15%,細胞的分化由73癌癥基因組解析計劃(CancerGenomeAnatomyProject,CGAP)為研究癌癥的分子機理，美國國家癌癥研究所NCI的CGAP計劃，構建了很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的cDNA文庫，并進行了大規模的EST測序。CGAP網站提供了多種工具用以分析不同文庫間基因表達的差異，如：●DigitalGeneExpressionDisplayer(DGED)●cDNAxProfiler5.ESTs與基因的差異表達癌癥基因組解析計劃5.ESTs與基因的差異表達74DNA芯片是指將許多許多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段(包括cDNA)固定在芯片的每個預先設置的區域內,將待測樣本標記后同芯片進行雜交,通過雜交信息的分析來檢測基因的功能和基因組研究的分析系統。ESTs是用于制備DNA芯片的很好基因資源。由于ESTs直接來源于cDNA,因此ESTs文庫可代表cDNA文庫用于制備DNA芯片所需的探針庫。6.ESTs與DNA芯片的制備綠色:基因表達↓紅色:基因表達↑

黃色:基因表達相當DNA芯片是指將許多許多特定的DNA寡核苷酸或DNA片75基因芯片或微陣列技術流程….….Clone反轉錄（可選）讀取光密度聚類分析（非同源功能注釋）標記雜交反轉錄EST分析………….………….………….GeneChip0.10.06