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文檔簡介

66使用流式細胞儀檢測活細胞內的ROS基原：CM-H2DCFDA在胞內水解成DCFH,被胞內的氧化劑氧化成高熒光強度DCF，用于檢測ROS的成。Dichlorodihydrofluoresceindiacetate(DCFH-DA)是極性的化學物質能自由通透細胞膜。進入細胞后，被easterase去兩個乙,形具有極性的2’,7-dichlorodihydrofluorescein(DCFH),保在細胞內。當細胞產生與DCFH反應,使DCFH形了’,7’dichlorodihydrofluorescein(DCF)通過流式細胞儀測定細胞內DCF的熒光強度，即可對單個細胞為基礎的細胞內ROS行原位實時檢測，從而根據熒光強度直接反映細胞內自由基的變化程度下圖）主試：1.PC-12細株2.DCFH-DA粉sigma）mg解于721ul100%乙醇中（這時的濃度為10.0之后用DMEM培液釋上述溶液10倍配置成mM的儲存液-20°光保存。3.Aβ25-35（濃為）4.AP終濃度為10uM5其如培養細胞常用試劑DMEM高、胎牛血清、胰酶等MTT操作方法：（）集細胞：取對數生長期細胞收集細胞并調整細胞濃度至110）/mL（）別加入AβA（六孔板養24小（）載探針：加入終濃度為10uM的DCFH-DA37°5%CO培箱中靜置h，2每隔3-5min混一下，使探針和細胞充分作用。（）用無血清的培養基或溫暖的PBS洗滌細胞3次去除未進入細胞內的。

5656（）收各組細胞，上流失細胞儀檢測。激發光，射光525nm（6）實驗分四組：空白對照組)、PC-12+探針照組、PC-12+DA+Aβ25-35實驗組PC-12+DCFH-DA+Aβ25-35+AP（給藥組）結果分析：注意事項：（）理過程絕對避光（紫外燈能不能開？）（）料與細胞混合時間要充分（）針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高（）量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外少種可能的誤差（）胞應保持良好的活性狀態。貼壁細胞培養時不應超過瓶底面積的75%懸浮細胞培養時其數目不能超過/mL貼壁細胞在消化處理時要盡量溫和、快速，避免產生過多的細胞碎片（）用流式細胞儀要確保側面的細胞分散開（在與染料混合和處理時）（）流細胞儀對細胞數目有一定的要求，一般為10，以使用六孔板（）雖一般要求將陰性對照組細胞調節電壓至陰性置信區如正對照

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