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DB45廣西壯族自治區地方標準DB45/T2034—2019甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育技術規程Technicalspecificationforsugarcanevirus-freetissuecultureseedlingfromshoottiprapidpropagation2019-12-052019-12-30廣西壯族自治區市場監督管理局發布DB45/T2034—2019前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由廣西壯族自治區糖業辦公室提出并監督實施。本標準由廣西糖業標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所。本標準主要起草人：劉麗敏、劉紅堅、李松、何為中、劉俊仙、翁夢苓、盧曼曼、何毅波、張偉珍。IIDB45/T2034—2019DB45/T2034—20195實驗室、儀器設備、試劑DB45/T2034—20195實驗室、儀器設備、試劑甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育技術規程1范圍假植苗包裝、銷售與運輸。本標準適用于廣西境內甘蔗莖尖脫毒組培苗的繁育技術。2規范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T22278良好實驗室規范原則GB/T36829甘蔗宿根矮化病菌實時熒光PCR檢測方法NY/T1796甘蔗種苗NY/T1804甘蔗花葉病毒檢測技術規范NY/T1804甘蔗花葉病毒檢測技術規范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1甘蔗莖尖脫毒shootapexvirus-free方法。3.2外植體explant從甘蔗腋芽苗中切取下來進行培養獲得無菌苗的莖尖分生組織稱為外植體。4縮略語MS：MS培養基（Murashige&Skoog(1962)）PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone）ScMV：甘蔗花葉病(Sugarcanemosaicdisease)SrMV：高梁花葉病(Sorghummosaicvirus)RSD：甘蔗宿根矮化病(Ratoonstuntingdisease)15.1實驗室應符合GB19489和GB/T22278規定。5.2儀器設備主要的儀器設備如下:壓力蒸汽滅菌器、恒溫水浴鍋、空調、超凈工作臺、體視顯微鏡（鏡）、接種針、接種刀、長柄槍型鑷子、封口機等。試劑甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育常用化學試劑見附錄A。6培養基的配方及配制6.1配方使用的培養基配方如下：誘導分化培養基：MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.1mg/L＋15mg/L～30mg/L＋3％；b)繼代增殖培養基：MS＋6-BA0.5mg/L～1.5mg/L＋NAA0.05mg/L～0.10mg/L＋3％；c)生根培養基：MS＋NAA5mg/L～10mg/L＋3％～7％。配制配制誘導分化培養基的配置在5.8～6.0，折長寬各4cm的四層濾紙放入培養瓶內，將培養基按每瓶10基不淹沒濾紙為宜。培養基的各個成分按6.1中a)的配方量取后，加水定容，用1mol/LNaOH或HCl將培養基的pH值調節mL的量分裝到培養瓶，以培養6.2.2繼代增殖培養基的配置培養基的各個成分按6.1b)的配方量取后加水定容1mol/LNaOH或HCl將培養基的pH值調節在5.8～6.0，將培養基按25mL/瓶的量分裝至培養瓶。6.2.3生根培養基的配置培養基的各個成分按6.1的配方量取后加水定容，用1mol/LNaOH或HCl將培養基的pH值調節在5.8～6.0，將培養基按30mL/袋的量分裝到規格為10cm×13cm的聚乙烯樹脂塑料袋（培養袋）中，每10袋為一組，每3組裝在一個專門定制的鋁箱內進行高壓滅菌。6.2.4培養基的高壓滅菌力1.05將已分裝好培養基的培養（袋封口并標注好配制日期和培養基種類后溫度121壓kg/cm的滅菌鍋內高壓滅15min～20min。7莖尖培養27.1母體的選擇選擇品種特性特征明顯、健壯、生長旺盛、無病蟲害癥狀的蔗株作為母體材料。7.2溫湯及催芽處理將母體材料砍成單芽莖段放置在干凈流動的清水里浸洗48h后再置于52℃的恒溫水浴鍋中處理30min，撈出瀝干后將莖段排放在托盤朝上排滿整個托盤后倒入干凈的河沙蓋過腋芽為宜，澆透水分，蓋上薄膜，放入恒溫培養室內進行沙培催芽。沙培催芽管理每天觀察沙盤內腋芽生長情況澆水以保持托盤內河沙濕潤但不積水為宜防止甘蔗莖段霉變養室內溫度保持在38℃～40℃，光照2500lx以上，培養時間為10莖尖接種誘導培養外植體材料選擇待腋芽苗長至株高10cm～15cm，選擇生長粗壯的腋芽苗作為誘導叢生芽的外植體材料清洗將腋芽苗連同種莖從沙盤內挖水沖洗干凈削去大只留下與腋芽苗相連分莖皮，去除腋芽苗外部老的葉梢及葉片后倒置在燒杯中待用。消毒剪去腋芽苗上部葉片，再用75％的乙醇將腋芽苗表面滅菌處理，然后倒置在干凈的燒杯中待用。7.4.3莖尖接種在超凈工作臺上剪去腋芽苗中上留2cm～3cm40倍解剖顯微鏡下，用接種針逐層剝去葉梢，直至葉梢剝完，露出莖尖。用解剖刀切取1～2個葉原基，橫切面為1mm～3mm的莖尖分生組織。將莖尖分生組織放在無菌水中20min150mg/L的PVP溶液中1將莖尖接種6.1a）的誘導分化培養基中，每個培養容器接種一個莖尖，莖尖直立放在濾紙上。誘導培養把接種有莖尖的培養瓶，放置于培養室內的光照培養架上做培養。培養過程中應注意避免酚污染對莖尖的傷害，每天搖晃培養瓶，使莖尖在濾紙上的位置改變，每隔7d～10d更換一次誘導培養基，直至莖尖長出具有4～7個芽的叢生芽苗。培養環境要求培養環境要求室內溫度保持在28℃±2℃、光照強度1500lx～23DB45/T2034—2019DB45/T2034—2019DB45/T2034—20198脫毒檢驗獲得的叢生芽苗應進行ScMV、SrMV、RSD病源(毒)檢測檢測方法按NY/T1804、GB/T36829的規定執行，選取檢測結果呈陰性的株系作為脫毒組培苗的基礎苗。9繼代增殖培養在超凈工作臺上長柄槍型鑷子將基礎苗分成若干叢每叢3～5株轉移到6.1中b)的繼代增殖培養基中，每個培養容器放置1～2叢。每隔14d～20d繼代培養1次，繼代增殖代數6～10代。培養環境條件同7.4.5。10生根培養達到預定增殖代數后，將增殖苗6.1c)的生根培養基中進行生根培養，每個生根培養1瓶增殖苗，然后用封口機將培養袋封口,放置在溫室大棚20d～30d，待增殖苗的根長2～3條/株、根系發育健壯時即為生根組培苗，此時可移出培養袋進行假植。11假植11.1苗床的準備假植組培苗的苗床應建假植組培苗的苗床應建在有遮光、防蟲設施的玻璃溫室或塑料薄膜大棚2d～3d，將棚2000倍的噁霉靈進行消毒。洗滌及消毒將成若干叢3～5流動清水盆中反復2～3次瀝去多余水50％多菌靈可濕性800～10008min～10min，置于陰涼處稍微晾干后假植。一級苗圃假植基質的準備將曬干并粉碎過的黃泥土和干凈的河沙1:1合后，用作組培苗假植的基質。11.3.2假植先將配制好的基質裝入規格為6×9孔塑料托盤的盤孔中，再將消毒好的生根組培苗接種入盤每個盤孔種植1叢生根組培苗，然后按每3個托盤排成1排、每20～30排托盤排成1行模式擺放好托盤，澆足定根水。11.3.3蓋膜在擺放托盤處搭建小拱棚,拱棚高80cm,長寬根據托盤行的數棚使用1.0mm的薄膜進行覆蓋，四周用土壓膜密封，膜上蓋遮光率70％的遮陽網。4水肥管理假植7d內，膜內空氣濕度應80％以上，光照強度應2000lx～15000lx。期間應根據天氣情況，通過適當的澆水及揭蓋遮陽網調整膜內的濕度和光照強度。假植7d～14d，應早晚揭膜及遮陽網，進行煉苗。20d，當叢栽苗成活并長出新葉時揭去薄膜和遮陽網，并用0.4％～0.8％濃度的復合肥（15:15:15）的水溶液淋施，每1～2次。二級苗圃假植分單株假植叢栽苗在一級苗圃上30d～50d95％以上的小苗都有獨立根系時，把叢栽苗從苗床拔成單株剪去部分葉片及過長的根，葉3cm～4cm，根3cm～4cm，然后用黃泥漿漿根后，種植到營養杯（托）中。假植后淋足定根水，成活前保濕遮蔭，使土壤70％～75％。成活后去除遮陽網及覆蓋物，用0.4％～0.8％濃度的復合肥（15:15:15）的水溶液淋施，每1～2次。蔗苗封行后及時剪去過長的葉片。田。12假植苗質量要求及檢驗方法按NY/T1796的規定執行。13假植苗包裝、銷售與運輸按NY/T1796的規定執行。5二級苗圃上假植時間30d～35d，待苗30cm,3田。12假植苗質量要求及檢驗方法按NY/T1796的規定執行。13假植苗包裝、銷售與運輸按NY/T1796的規定執行。5附錄A（規范性附錄）甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育常用化學試劑類別和等級表A.1給出了甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育常用化學試劑的類別和等級。表A.1甘蔗莖尖脫毒組培苗繁育常用化學試劑類別和等級品名分子式或英文名級別硝酸鉀KNOAR硝酸銨NHNOAR硫酸鎂MgSO·7HAR磷酸二氫鉀KHPOAR氯化鈣CaCl·2HAR硫酸錳MnSO·4HAR硫酸鋅ZnSO·7HAR硼酸HBOAR碘化鉀KIAR鉬酸鈉NaMoO·7HAR硫酸銅CuSO·5HAR氯化鈷CoCl·6HAR乙二胺四乙酸二鈉Na-EDTAR硫酸亞鐵FeSO·7HAR甘氨酸GlycineBR99.5％鹽酸吡哆醇(VB6)Pyridoxin·HClBR99％鹽酸硫銨素(VB1)Thiamine·HClBR99％煙酸Nicotinic（VitB5）BR99.5%肌醇Myo-inositolBR9