植物RNA 原位雜交方法一、制片材料的固定和包埋固定液：FAA:10%甲醛，5%冰醋酸，50%乙醇（均為RNase-free,DEPC水配制）Day1:取植物材料，莖尖或花原基（如花原基，不要剝除最外層苞片），立即放入FAA，抽真空15min，緩慢放氣，換一次固定液，Day2:脫水：50%乙醇30min50%乙醇60min60%乙醇60min

4C過夜。70%60min70%4CDay3:85%乙醇60min95%乙醇60min100%乙醇30min100%乙醇30min100%乙醇60min25%二甲苯+75%乙醇60min以下有二甲苯，在通風櫥中操作50%二甲苯+50%60min75%二甲苯+25%60min100%二甲苯60min100%二甲苯60min100%二甲苯60min組織透明，也可兩次100%二甲苯，第二次至組織透明為止50%二甲苯+50%58CDay4:100%石蠟（58C）Day5:100%石蠟（58C）Day6:換兩次100%石蠟（58C），傾倒時避免產生起泡用干凈較硬的紙（如打印紙）折好紙盒，薄的可雙層折。包埋。雜交探針的制備DNA（50-300bppolyA尾）PGEMT-easyvector以T7或者SP6引物測序出的連入方向，即是用T7或是SP6轉錄出的sense探針的方向。例如，某片段T7引物的測序結果是反向連入，則用T7轉錄出的探針是antisense,才是正確探針）用T7,SP6引物從質粒上將目的片段擴增出來（大體積擴增，通常 200-400ul）。若產物干凈則可直接回收，不干凈切膠回收。回收用RNase-free的管子，NFW水溶解（30-40ul,濃度>200ng/ul）T7:DNA10XT7buffer10XlabelingmixInhibitorT7polymeraseDllNFWSP6:DNA10XSP6buffer10Xlabelingmix

300-500ng1ul1ul0.5ul1ul1ul補足10ul300-500ng1ul1ul

37C1hrInhibitorSp6polymerase1%BSANFWDNase消化：轉錄產物

0.5ul 40C1hr1ul1ul10ul10ul10XbufferDNaseINFW補足沉淀：消化產物4MLiCI

6ul3ul60ul60ul7.5ul

37C 15min0.2MEDTA（可滅活酶活）7.5ul100%乙醇/總體積

225ul300ul -80C過夜4C,12000rpm,20min去上清75%乙醇洗，4同上，再洗一次冰上開蓋，晾干

7500rpm5min30ulNFW溶解，沉淀前、后分別取TubeRNA(ul)TubeRNA(ul)FromtubeRNABuffer(ul)DilutionFinalconcenon

1-2ul電泳11Original--10ng/ul(假定)21Original91:101ng/ul352451:1000.1ng/ul41531351:10000.01ng/ul51541351:100000.001ng/ul1將合成的探針和對照各取 1ul點到Nylonmembrane上UV-crosslinker(2400)2ml凍存管中2mlWashingbuffer2min2mlBlockingsolution30min2mlAntibodysolution30min2mlWashingbuffer15min2mlWashingbuffer15min2mlDetectionbuffer2-5min102mlDetectionbuffer+20ulNBT/BCIP(2:1)錫箔紙包裹凍存管， 5min看一探針定量所需試劑：試劑試劑RNAdilution成分Rnase-freewater:20SSC:37%甲醛=5:3:2x儲存條件新鮮配制用途Washingbufferbuffer0.1M馬來酸，0.15MNaClPH7.50.3%(V/V)Tween200.1M馬來酸，0.15MNaClNaOH調PH至7.50.1MTis-HCl,0.1MNaClPH9.5Kit自帶，馬來酸稀釋成1x15-25穩定保存去除非特異結合抗體15-25C保存15-25C保存BlockingSolutionDetectionbufferPH9.5Blockingsolution封閉Antibodysolution1:10000Blockingon中2-8C2hDIG-label結合切片將已用石蠟包埋好的植物材料修成梯形，切成

8um厚的蠟帶材料（盡量少帶石蠟，圈，不方便展片）。按順序擺放，正面朝上。在解剖鏡下用暗視野觀察蠟帶，以決定取舍。在聚賴氨酸化的載玻片（Fisher）上面鋪滿DEPC水，然后挑選合適的蠟帶小心地放在水面上（可在一張片上擺上從大到小不同時期）（注意正反面！！！） ，蠟帶完全展開后（42C燙板上數分鐘至幾十分鐘不等，注意觀察以免展過，以組織不開裂為度），用一張鏡頭紙輕輕壓在蠟帶上，然后用吸水紙（槍頭）吸掉載玻片上多余的水，使材料與載玻片之間無水存在，置于42C燙板上烘烤干燥36-48hr后備用，制好的片子最好在一星期內進行雜交）二、片子預處理Deparaffineandrehydration100%xylene二甲苯20min------100%xylene20min-------75%xylene+25%ethanol2min----25%xylene+75%ethanol-------100%ethanol--------95%ethanol------80%ethanol 60%ethanol------30%ethanol---------DEPCH20（eachstep2minafterthe1stand2ndsteps）0.25MHCl20min（862ulHCl40mlH2O）DEPC-H2O5min2xSSC20min2DEPC-HO5min22ProteinaseK:ProteinaseKbuffer20mg/ml）37C,30min2

pre-warmed,40ml）+ProteinaseK（8ul,Kbuffer:32mlDEPC-HRT,1xPBS,2min

O+4ml1MTris-HClpH7.5+4ml0.5MEDTApH7.5RT,0.2%glycinein1xPBS,2min（0.08gglycine 現稱in40ml1xPBS）RT,1xPBS,2x2minRT,4%formaldehyde,10min（（4.3ml甲醛溶液（濃度37%-40%）+35.7ml1xPBS）RT,1xPBS,2x5minToreducebackground:（現用現加）0.1MtriethanolaminepH8.0（三乙醇胺，不調pH）with0.5%aceticanhydride （乙酸酐）,withconstantstirring.Add536ultriethanolamine+160ulHClpH8.0（pH）,and200ulaceticanhydidein40mlPBSandimmediatelyaddslides.IncubateatRTfor5min.RT,1xPBS,2x5min三、雜交雜交體系100-150ulAB150ul雜交液由115.8ulA加34.2ulB組成雜交液A15.44ml:10ml去離子甲酰胺2ml50%dextransulfate（1g 2mlformamide）2ml10xblockingsolution1.2ml5MNaCl0.2ml1MTris-HClpH7.5O20.04ml0.5MEDTApH7.5雜交液B34.2ul:2.2ultRNA32ulprobe+DEPC-HO2雜交液B80C5min變性后立即放置冰上5min雜交parafilm膜或者蓋玻片輕輕覆蓋預處理后的片子，

42C（42C-50C）在濕室中雜交過夜（濕室中墊有用0.3MNaCl-2xSSC-50%甲酰胺飽和的吸水紙，放在一個大平皿中，每皿需要50ml）四、沖洗1.2xSSC50%甲酰胺（國產），2次用量2020xSSC甲酰胺（國產）DEPC-HO2總體積50ml250ml200ml500ml（大）5ml25ml20ml50ml（小）4ml20ml16ml40ml8ml40ml32ml80ml20xSSC（pH7.0）1L:NaCl173.5gNa3citrate檸檬酸鈉88.2g2.30min（此時蓋玻片會落下）

染缸中加入沖洗緩沖液，放入載玻片，50C水浴中溫育NTE5次用量。5XNTE（pH7.5）1L:NaCI146.1gTris6.05gEDTA1.86g5次 6次5xNTE 500ml 60mlDEPC-H2O 2000ml 240ml總體積 2500ml(大) 300ml(小染NTE37

缸)水浴中沖洗兩次，每次5min準備RNA酶A溶液（20ug/ml）,將載玻片放入溶液中37C水浴溫育RNA酶A儲備液10mg/ml 1ml 0.1mlNTE溶液 染缸）50ml（小染缸注：（1）RNA酶A溶液應提前放入37C水浴中預熱5min⑵加入RNA酶以后各步使用蒸餾水即可RNAA之前和之后使用的玻璃缸一定要分開放置，切勿混用！加入RNA酶A之前使用的玻璃缸，每次用完后沖洗干凈，加入部分 100%乙醇溶液，下使用在通風櫥中吹干即可。準備溶液：1XSSC:20xSSC25ml2.5ml2ml水475ml47.5ml38ml總體積500ml（大染缸）50ml（小染缸）40ml2 2 10xPBS（1xPBS:130mMNaCl,7mMNa HPO4.7H2O,3mMNaH PO4.HO）2 2 NaCl15.194g22.791g37.985gNaHPO4.7H O(NaHPO4.12HO)2 2 2 23.752g(5.012g)5.628g(7.518g)(12.53g)NaH PO4.HO(NaH2 2PO4.2HO)2 20.828g(0.936g)1.242g(1.404g)(2.34g)體積200ml300ml 500ml3)1xPBS:10xPBS(pH6.5-7.0)50ml5ml水450ml45ml總體積 500ml（大染缸）50ml（小染缸）NTE5min,37C8沖洗緩沖液，50C水浴，溫育1hr1xSSC，RT，2minPBS,RT,5min五、抗體染色準備溶液：10xDIG1(pH8.0)1L:Tris121.1gNaCl87.7g1)DIG1:10個，DIG2DIG3均在DIG1基礎上配制)10xDIG1 400ml 50ml 40ml水 3600ml 450ml 360ml總體積 4000m1(大染缸) 500ml(小染缸) 400mlDIG2:10XBlockingreage

50ml 5ml 4mlnt 450ml 45ml

36mlDIG1總體積

500ml（大染 50ml（小染缸）40ml注：新鮮配制，在60-70C

缸） ，溶液仍顯渾濁。Blockingreagent

本身有很水浴中溶解1hr多類似核酸的片段，可用于封閉核酸。這一步的目的是防止非特異性的吸附DIG3:（5-6次用量）牛血清白蛋白（BSA） 25g 3g

0.5gDIG1TritonX-100總體積

2500ml 300ml7.5ml 0.9ml2500ml 300ml（大） （小,

6次）

50ml0.15ml50ml（1注：當天新鮮配制，這一步的目的是封閉蛋白 次）DIG4約）每張片150ul,10張1.5ml加入抗體anti-digoxinei-P130兩小盒0.5ul 染色）注：使用前2-3min

20ml

30ml3ml5）DIG5：準備2-3 2ml 1.524g0.5MTrispH9.5 1.016g 117ml5MNaCl 78ml 150ml1MMgCl2（MgCl2.6H2O）100mlSDW體積DIG56）DIG6:25ml/槍頭盒NBT（50mg/ml）

150ml（6盒）450ul總濃度

0.15mg/mlBCIP（50mg/ml）注：使用前再配制，2.染色DIG15min

75ml（3盒或大盒）225ul112.5ul配制時應避光

225ul

0.075mg/mlDIG260min（1hr）DIG330minDIG490min-2hrR