實驗一光學顯微鏡的使用與微生物觀察

第一節(jié)普通光學顯微鏡的使用

一、實驗目的

1、了解普通光學顯微鏡的基本構造和工作原理。

2、學習并掌握普通光學顯微鏡，重點是油鏡的使用技術和維護知識。

3、在油鏡下觀察微生物的幾種基本形態(tài)。

二、基本原理

（一）普通光學顯微鏡的構造普通光學顯微鏡由機械系統(tǒng)和光學系統(tǒng)兩部分組成（圖1-1）。

1、機械系統(tǒng)

機械系統(tǒng)包括鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、調節(jié)器等。

（1）鏡座：它是顯微鏡的基座，可使顯微鏡平穩(wěn)地放置在平臺上。

（2）鏡臂：用以支持鏡筒，也是移動顯微鏡時手握的部位。

（3）鏡筒：它是連接接目鏡（簡稱目鏡）和接物鏡（簡稱物鏡）的金屬圓筒。鏡筒上端插入目鏡，下端與物鏡轉換器相接。鏡筒長度一般固定，通常是160mm。有些顯微鏡的鏡筒長度可以調節(jié)。

（4）物鏡轉換器：它是一個用于安裝物鏡的圓盤，位于鏡筒下端，其上裝有3?5個不同放大倍數的物鏡。為了使用方便，物鏡一般按由低倍到高倍的順序安裝。轉動物鏡轉換器可以選用合適的物鏡。轉換物鏡時，必須用手旋轉圓盤，切勿用手推動物鏡，以免松脫物鏡而招致?lián)p壞。

（5）載物臺：載物臺又稱鏡臺，是放置標本的地方，呈方形或圓形。載物臺上裝有壓片夾，可以固定被檢標本；有標本移動器，轉動螺旋可以使標本前后

和左右移動。有些標本移動器上刻有標尺，可指示標本的位置，便于重復觀察

（6）調節(jié)器：調節(jié)器又稱調焦裝置，由粗調螺旋和細調螺旋組成，用于調節(jié)物鏡與標本間的距離，使物像更清晰。粗調螺旋轉動一圈可使鏡筒升降約10mm，細調螺旋轉動一圈可使鏡筒升降約0?1mm。

圖1-1普通光學顯微鏡的構造

鏡座2.鏡臂3.鏡筒4.轉換器5.載物臺6.壓片夾7.標本移動器8.粗調螺旋9.細調螺旋10.目鏡11.物鏡12.虹彩光闌（光圈）13.聚光器14.反光鏡

2、光學系統(tǒng)

光學系統(tǒng)包括目鏡、物鏡、聚光器、反光鏡等。

（1）目鏡：它的功能是把物鏡放大的物像再次放大。目鏡一般由兩塊透鏡組成。上面一塊稱接目透鏡，下面一塊稱場鏡。在兩塊透鏡之間或在場鏡下方有一光闌。由于光闌的大小決定著視野的大小，故它又稱為視野光闌。標本成像于光闌限定的范圍之內，在光闌上粘一小段細發(fā)可用作指針，指示視野中標本的位置。在進行顯微測量時，目鏡測微尺被安裝在視野光闌上。目鏡上刻有5X、10X、15X、20X等放大倍數。可按需選用。

2）物鏡：它的功能是把標本放大，產生物像。物鏡可分為低倍鏡（4或

虹

10X）、中倍鏡（20X）、高倍鏡（40?60X）和油鏡（100X）。一般油鏡上刻有

“OI”（oilimmersion）或HI（homogeneousimmersion）字樣，有時亥有一圈紅線或黑線，以示區(qū)別。物鏡上通常標有放大倍數、數值孔徑（numericalaperture,簡寫為NA）、工作距離（物鏡下端至蓋玻片間的距離，mm）及蓋玻片厚度等參數（圖1-2）。以油鏡為例,100/1.25分別表示放大倍數為100倍，NA為1.25;

160/0.17分別表示鏡筒長度160mm，蓋玻片厚度等于或小于0.17mm。

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1HO/U.17

口

圖1-2XSP-I6型顯微鏡物鏡的主要參數

（3）聚光器：聚光器又稱聚光鏡，它的功能是把平行的光線聚焦于標本上，增強照明度。聚光器安裝在鏡臺下，可上下移動。使用低倍物鏡（簡稱低倍鏡）時應降低聚光器，使用油鏡時則應升高聚光器。聚光器上附有虹彩光闌（俗稱光圈），通過調整光闌孔徑的大小，可以調節(jié)進入物鏡光線的強弱（物鏡焦距、工作距離與光圈孔徑之間的關系見圖1-3）。在觀察透明標本時，光圈宜調得相對小一些，這樣雖會降低分辨力，但可增強反差，便于看清標本。

圖1-3物鏡焦距、工作距離與光圈孔徑之間的關系

（4）反光鏡：它是普通光學顯微鏡的取光設備，其功能是采集光線，并將光線射向聚光器。反光鏡安裝在聚光器下方的鏡座上，可以在水平與垂直兩個方向上任意旋轉。反光鏡的一面是凹面鏡，另一面是平面鏡。一般情況下選用平面鏡，光量不足時可換用凹面鏡。

（二）普通光學顯微鏡的性能

1、數值孔徑

數值孔徑（NA）又稱開口率，是指介質折射率與鏡口角1/2正弦的乘積，可用式1-1表示。

NA=nsin-

2（1-1）

式中，n為物鏡與標本之間介質的折射率，為鏡口角（通過標本的光線延

伸到物鏡邊緣所形成的夾角（圖1-4）。

物鏡的性能與物鏡的數值孔徑密切相關，數值孔徑越大，物鏡的性能越好。因為鏡口角總是小于180。，所以sin2的最大值不可能超過1。又因為空氣的折射率為1，所以以空氣為介質的數值孔徑不可能大于1，一般為0.05?0.95。根據式1-1，要提高數值孔徑，一個有效途徑就是提高物鏡與標本之間介質的折射率

（圖1-5）。使用香柏油（折射率為1.515）浸沒物鏡（即油鏡）理論上可將數值孔徑提高至1.5左右；實際數值孔徑值也可達1.2?1.4

圖1-4物鏡的鏡口角

的影響

圖1-5介質折射率對光線通路

2、分辨率

分辨率是指分辨物像細微結構的能力。分辨率常用可分辨出的物像兩點間的最小距離（D）來表征（式1-2）。D值愈小，分辨率愈高。

D=—b

2nsin-（1-2）

2

式中，入為光波波長。

比較式1-1和式1-2可知，D可表示為：

九

D-2NA（1-3）

根據式1-3，在物鏡數值孔徑不變的條件下，D值的大小與光波波長成正比。要提高物鏡的分辨率，可通過兩條途徑：①采用短波光源。普通光學顯微鏡所用的照明光源為可見光，其波長范圍為400?700nm。縮短照明光源的波長可以降低D值，提高物鏡分辨率。②加大物鏡數值孔徑。提高鏡口角或提高介質折射率n,都能提高物鏡分辨率。若用可見光作為光源（平均波長為550nm），并用數值孔徑為1.25的油鏡來觀察標本，能分辨出的兩點距離約為0.22am。

3、放大率

普通光學顯微鏡利用物鏡和目鏡兩組透鏡來放大成像，故又被稱為復式顯微鏡。采用普通光學顯微鏡觀察標本時，標本先被物鏡第一次放大，再被目鏡第二次放大（圖1-6）。所謂放大率是指放大物像與原物體的大小之比。因此，顯微鏡的放大率（V）是物鏡放大倍數（V）和目鏡放大倍數（V）的乘積，即：12

V二VXV（1-4）

12

如果物鏡放大40倍，目鏡放大10倍，則顯微鏡的放大率是400倍。常見物鏡（油鏡）的最高放大倍數為100倍，目鏡的最高放大倍數為15倍，因此一般顯微鏡的最高放大率是1500倍。

肉版見到-

圖1-6普通光學顯微鏡的成像原理

4、焦深

一般將焦點所處的像面稱為焦平面。在顯微鏡下觀察標本時，焦平面上的物

像比較清晰，但除了能看見焦平面上的物像外，還能看見焦平面上面和下面的物

像，這兩個面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深與數值孔徑和放大率成反比，數值孔徑和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油鏡時需要細心調節(jié)，否則物像

極易從視野中滑過而不能找到

三、實驗器材

1、儀器顯微鏡；

2、材料？標本片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙四、實驗程序

（一）顯微鏡（油鏡）操作

1、領取并檢查顯微鏡：按學號向實驗指導老師領取顯微鏡，所有實驗課均對號使用。從顯微鏡箱中取出顯微鏡時，用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，直立平移（圖1-7），輕輕放置在實驗臺上（圖1-8），檢查各部件是否齊全，鏡頭是否清潔，有問題及時報告老師。

圖1-8顯微鏡的

圖1-7顯微鏡的搬動

放置

光源：良好的照明是保證顯微鏡使用效果的重要條件。將低倍鏡旋轉到工作

位置，用粗調螺旋提升鏡筒，使鏡頭距離載物臺10mm左右，降低聚光鏡的位置，完全打開虹彩光闌，一邊看目鏡，一邊調節(jié)反光鏡鏡面的角度（在正常情況下，一般用平面反光鏡；若自然光線較弱，則可用凹面反光鏡）。然后，調節(jié)聚光器的位置（酌予升降），直至視野內得到均勻適宜的亮度。

3、低倍鏡觀察：使用低倍鏡觀察，視野較廣，焦深較大，便于搜尋目標，因此宜從低倍鏡開始觀察。將載玻片標本（涂面朝上）置于載物臺中央（圖1-9），用壓片夾固定（圖1-10），并將標本部位移到正中，轉動粗調螺旋（圖1-11），使鏡頭與標本的距離降到10mm左右。然后，一邊看目鏡內的視野，一邊調節(jié)粗調螺旋緩慢升高鏡頭，至視野內出現物像時，改用細調螺旋（圖1-12），繼續(xù)調節(jié)焦距和照明，以獲得清晰的物像，并將所需部位移到視野中央，再換中、高倍鏡觀察（圖1-13）。

圖1-10用壓片夾固定載玻片標本

圖1-9將載玻片標本置于載物臺中央

圖1-11轉動粗調螺旋圖1-12轉動細調螺旋圖1-13轉換物

鏡

4、中、高倍鏡觀察：依次用中、高倍鏡觀察低倍鏡下鎖定的部位，并隨著物鏡放大倍數的增加，逐步提升聚光器增強光線亮度。找出所需目標，將其移至視野中央。

5、油鏡觀察：將聚光器提升至最高點，轉動轉換器，移開高倍鏡，使高倍鏡和油鏡成“八”字形，在標本中央滴一小滴香柏油，把油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉動細調螺旋，直至看清物像。如果油鏡上升至離開油面還未看清物像，則需重新調節(jié)。可從側面注視，小心地轉動粗調節(jié)器將油鏡重新浸在香柏油中，但不能讓油鏡壓在標本上，更不能用力過猛，擊碎玻片，損壞鏡頭。

6、調換標本：觀察新標本片時，必須重新從第3步開始操作。

7、用后復原：觀察完畢，轉動粗調螺旋提升鏡筒，取下載玻片，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用擦鏡紙蘸取少許二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去鏡頭上的殘留油跡，再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，最后用細軟的綢布擦去機械部件上的灰塵和冷凝水。降低鏡筒，將物鏡轉成“八”字形置于載物臺上。降低聚光器，避免聚光器與物鏡相碰。使反光鏡垂直于鏡座，以防受損。將顯微鏡放回顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的顯微鏡柜內。

第二節(jié)微生物形態(tài)觀察

一、儀器和材料

1、顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或液體石蠟、二甲苯。

2、示范片：大腸桿菌（桿狀）、小球菌（球狀）、硫酸鹽還原菌（弧形）、枯草芽孢桿菌、放線菌、顫藻、魚腥藻或念珠藻等。

二、試驗內容和操作方法

1、嚴格按照光學顯微鏡操作方法，依低倍、高倍和油鏡的次序觀察桿狀、球狀、弧狀和絲狀的細菌示范片，用鉛筆分別繪出各種細菌的形態(tài)圖。

2、同法逐個觀察放線菌的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。

3、同法逐個觀察顫藻、魚腥藻或念珠藻的示范片，分別繪出其形態(tài)圖。

問題與思考

1、使用顯微鏡的油鏡時，為什么必須使用鏡頭油？

2、鏡檢標本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不直接用高倍鏡或油鏡觀察？

實驗二培養(yǎng)基的配制

一、實驗目的

學習制備培養(yǎng)基的基本技術

2.制備牛肉膏蛋白瓊脂培養(yǎng)基二、實驗基本原理

培養(yǎng)基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質，用人工方法配制而成的各種營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基為微生物的生長提供營養(yǎng)物質和生存空間。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件；（1）適當組分和比例的營養(yǎng)物質；（2）適宜的pH值；（3）合適的滲透壓；（4）保持無菌狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物學工作者的主要技術操作之一。

培養(yǎng)基的種類：根據培養(yǎng)基的組成成分，可將培養(yǎng)基分為三類：合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成的。

從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分：液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液態(tài)狀培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2％左右的凝固劑的固體狀培養(yǎng)基或固體狀農副產品培養(yǎng)基。

半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2％-0.5％凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。

微生物最常用的凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養(yǎng)物質，只能被極少數種類的細菌分解利用。瓊脂是從海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96C以上即成溶膠狀態(tài)，融化的瓊脂，當溫度下降到42°C以下，又凝固為固體。

牛肉膏蛋白培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，可供作繁殖之用，制作固體培養(yǎng)基時須加2%瓊脂，培養(yǎng)細菌時，應用稀酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養(yǎng)基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%,NaC10.5%,pH7.4?7.6。

三、材料與儀器

試劑牛肉膏，蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/LNaOH、1mol/LHC1。

其它：試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花

牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。

四、實驗步驟

稱量根據用量按比例依次稱取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。

溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。

調PH用1mol/LNaOH或1mol/LHC1把PH調至所需范圍。

過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗結果的觀察，如無特殊

要求時可省去此步驟。

分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內或三解瓶內分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染

1）液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。

2）固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，斜

面長度不超過管長的1/2（圖1）。分裝三解瓶，以不超過容積的1/2為宜。

3）半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。

圖1滅菌的試管培養(yǎng)基趁熱擺成斜面

加棉塞分裝完畢后，在試管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。

保存滅菌后的培養(yǎng)基放入37°C養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以檢驗滅菌的效果，

無污染方可使用。

問題與思考：

1．培養(yǎng)基配制時應注意什么問題？為什么？2．分裝培養(yǎng)基時為什么要使用彈簧夾？

3．培養(yǎng)基配好后，為什么要立即滅菌？

實驗三消毒和滅菌

一、實驗目的

了解干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌的操作方法。

二、實驗原理

滅菌是用物理或化學的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物。消毒是用物理或化學的方法殺死物體上絕大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生物）。消毒實際上是部分滅菌。在微生物實驗、生產和科研工作中，需要進行純培養(yǎng)不能有任何雜菌，因此，對所用器材、培養(yǎng)基要進行嚴格滅菌，對工作場所進行消毒，以保證工作順利進行。

滅菌的方法，通常可以分為四大類：（1）加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；（2）過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；（4）化學藥劑滅菌和消毒。

在本實驗中，介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關的部份滅菌方法。

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變性而達到滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內含水量越大，則蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160?170°C），時間長（1?2h）。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于水蒸汽不能溢出而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點升高，得到高于100°C的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

一般培養(yǎng)基用O.IMPa、121.1C.

15?30min可達到徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變.

三、材料與儀器

吸管、培養(yǎng)皿、試管、電熱干燥箱，手提試高壓蒸汽滅鍋，牛肉膏蛋白胨培

養(yǎng)基、蒸餾水。

四、實驗步驟

（一）干熱滅菌法適用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養(yǎng)基不適用。

1．將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留有一定的間隙），關好箱門。

2．接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節(jié)器，保持

加熱升溫狀態(tài)，至箱內達到100C時關閉排氣孔。

3?當溫度升到160?170C時，借恒溫調節(jié)器的自動控制，保持此溫度2h。4?切斷電源，冷卻至70C時，打開箱門，取出滅菌物品（未降至70度以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降導致玻璃器皿炸裂）。

（二）高壓蒸汽滅菌1．首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角架相平

為宜。

2．放回內層鍋，并裝入待滅菌物品（內裝培養(yǎng)基或小的三角瓶），不要裝得太擠，以免妨礙汽流通影響滅菌效果，三角瓶口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋溫包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個棉栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

3．用電爐或其他方法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣，待冷空氣排盡后，關上排氣閥讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內達到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。

4．停止加熱，待壓力表的壓力降至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。

注意：當壓力不為零時，不能開蓋取物否則由于壓力突然下降，容器內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。

5．高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構，不得隨意調節(jié)。

問題與思考

1．干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么？

2．為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高？

3．高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內的空氣？

實驗四、微生物接種技術

一、實驗目的

掌握微生物各種接種方法。

掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。

二、實驗原理

在自然界中，各種微生物是在互為依賴的關系下共同生活的。因此，為了取出特定的微生物進行純培養(yǎng)，必須把它們分離出來。將一種微生物移到另一種滅菌的培養(yǎng)基上稱為接種。在接種、培養(yǎng)過程中，均需嚴格的無菌操作，防止雜菌侵入，所用的器具必須經過滅菌，接種工具無論使用前后都要經過火焰滅菌，且

在無菌室或無菌箱中進行。

三、材料與儀器

（一）菌種

大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌

（二）緩沖葡萄糖肉湯培養(yǎng)基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯半固體培養(yǎng)基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基試管斜面；緩沖葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基平板；察氏培養(yǎng)基試管斜面；察氏培養(yǎng)基平板。

（三）接種環(huán)、接種針、接種鉤。鑷子、酒精燈、火柴、酒精棉、試管架、漿糊、標簽紙、恒溫培養(yǎng)箱等。

四、實驗步驟

1．接種前的準備工作

（1）檢查接種工具。

（2）在欲接種的培養(yǎng)基試管或平板上貼好標簽，標上接咱的菌名、操作者、接種日期等。

（3）將培養(yǎng)基、接種工具和其他用品全部放在實驗臺上擺好，進行環(huán)境消毒。

2．接種方法

（1）試管接種方法

將菌種試管與待接種的試管培養(yǎng)基依次排列，挾于左手的拇指與食指之間，用右手的中指與食指或食指與小指拔出棉塞并挾出

置試管口于酒精火焰附近；

將接種工具垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過火焰三次，然后再放入有菌試管壁內，于無菌的培養(yǎng)基表面待其冷卻。

用接種工具取少許菌種置于另一支試管中，按一定的接種方式把菌種接種到新的培養(yǎng)基上。

取出接種工具，試管口和棉塞進行火焰滅菌。

重新塞上棉塞。

燒死接種工具上殘留余菌，把試管和接種工具放回原處。

（2）試管菌種接到平板培養(yǎng)基的方法

左手持平板和試管菌種，右手松動試管試管棉塞，燒接種工具

右手小指與四指取下棉塞，取菌，打開平皿。

將菌種接種到平皿上，立即蓋上平皿。

酒精燈火焰上燒接種工具滅菌

棉塞過火，重新塞上試管

3.

培養(yǎng)

1）將接種的細菌培養(yǎng)基放在32?37C恒溫箱內培養(yǎng)24h后觀察

2）將接種分離后的酵母菌和霉菌放在25?28C的恒溫箱內，酵母菌培養(yǎng)48h，霉菌培養(yǎng)72h后觀察。

3）平板培養(yǎng)基置于恒溫箱內倒置培養(yǎng)

問題與思考

1．為什么從事微生物實驗工作的最基本要求是無菌操作？

2．大腸桿菌接種于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內培養(yǎng)24小時后，會出現什么情況？實驗五、細菌的簡單染色和革蘭氏染色

一、實驗目的了解革蘭氏染色的原理，學習并掌握革蘭氏染色的方法。

I、細菌簡單染色法

一、實驗原理

細菌的涂片和染色是微生物學實驗中的一項基本技術。細菌的細胞小而透明，在普通光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。

所謂簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，可用以觀察微生物的形狀、大小及細胞排列狀態(tài)，是微生物技術中應用廣泛，操作簡便的染色法。

用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。例如，美藍(亞甲藍)實際上是氯化亞甲藍鹽(methylenebluechloride,縮寫為MBC);它可被電離成正、負離子：

MBCTmethyleneblue++chloride-

帶正電荷的染料離子可使細菌細胞染成藍色。常用的堿性染料除美藍外，還有結晶紫(crystalviolet)、堿性復紅(basicfuchsin)、番紅(又稱沙黃，safranine)等。

酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅

染色前必須先固定細菌，其目的有二：一是殺死細菌，使細胞質凝固，菌體粘附于玻片上;二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時應盡量維持細胞原有形態(tài)，防止細胞膨脹或收縮。

二、實驗器材

1、菌種巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或蠟狀芽孢桿菌(Bacillus

cereus);

2、儀器顯微鏡;

3、材料接種環(huán)，酒精燈，火柴，載玻片，洗瓶，廢液缸，擦鏡紙，吸水紙；

4、染料草酸銨結晶紫或石碳酸復紅。

三、操作步驟

1、涂片在潔凈無油膩的玻片中央放一小滴蒸餾水，用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜。

2、干燥將涂片于空氣中自然晾干，或將涂片置于火焰高處微熱烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形。

3、固定手執(zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過迅速通過火焰2-3次（用手指觸涂片反面，以不燙手為宜）。待玻片冷卻后，再加染料；

4、染色玻片置于玻片擱架上，加適量（以蓋滿菌膜為度）結晶紫染色液（或石炭酸復紅液）于菌膜部位，染l-2min。

5、水洗傾去染色液，用洗瓶中的自來水自玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無染色液的顏色時為止。

6、干燥自然干燥或用吸水紙蓋在涂片部位以吸去水分（注意勿擦去菌體）。

7、鏡檢用油鏡觀察并繪出細菌形態(tài)圖。

8、清理實驗完畢，擦凈顯微鏡。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后備用。

四、注意事項

1、玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

2、挑菌量宜少，涂片宜薄，過厚則不易觀察

U、革蘭氏染色法

一、實驗原理

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別性染色法。

革蘭氏染色法的主要步驟是先用結晶紫進行初染；再加媒染劑--碘液，以增加染料與細胞間的親和力，使結晶紫和碘在細胞膜上形成分子量較大的復合物；然后用脫色劑（乙醇或丙酮）脫色；最后用蕃紅復染。凡細菌不被脫色而保留初染劑的顏色（紫色）者為革蘭氏陽性菌，如被脫色后又染上復染劑的顏色（紅色）者為革蘭氏陰性菌。

該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。

二、實驗器材

1、菌種牛肉膏瓊脂斜面28°C培養(yǎng)24h的大腸桿菌（Escherichiacoli）斜

面菌種，牛肉膏瓊脂斜面28°C培養(yǎng)16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis）斜面菌種；

2、儀器顯微鏡；

3、材料載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。

4、染料草酸銨結晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番紅

染色液；

三、操作步驟

1、涂片在一張載玻片上加兩滴蒸餾水后，分別涂布枯草芽孢桿菌和大

腸桿菌（注意涂片切不可過于濃厚）。

2、固定將制成的涂片干燥固定，固定時通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

3、染色

⑴初染將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結晶紫染色液（加量以蓋滿菌膜

為度），染色l-2min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。

⑵媒染滴加（Lugol）碘液，染1-2min，水洗。

⑶脫色滴加95%乙醇，脫色20-25s立即水洗，以終止脫色。

⑷復染滴加蕃紅，染色2-3min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。

4、鏡檢干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌（G）;

被染成紅色者是革蘭氏陰性菌（G-）。

四、注意事項

1、革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為是革蘭氏陰性菌;如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被認為是革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄、脫色時玻片晃動的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌作練習，以掌握脫色時間。當要確證一個未知菌的革蘭氏反應時，應同時做一張已知革蘭氏陽性菌和陰性菌的混合涂片，以資對照。

2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

3、選用培養(yǎng)16-24h菌齡的細菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。

問題與思考

（1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關鍵一步是什么？

（2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操作正確，結果可靠？

實驗六、藻類的培養(yǎng)、觀察、計數

一、實驗目的：

1、通過實驗了解藻類生長的基本條件和方法，掌握淡水微藻的基本培養(yǎng)方法

2、顯微鏡下觀察并識別幾種常見淡水微藻;

3、了解血球計數板的計數原理，掌握血球計數板的計數方法。

二、實驗材料：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻;

三、主要實驗儀器和器皿

1?顯微鏡，血球計數板，計數器2?培養(yǎng)瓶（三角瓶），量筒；

四、試劑

1?培養(yǎng)液：BG11培養(yǎng)液2?碘固定液

五、培養(yǎng)條件：

光照強度：1200Lux、溫度：20-25°C、光照時間：24h連續(xù)光照

六、方法和步驟

1、前期準備：各種器皿的消毒、培養(yǎng)液的配制、準備并培養(yǎng)3種不同的淡水微藻：斜生柵藻、小球藻、銅綠微囊藻；

2、接種：將不同的實驗藻種分別接種到盛有培養(yǎng)液的不同三角瓶（100ml）中,接種的藻容量和新培養(yǎng)液之間的比例為1：2?1:3。培養(yǎng)量與總容量的比小于2/3;

3、培養(yǎng)：按上述培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中，每天搖瓶3次，使藻類充分見接觸氧氣和光照;

4、換代：5-7天換代1次，換代濃度同上;

5、固定：將藻液搖勻，用小三角瓶分別倒取一定量20-30ml）的上述3種藻液加入幾滴碘液,搖勻殺死細胞;

6、取樣：搖勻后，用吸管吸取上述不同的藻液分別滴到蓋有蓋玻片的血球計數板的邊緣，使藻液慢慢進入蓋有蓋玻片的區(qū)域，避免蓋玻片浮起，用吸水紙輕輕吸走多余的藻液，每種藻液取樣2次;

7、觀察計數：顯微鏡下觀察不同的藻種并分別計數。

1）血球計數板計數原理血球計數板是一塊特制的載玻片，板的中部一“H"型的凹槽，橫槽兩邊的平臺上各有一個有九個大方格的方格網。每個大格：邊長為1mm,深為0.1mm,容積為0.1mm3（10-4ml）。中間大方格為計數室以計數室為中心，對角線兩端各有一個有16

個中格組成的大格。

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2）計算藻細胞密度數出對角線上的4個大方格中的總藻數A,若藻液的稀釋倍數為B,則計算公式如下：細胞密度=A-4XBX104（個/ml）（單位：個/ml）

七、實驗結果

按下表記錄實驗數據。

次數

各大格中的藻數

1

1

2

3

4

2

八、問題與思考用此法計數的結果是活藻體還是死、活菌體的總和？

實驗七土壤細菌、放線菌、霉菌及纖維素降解菌的分離及提純

一、目的要求

通過平板涂布法學習土壤中一般異養(yǎng)性細菌、放線菌、霉菌及纖維素降解菌的分離以及純化方法

二、基本原理微生物分離培養(yǎng)的基本原理是：選用不同成分和酸堿度的培養(yǎng)基，在不同的濕度和不同的通氣條件下進行培養(yǎng)，使只有適合該條件的微生物得以生長。微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。由于土壤中菌數高，常需進行一定量稀釋，使微生物能在培養(yǎng)基上長成單個菌落，以達到分離的目的。本實驗將采用四種不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不用的微生物

三、器材

1、培養(yǎng)基：牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基

2、土壤懸液、無菌玻璃棒、無菌吸管、盛有9ml無菌水的試管、無菌試管

四、操作步驟

1、選定采土地點后，鏟去表涂層2?3cm,取3?10cm深層土壤10g。稱取土樣1g,加入盛有99ml無菌水的錐形瓶中，振蕩10min，使土壤中菌體、芽孢或孢子均勻分散,制成10－2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離,以制備10－7稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5ml無菌水試管6支，按10—3……10—7順序編號，放置在試管架上。取移液管一支，準確吸取0.5ml10—2土壤稀釋液，此為10—3稀釋度的土壤稀釋液,依次操作,制成10—4、10—5、10—6、10—7的土壤稀釋液。

2、用無菌吸管分別吸取適宜濃度的土壤稀釋液0.1ml，接種于相應的培養(yǎng)基平板上。每一稀釋度至少有兩個平板重復。接種時每一稀釋度用一支無菌吸管,菌液注入平板后,應立即用無菌涂棒將該菌液均勻地涂布于平板表面,注意勿刮破瓊脂。

通常,細菌采用10-4、10-5、10-6三種稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)；放線菌采用10-3、10-4.10-5三種稀釋液接種于高氏一號培養(yǎng)基。28°C培養(yǎng)；霉菌則采用10-2、10-3、10-4三種稀釋度接種于馬丁培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)；纖維素降解菌采用10-2、10-3、10-4三種稀釋度接種于赫奇遜培養(yǎng)基，28°Co

3、當單菌落長出時,用接種環(huán)挑菌落接到相應的斜面培養(yǎng)基上,在相應的溫度下培養(yǎng)

五、問題與思考

1、你所涂布的平板是否較好的得到了單菌落？

2、在四種不同的平板上你得到了哪些類群的微生物？簡述它們的菌落特征？

實驗八、微生物實驗常用玻璃器皿清洗

一、實驗目的

二、1.熟悉實驗所需各種常用玻璃器皿的名稱和規(guī)格

三、2.掌握玻璃器皿等器材的清洗、包扎技術

二、實驗原理為確保實驗順利地進行,要求把實驗所用的玻璃器皿清洗干凈。為保持滅菌后和無菌狀態(tài),需要對培養(yǎng)皿、吸管等進行包扎,對試管和三角瓶等加塞棉塞。這些工作看起來很普通簡單,但如操作不當或不安操作規(guī)定去做,則會影響實驗結果,甚至會導致試驗的失敗。

三、試劑和儀器

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