分子生物技術(shù)問答題-農(nóng)大期末考試復(fù)習(xí)題分子生物技術(shù)問答題-農(nóng)大期末考試復(fù)習(xí)題分子生物技術(shù)問答題-農(nóng)大期末考試復(fù)習(xí)題資料僅供參考文件編號：2022年4月分子生物技術(shù)問答題-農(nóng)大期末考試復(fù)習(xí)題版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：試比較DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)。相同點(diǎn)：都以DNA鏈作為模板，合成的方向均為5’→3’，聚合反應(yīng)均遵從堿基配對原則，核苷酸之間形成磷酸二酯鍵使核苷酸鏈延伸。不同點(diǎn)：復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均復(fù)制，全部信息模板鏈，部分信息原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）mRNA，tRNA，rRNA引物RNA引物無配對G-C;T-AA-U;T-A;C-G簡述真核與原核基因轉(zhuǎn)錄方面存在的差異。原核生物真核生物RNA聚合酶只有1種。3種，分別轉(zhuǎn)錄不同的RNAmRNA結(jié)構(gòu)通常5‘帽子和3’尾巴順反子功能相近的基因通常形成一個(gè)操縱子，由共同的調(diào)控區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。轉(zhuǎn)錄起始不同的聚合酶有不同的啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止在RNA水平發(fā)生作用：不依賴ρ因子的終止子在柄部富含GC堿基對，而且連接一串富含U的莖環(huán)結(jié)構(gòu)；依賴于ρ因子的終止子通過ρ因子與β亞基的作用促使轉(zhuǎn)錄終止。3類RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄因子都需要富含AT的序列。簡述RNA的種類及其生物學(xué)作用。比較真核生物和原核生物mRNA的異同。原核生物和真核生物mRNA的差別在于可翻譯順反子的數(shù)目，真核生物的mRNA是單順反子。而且真核生物的mRNA在其3’末端有多聚腺苷酸尾巴（polyA），而5’末端有7－甲基鳥嘌呤帽子。真核生物的mRNA尾部區(qū)域有時(shí)會攜帶特定的去穩(wěn)定因子。簡述真核生物mRNA基因的轉(zhuǎn)錄過程。1) 模板識別：RNA聚合酶與雙鏈DNA的啟動(dòng)子開始結(jié)合；DNA雙鏈被分開；形成轉(zhuǎn)錄泡。2) 轉(zhuǎn)錄的起始：RNA中第一個(gè)核苷酸鍵合成；合成前9個(gè)核苷酸鍵時(shí)，酶仍舊位于啟動(dòng)子上；聚合酶成功地完成了RNA鏈的延伸并離開啟動(dòng)子。3) 延伸階段：延伸階段包括DNA結(jié)構(gòu)的改變帶來的轉(zhuǎn)錄泡前移。在轉(zhuǎn)錄泡中，模板鏈的瞬間解旋區(qū)與新生的RNA鏈在延伸點(diǎn)發(fā)生配對。RNA聚合酶沿DNA移動(dòng)，RNA鏈逐漸延長，酶一邊移動(dòng)一邊將DNA解螺旋，使一段新的模板以單鏈形式暴露出來。核苷酸以共價(jià)鍵形式被添加到RNA鏈的3’末端，在解旋區(qū)形成一個(gè)RNA-DNA雜交鏈。解旋區(qū)之后的DNA模板鏈又與另一條單鏈DNA配對并形成雙螺旋。RNA形成游離的單鏈。4) 轉(zhuǎn)錄的終止：包括對那些不再被加到RNA上的堿基位點(diǎn)進(jìn)行識別。磷酸二酯鍵停止形成，轉(zhuǎn)錄復(fù)合體分離，轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)最后一個(gè)堿基加入到RNA鏈上，轉(zhuǎn)錄泡崩解，RNA-DNA雜交被破壞，DNA重新形成雙螺旋，聚合酶和RNA都釋放下來。簡要說明真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。真核生物轉(zhuǎn)錄的前體RNA如何加工為成熟的mRNA1)5’端加帽子。5’加帽是一個(gè)多步加工過程，第一步是鳥苷轉(zhuǎn)移酶將一個(gè)鳥苷酸加在5’RNA的前端，產(chǎn)生5’-5’對接的磷酸二酯鍵。第二步由鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶將一個(gè)甲基基團(tuán)加到嘌呤環(huán)的7位氮原子使5’帽子鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基鳥嘌呤。2)3’端加poly(A)尾巴。在切除前體mRNA3'末端的一段序列后，在poly(A)多聚酶作用下，合成再加上多聚腺苷酸，約250個(gè)腺嘌呤核苷酸尾巴。3)內(nèi)含子的剪接。核mRNA前體含有邊界順序、分枝點(diǎn)序列及其內(nèi)含子5’端保守序列，本身不能形成二級結(jié)構(gòu)，必需依賴于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的幫助才能形成剪接體，進(jìn)行自我剪接，將內(nèi)含子（intron）去除，而把外顯子（exon）連接起來。4)化學(xué)修飾。某些堿基進(jìn)行甲基化等修飾真核生物細(xì)胞的RNA內(nèi)含子剪接的主要方式。簡述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其作用。轉(zhuǎn)錄因子也稱轉(zhuǎn)錄激活因子，它們可對轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝及轉(zhuǎn)錄速率施加影響，決定某一基因是否表達(dá)，通常有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)，存在DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。DNA識別或結(jié)合域能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以在適當(dāng)?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄。概括典型原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能。啟動(dòng)子是與RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的特殊序列。典型的原核生物啟動(dòng)子大約40個(gè)核甘酸并有2個(gè)重要的序列。－35區(qū)：位于復(fù)制起始位點(diǎn)上游35個(gè)核甘酸的6個(gè)核甘酸序列，能被RNA聚合酶全酶識別并結(jié)合。其中，亞基在識別中起重要作用。因?yàn)闆]有亞基的核心酶只能隨機(jī)地結(jié)合在DNA上。－10區(qū)：位于－10處的6核甘酸序列。RNA聚合酶松散結(jié)合到－35區(qū)后，沿著DNA移動(dòng)到－10區(qū)并解鏈，形成緊密結(jié)合的復(fù)合體，確保轉(zhuǎn)錄方向。保守序列TATAAT。蛋白質(zhì)合成簡述真核與原核核糖體的主要區(qū)別是什么？

真核細(xì)胞80S核糖體中核糖體蛋白和rRNA數(shù)量和體積均比原核細(xì)胞70S核糖體的大，其體積約為原核的2倍。真核細(xì)胞的大小亞基（即40S與60S）均比原核細(xì)胞的的（原核為30S和50S）。在兩種細(xì)胞的核糖體中，rRNA占絕大部分體積，原核細(xì)胞的RNA含量則比真核高。簡述真核與原核細(xì)胞中翻譯起始的主要區(qū)別是什么？

原核生物與真核生物翻譯起始的主要區(qū)別是來自mRNA的本質(zhì)差異以及小亞基與mRNA起始密碼子上游區(qū)結(jié)合的能力。原核生物mRNA較不穩(wěn)定，而且是多順反子，在IF-3介導(dǎo)下，通過16SrRNA的3’末端在核糖體結(jié)合位點(diǎn)與小亞基直接結(jié)合后，原核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物就裝配起來。在真核生物細(xì)胞中，需要幾種起始因子（eIF44A4B）幫助mRNA的啟動(dòng)，起始復(fù)合物才能結(jié)合到mRNA帽子上。一旦結(jié)合，起始復(fù)合物開始向下游區(qū)搜索，直至找到第一個(gè)AUG密碼子。簡述蛋白質(zhì)翻譯的基本過程。

(1)氨基酸的活化。氨基酸必須在氨酰-tRNA合成酶的作用下，生成活化氨基酸——AA-tRNA。tRNA與相應(yīng)氨基酸的結(jié)合是蛋白質(zhì)合成中的關(guān)鍵步驟。（2）翻譯的起始。翻譯起始需要游離的核糖體亞基。細(xì)菌翻譯起始分成3步：30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-1，IF-3結(jié)合，通過SD序列與mRNA模板相結(jié)合；在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基內(nèi)的P位，tRNAfMet上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對。帶有tRNA、mRNA、3個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子（或在真核生物中，小亞基首先識別mRNA的5′端，再移動(dòng)到起始位點(diǎn)，并在這里同大亞基結(jié)合。真核生物和原核生物中的翻譯起始幾乎都是用AUG。起始tRNA是一種不同的類型，但其所帶的甲硫氨酸沒有被甲酰化，稱為tRNAiMet）。(3)翻譯的延伸。生成起始復(fù)合物、第一個(gè)AA與核糖體結(jié)合以后，肽鏈開始伸長。按照mRNA模板密碼子的排列，AA通過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個(gè)氨基酸就是一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括AA-tRNA與核糖體的結(jié)合、肽鍵的生成和移位。(4)肽鏈的終止。終止密碼子不能被tRNA識別。從最后一個(gè)tRNA上釋放完整的多肽鏈，將tRNA從核糖體上逐除出，核糖體與mRNA解離，核糖體解體。簡述蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制。蛋白質(zhì)的合成靠什么維持其合成的忠實(shí)性？

密碼子的兼并性和專一性；密碼子與反密碼子正確配對；氨酰-tRNA的高度特異性；校正作用。概括典型原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能。

啟動(dòng)子是與RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的特殊序列。典型的原核生物啟動(dòng)子大約40個(gè)核甘酸并有2個(gè)重要的序列。－35區(qū)位于復(fù)制起始位點(diǎn)上游35個(gè)核甘酸的6個(gè)核甘酸序列，能被RNA聚合酶全酶識別并結(jié)合。其中，亞基在識別中起重要作用。因?yàn)闆]有亞基的核心酶只能隨機(jī)地結(jié)合在DNA上。－10區(qū)位于－10處的6核甘酸序列。RNA聚合酶松散結(jié)合到－35區(qū)后，沿著DNA移動(dòng)到－10區(qū)并解鏈，形成緊密結(jié)合的復(fù)合體，確保轉(zhuǎn)錄方向。保守序列TATAAT。簡述乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控模式。

乳糖操縱子中結(jié)構(gòu)基因包括LacZ、LacY、LacA，結(jié)構(gòu)基因前啟動(dòng)子P與操作子O相鄰。無誘導(dǎo)物時(shí)阻遏蛋白與O結(jié)合后阻止RNA聚合酶與P的結(jié)合，從而抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)有誘導(dǎo)物時(shí)，誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，改變阻遏蛋白的構(gòu)型使阻遏蛋白從O上解離，進(jìn)而使RNA聚合酶結(jié)合P，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。弱化作用如何調(diào)控E.coli中色氨酸操縱子的表達(dá)。

弱化作用是根據(jù)tRNATrp的數(shù)量去調(diào)節(jié)Trp操縱子的表達(dá)，而tRNATrp的數(shù)量又取決于細(xì)胞中Trp的水平。Trp操縱子mRNA前導(dǎo)序列很長，包括了編碼一個(gè)長14個(gè)氨基酸多肽所需的全部信息。這個(gè)多肽簡述乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)和調(diào)控過程。

三個(gè)乳糖的結(jié)構(gòu)基因，其中l(wèi)acZ編碼β-半乳糖苷酶，能催化β-半乳糖苷水解；lacY編碼β-半乳糖苷透性酶，將β-半乳糖苷轉(zhuǎn)入細(xì)胞；LacA編碼β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶。調(diào)控基因LacI基因表達(dá)產(chǎn)物稱為阻遏蛋白(Repressor)，它的功能是阻止結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。操縱基因（o）位于啟動(dòng)子(p)和結(jié)構(gòu)基因(lacZYA)之間。阻遏蛋白和操縱基因結(jié)合時(shí)，能阻止RNA聚合酶在啟動(dòng)子(p)上的轉(zhuǎn)錄。1）無誘導(dǎo)物（如乳糖）時(shí)，使乳糖操縱子處于失活狀態(tài)；2）加入誘導(dǎo)物（如乳糖）后，它與阻遏蛋白結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄乳糖代謝的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因lacZYA。簡述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其作用。

轉(zhuǎn)錄因子也稱轉(zhuǎn)錄激活因子，它們可對轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝及轉(zhuǎn)錄速率施加影響，決定某一基因是否表達(dá)，通常有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)，存在DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。DNA識別或結(jié)合域能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以在適當(dāng)?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在葡萄糖和半乳糖時(shí)，請說明大腸桿菌乳糖操縱子的基因表達(dá)情況。

三個(gè)乳糖的結(jié)構(gòu)基因，其中l(wèi)acZ編碼β-半乳糖苷酶，能催化β-半乳糖苷水解；lacY編碼β-半乳糖苷透性酶，將β-半乳糖苷轉(zhuǎn)入細(xì)胞；LacA編碼β-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶。調(diào)控基因LacI基因表達(dá)產(chǎn)物稱為阻遏蛋白(Repressor)，它的功能是阻止結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。操縱基因（o）位于啟動(dòng)子(p)和結(jié)構(gòu)基因(lacZYA)之間。阻遏蛋白和操縱基因結(jié)合時(shí)，能阻止RNA聚合酶在啟動(dòng)子(p)上的轉(zhuǎn)錄。1）當(dāng)大腸桿菌培養(yǎng)基同時(shí)存在葡萄糖和半乳糖時(shí)，大腸桿菌優(yōu)先利用葡萄糖，乳糖操縱子處于關(guān)閉狀態(tài)。直至培養(yǎng)基中的葡萄糖用完，乳糖操縱子的基因才開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)，利用乳糖。2）培養(yǎng)基中的葡萄糖用完后，半乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄乳糖代謝的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因lacZYA。反式作用因子有幾大類每一類的特征是什么

作為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)原件，增強(qiáng)在通常具有什么特征？在分離DNA過程中，為什么苯酚和氯仿聯(lián)合使用即使不聯(lián)合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次提示：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以單獨(dú)使用酚抽提DNA，最終不能除去酚，殘留的酚會使限制性核酸內(nèi)切酶、Taq酶和連接酶變性，影響后續(xù)試驗(yàn)。氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑，它不與水互溶，但它與苯酚互溶。這樣，兩者聯(lián)合使用，可讓DNA溶液中沒有殘留酚。比較說明SDS（SDS-聚丙烯胺凝膠電泳）與瓊脂糖凝膠電泳的分離原理和特點(diǎn)。

提示：SDS：1）SDS作用；2）分子篩；3）主要用于蛋白質(zhì)的定性分析、分離。瓊脂糖凝膠電泳：1）凝膠的孔徑；2）用于蛋白質(zhì)和核酸電泳，雙鏈DNA的電泳遷移率主要與其分子大小有關(guān)。簡述PCR擴(kuò)增的原理及過程。

提示：PCR技術(shù)的基本原理：在模板、引物、4種dNTP和賴耐熱DNA聚合酶存在的條件下，按照堿基互補(bǔ)配對的原則，特異擴(kuò)增DNA區(qū)段。PCR的過程：變性--退火--延伸，三個(gè)基本步驟循環(huán)。什么是藍(lán)白斑篩選為什么藍(lán)白斑篩選法也會有假陽性提示：該法是利用組織化學(xué)的方法，通過插入失活來篩選重組體。原因是：β-半乳糖苷酶的N端不是必須的，對其修飾不會影響酶的活性或α肽的互補(bǔ)性。如果插入的外源片斷引起α肽ORF的移碼，或外源片斷含有終止密碼使得α肽不表達(dá)，就會形成白色斑。如果插入的片斷不含終止密碼、是3的倍數(shù)，仍然會形成藍(lán)色斑。酵母單雜交的原理。

很多真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,BD）和轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD)。BD能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因的轉(zhuǎn)錄。

酵母單雜交是一種研究DNA和蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)，運(yùn)用基因重組技術(shù)將特定順式作用元件構(gòu)建到基本啟動(dòng)子上游，把報(bào)告基因連接到基本啟動(dòng)子下游。

將待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母激活域（AD）融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母，如果待測轉(zhuǎn)錄因子能和順式作用元件結(jié)合，就能激活基本啟動(dòng)子，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)。現(xiàn)已知一種蛋白因子可以與DNA上的一段100bp的專一序列結(jié)合，請?jiān)O(shè)計(jì)出克隆這種蛋白因子的cDNA的基本技術(shù)路線。

提示：酵母單雜方法。從GenBank中查到某一基因的cDNA序列，如何得到該基因的內(nèi)含子序列？

提示：根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板PCR，產(chǎn)物測序后，序列比對。從GenBank中查到某一基因的完整ORF序列，如何得知其mRNA的加帽和加尾信息

提示：5’-RACE和3’-RACE。轉(zhuǎn)錄因子一般具有轉(zhuǎn)錄激活域和DNA結(jié)合域，簡述它們的作用。

DNA識別或結(jié)合域能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因的轉(zhuǎn)錄。對各種轉(zhuǎn)錄因子的序列進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)其基序(motif)的共同點(diǎn)是都與DNA結(jié)合。基序通常很短，僅為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一小部分。在蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄裝置相互作用中，負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄的基序可以被鑒定出來。

轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可以在適當(dāng)?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄。簡述凝膠阻滯試驗(yàn)（EMSA）的原理。

EMSA是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)，用放射性同位素標(biāo)記待測DNA片段，然后與提取物溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳后用放射性自顯影技術(shù)可以確定DNA條帶的位置，從而確定它與蛋白質(zhì)是否結(jié)合。基本原理：

蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合后，將大大增加DNA分子量，在凝膠電泳中，DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其相對分子量成正比。沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA移動(dòng)較快，結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA由于受到阻滯移動(dòng)較慢。現(xiàn)在已知一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列（包括其順式作用元件和基本啟動(dòng)子），如何找到調(diào)控該基因表達(dá)的反式作用因子？

提示：有多種方案。EMSA是其一。簡述sangerDNA測序法的原理和基本過程。

雙脫氧測序法原理：2',3'-ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個(gè)羥基，可以在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。

核酸模板在核酸聚合酶、引物、4種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管獨(dú)立的酶反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。

如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個(gè)堿基)，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。基本過程：

1）分離待測核酸模板，模板可是DNA，也可是RNA，可是雙鏈，也可是單鏈。

2）在4只試管中分別加入適當(dāng)?shù)囊铩⒛０濉?種dNTP(包括放射性標(biāo)記dATP，例如32P標(biāo)記的dATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。

3）與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻入時(shí)，由于它在3’位置沒有羥基，故不與下一個(gè)dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長度的新的DNA鏈。

4）用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物，由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長度的DNA都終止于該種堿基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA3’末端都為同一種雙脫氧堿基。

5）放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。如何用PCR法獲得點(diǎn)突變DNA分子？

指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。

采用具有互補(bǔ)末端的引物，使產(chǎn)物形成了重疊鏈從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。該技術(shù)主要包括以下幾步：設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴(kuò)增全長基因。實(shí)驗(yàn)步驟：

1）引物設(shè)計(jì)：引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配，否則后續(xù)實(shí)驗(yàn)很難成功），突變點(diǎn)可以設(shè)計(jì)在Fm或Rm，也可以兩條引物上都有突變點(diǎn)；

2）分別用引物F和Rm及Fm和R進(jìn)行配對用pfu酶進(jìn)行PCR；

3）分別用膠準(zhǔn)確回收第2步所得兩條目的PCR產(chǎn)物帶；

4）將第3步所得兩份PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶進(jìn)行5-10輪PCR。

5）取第4步PCR產(chǎn)物做為模板，加入引物F及R進(jìn)行PCR擴(kuò)增出具有突變的全基因。什么是RNAi？試述其應(yīng)用和發(fā)展前景。

RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。或是RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。應(yīng)用：

1）RNAi方法在植物遺傳及發(fā)育等研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。通過基因敲除來調(diào)控某個(gè)代謝途徑的關(guān)鍵基因，篩選出目的性狀改良的個(gè)體，如抗病或耐旱植株。Gutterson等敲除了康乃馨的一種激素，使花期延長。多聚半乳糖醛激酶在西紅柿成熟時(shí)消化細(xì)胞壁，Zenera實(shí)驗(yàn)室將它敲除后，西紅柿可晚一些采摘，味道變得更為鮮美。

2）RNAi是研究候選基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新方法。從大規(guī)模數(shù)據(jù)庫中獲得全基因組序列，找到感興趣基因的序列，據(jù)此設(shè)計(jì)出使該基因沉默的dsRNA，研究該候選基因沉默或下調(diào)后的性狀表現(xiàn)，從而探討該候選基因的功能。Clemens等應(yīng)用RNAi亦研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。獲得一個(gè)功能未知的基因克隆后，怎樣才能闡述該基因的功能？

提示：對此基因進(jìn)行定位，運(yùn)用基因敲除或RNAi技術(shù)封閉此基因，尋找蛋白表達(dá)的差異和生物體遺傳表型的差異，通過研究熒光探針定位此蛋白的分布，通過研究蛋白與蛋白相互作用確定其在細(xì)胞中的功能。如果知道某基因的功能及其相應(yīng)得蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因？

提示：可以通過合成核苷酸探針或設(shè)計(jì)兼并PCR引物從基因組文庫（或cDNA）文庫中篩選。或者利用相應(yīng)的抗體從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)的克隆。常用的基因表達(dá)研究技術(shù)有哪些？

什么是遺傳圖譜？

答案1：遺傳圖又稱為連鎖圖，是指標(biāo)志基因或DNA在染色體上的相對位置與遺傳距離，后者通常以基因或DNA片段在染色體交換過程中的分離頻率（厘摩，cM）來表示，cM值越大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。遺傳圖的繪制方法是以染色體上某一點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，以與之相伴的遺傳特征為對象，經(jīng)連鎖分析，測定遺傳距離，將編碼該特征的基因定位于染色體特定位置。連鎖分析的實(shí)質(zhì)是通過分析同一遺傳位點(diǎn)在不同個(gè)體中等位基因的不同來研究同一染色體上兩個(gè)位點(diǎn)之間的相互關(guān)系，科學(xué)上用減數(shù)分裂過程中這兩個(gè)位點(diǎn)之間的交換或重組頻率來表示其遺傳學(xué)距離。

答案2：通過遺傳重組所得到的基因在具體染色體上線性排列圖稱為遺傳連鎖圖。它是通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定他們的相對距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。繪制遺傳連鎖圖的方法有很多，但是在DNA多態(tài)性技術(shù)未開發(fā)時(shí)，鑒定的連鎖圖很少，隨著DNA多態(tài)性的開發(fā)，使得可利用的遺傳標(biāo)志數(shù)目迅速擴(kuò)增。早期使用的多態(tài)性標(biāo)志有RFLP(限制性酶切片段長度多態(tài)性)、RAPD(隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)；80年代后出現(xiàn)的有STR(短串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星)DNA遺傳多態(tài)性分析和90年代發(fā)展的SNP（單個(gè)核苷酸的多態(tài)性）分析。什么是物理圖譜？

答案1：物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽