基因工程第一節：DNA重組技術的基本工具

浚縣一中劉秀榮基因工程據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人

中國衛生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告傳染病死亡數之首。發病死亡率近100%.能產生狂犬病抗體蛋白的轉基因植物據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件基因工程的概念

基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人類需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫DNA重組技術。基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴基因工程的別名DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→表達結果人類需要的基因產物或性狀概念分析：基因工程的別名DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？重組DNA導入形成基因工程培育抗蟲棉的簡要過程普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因棉花細胞(含基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：形成重組DNA關鍵步驟三：重組DNA導入受體(棉花)細胞基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢1.1DNA重組技術的基本工具關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：形成重組DNA關鍵步驟三：重組DNA導入受體(棉花)細胞“分子手術刀”——

限制性核酸內切酶“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運輸車”——

基因進入受體細胞的載體1.1DNA重組技術的基本工具關鍵步驟一：抗蟲基因從“分子手術刀”——

限制性核酸內切酶⒈主要來源：2.種類與命名：3.作用：4.作用結果：主要是從原核生物中分離純化出來的一類酶。約4000種識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵。形成粘性末端或平末端“分子手術刀”——限制性核酸內切酶⒈主要來源：2.種類與命尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。goback尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

現在已經從約300種微生物中分離出約4000種限制性內切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質沙雷氏桿菌（Serratia

marcesens）大腸桿菌（Escherichia

coli

R）練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ現在已經從約300種微生物中分離出約4000限制酶的識別序列：能被限制性內切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。限制酶的識別序列：能被限制性內切酶特異性識別的切割部位都具有選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件限制性核酸內切酶作用的是DNA分子中的什么鍵？磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷酸之間的連接ATGGCATCTTCGAAGP

AP限制性核酸內切酶作用的是DNA分子中的什么鍵？磷酸二酯鍵ATAGGobackAGGoback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端限制酶DNA解旋酶區別限制酶與DNA解旋酶的區別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區別限制酶與DNA水解酶的區別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.（雙鏈）切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。限制酶DNA解旋酶區別限制酶與DNA解旋酶的區別切割特定的核目的基因所在DNA片段載體DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶目的基因所在DNA片段載體DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDN1.作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA.2.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成3.種類：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶“分子縫合針”——DNA連接酶1.作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DN

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliD

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位相同點雙鏈單鏈在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵二者都是蛋白質類化合物DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位雙鏈單鏈在兩DN嘗試寫出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT嘗試寫出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCA“分子運輸車”——

基因進入受體細胞的載體1.作用：2.條件：3.種類：質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。將外源基因送入受體細胞。“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體1.作用：2.條件⑴有1~多個限制酶切點⑵對受體細胞無害⑶使導入基因能在受體細胞中復制、表達⑷有某些標記基因，便于篩選⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物能有預想的效果嗎？⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點將會怎樣？⑵霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發現？

作為載體的必要條件:Goback⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物質粒的特點：是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA分子外并能自我復制的小型雙鏈環狀DNA分子。質粒的特點：是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA分子能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在，將來可用含青霉素的培養基鑒別。能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶載體具備的條件質粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒種類能自我復制有一個或多個酶切割位點有標記基因對受體細胞無害基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯鍵種類思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒（plasmid），即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P73、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。3）載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。5）載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？

迄今為止，所發現的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現在還不清楚，也許將來會發現可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P74、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？迄今為1)不屬于質粒被選為基因運載體的理由是

A、能復制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標記基因

D、它是環狀DNAD練習1)不屬于質粒被選為基因運載體的理由是D練習2）有關基因工程的敘述中，正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質粒是基因工程中唯一的載體

C、載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與目的基因連接

D、DNA連接酶使黏性末端的堿基之間形成氫鍵C練習2）有關基因工程的敘述中，正確的是（）C練習3）同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A3）同一種限制酶切割成的黏性末端是A.①②（10江蘇卷）4.下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖l、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（10江蘇卷）4.下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點（1）一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有▲個游離的磷酸基團。（2）若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩定性越▲。

（1）0、2（2）高（1）一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是▲。（4）與只使用EcoRI相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點在于可以防止▲。

（3）SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用Sma（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入▲酶。（6）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了▲。（5）DNA連接（6）鑒別和篩選含有目的基因的細胞（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并基因工程第一節：DNA重組技術的基本工具

浚縣一中劉秀榮基因工程據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人

中國衛生部通報：2004年７月，狂犬病列法定報告傳染病死亡數之首。發病死亡率近100%.能產生狂犬病抗體蛋白的轉基因植物據WTO調查：2004年全世界因狂犬病致死人數約5.5萬人選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件基因工程的概念

基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人類需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫DNA重組技術。基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴基因工程的別名DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→表達結果人類需要的基因產物或性狀概念分析：基因工程的別名DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？重組DNA導入形成基因工程培育抗蟲棉的簡要過程普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因棉花細胞(含基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：形成重組DNA關鍵步驟三：重組DNA導入受體(棉花)細胞基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢1.1DNA重組技術的基本工具關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內提取出來關鍵步驟二：形成重組DNA關鍵步驟三：重組DNA導入受體(棉花)細胞“分子手術刀”——

限制性核酸內切酶“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運輸車”——

基因進入受體細胞的載體1.1DNA重組技術的基本工具關鍵步驟一：抗蟲基因從“分子手術刀”——

限制性核酸內切酶⒈主要來源：2.種類與命名：3.作用：4.作用結果：主要是從原核生物中分離純化出來的一類酶。約4000種識別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵。形成粘性末端或平末端“分子手術刀”——限制性核酸內切酶⒈主要來源：2.種類與命尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。goback尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

現在已經從約300種微生物中分離出約4000種限制性內切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質沙雷氏桿菌（Serratia

marcesens）大腸桿菌（Escherichia

coli

R）練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ現在已經從約300種微生物中分離出約4000限制酶的識別序列：能被限制性內切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。限制酶的識別序列：能被限制性內切酶特異性識別的切割部位都具有選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件限制性核酸內切酶作用的是DNA分子中的什么鍵？磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷酸之間的連接ATGGCATCTTCGAAGP

AP限制性核酸內切酶作用的是DNA分子中的什么鍵？磷酸二酯鍵ATAGGobackAGGoback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切開的DNA兩條單鏈SmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端限制酶DNA解旋酶區別限制酶與DNA解旋酶的區別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區別限制酶與DNA水解酶的區別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.（雙鏈）切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。限制酶DNA解旋酶區別限制酶與DNA解旋酶的區別切割特定的核目的基因所在DNA片段載體DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶目的基因所在DNA片段載體DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDN1.作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA.2.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成3.種類：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶“分子縫合針”——DNA連接酶1.作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DN

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliD

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位相同點雙鏈單鏈在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵二者都是蛋白質類化合物DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位雙鏈單鏈在兩DN嘗試寫出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT嘗試寫出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCA“分子運輸車”——

基因進入受體細胞的載體1.作用：2.條件：3.種類：質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒等。將外源基因送入受體細胞。“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體1.作用：2.條件⑴有1~多個限制酶切點⑵對受體細胞無害⑶使導入基因能在受體細胞中復制、表達⑷有某些標記基因，便于篩選⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物能有預想的效果嗎？⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點將會怎樣？⑵霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發現？

作為載體的必要條件:Goback⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制或不能轉錄，轉基因生物質粒的特點：是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA分子外并能自我復制的小型雙鏈環狀DNA分子。質粒的特點：是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌擬核DNA分子能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在，將來可用含青霉素的培養基鑒別。能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在選修3-1-1DNA重組技術的基本工具課件基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶載體具備的條件質粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒種類能自我復制有一個或多個酶切割位點有標記基因對受體細胞無害基因工程限制酶主要存在于原核生物中DNA連連接磷酸二酯鍵種類思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒（plasmid），即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P73、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。3）載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。5）載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？

迄今為止，所發現的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現在還不清楚，也許將