目的基因的獲得課件目的基因的獲得課件basicprocessofDNArecombinationinvitro

體外DNA重組的基本步驟2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷連接到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（如：抗菌素抗性標(biāo)記）的載體分子上（DNA重組過程，需要各種工具酶的參與）3.重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定：篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物*1.目的基因的獲得：從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過PCR擴(kuò)增或基因組文庫篩選、cDNA文庫篩選等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。

2basicprocessofDNArecombinacontents化學(xué)合成法直接分離法構(gòu)建文庫分離法聚合酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)(PCR)法contents化學(xué)合成法直接分離法構(gòu)建文庫分離法聚合酶鏈?zhǔn)?化學(xué)合成法要求：1、目的基因序列已知2、適合分子量較小的DNA片段的制備，如引物、DNA探針、接頭（adaptor）、銜接物（linker）等。DNA合成儀1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。EcoRIEcoRILinkerAdaptor1化學(xué)合成法要求：1、目的基因序列已知DNA合成儀19762直接分離法限制性內(nèi)切酶法：用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。（適合于從簡單的基因組中分離目的基因,如質(zhì)粒或病毒。由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。但目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也片段化）隨機(jī)片段化：

內(nèi)切酶部分酶切

機(jī)械切割法：超聲波、高速攪拌物理化學(xué)法：密度梯度離心法（如果不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，采用相應(yīng)的方法即可達(dá)到從生物基因組中分離目的基因的目的。）2直接分離法限制性內(nèi)切酶法：用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切3構(gòu)建文庫分離法3.1構(gòu)建基因組文庫分離目的基因3.2構(gòu)建cDNA文庫分離目的基因3構(gòu)建文庫分離法3.1構(gòu)建基因組文庫分離目的基因3.23.1構(gòu)建基因組文庫分離目的基因Genomiclibraries：acollectionofclones,representativeoftheentirestartingpopulation概念：某種生物的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片段，并將所有這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中儲(chǔ)存和擴(kuò)增。理論上這些重組載體就帶有該生物體的全部基因。因此將這個(gè)宿主細(xì)胞的群體稱為該為該生物體的基因組文庫。構(gòu)建時(shí)遺傳信息供體是基因組DNA，因而無發(fā)育時(shí)期及組織器官特異性；一個(gè)完全的基因組文庫中包含著基因組DNA上的所有編碼區(qū)及非編碼區(qū)序列的克隆。生物體的每一個(gè)基因在文庫中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，所以基因組文庫可真實(shí)地顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息。*3.1構(gòu)建基因組文庫分離目的基因Genomiclibra基因組文庫的大小一個(gè)理想的基因組文庫，要包含完整基因組的所有DNA序列理論上的克隆子數(shù)目＝基因組DNA總長度/DNA插入片段的平均長度實(shí)際的克隆子數(shù)目：大于理論888基因組文庫的大小一個(gè)理想的基因組文庫，要包含完整基因組的所有載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，構(gòu)建文庫所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。目前常用的載體

載體系列：

容量為

36.4~51kpcosmid載體：

容量為

45kbYAC：

容量為230kb-1700kbBAC:容量為

300kb載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需101010121212Processconstructingagenemiclibrary

（基因組文庫的構(gòu)建流程）①物理切割法：超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。酶切法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化。可得到10-30kb的隨機(jī)片段。111111（1）基因組DNA大片段的制備*靶DNA未測序或未定位時(shí)，可通過基因組文庫篩選靶DNA。Processconstructingagenemic（2）載體分別與得到的基因組DNA大片段進(jìn)行連接①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。②人工接頭法（adapter或linker）給DNA片段加上人工合成的linker或者adaptor，方便連接。接上人工接頭（2）載體分別與得到的基因組DNA大片段進(jìn)行連接①粘性末粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶③同聚物加尾給DNA片段加上同聚物的尾巴，方便DNA片段的連接粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶③同聚物加尾給DNA片段加上同（3）重組載體各自轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到基因組文庫（4）篩選重組子形成一個(gè)含有所有片段的菌群，這個(gè)菌群就是一個(gè)基因組文庫（3）重組載體各自轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到基因組文庫（4151515采用λ噬菌體載體進(jìn)行基因組文庫的構(gòu)建示意圖Sau3AI和BamHI是同尾酶。171717采用λ噬菌體載體進(jìn)行基因組文庫的構(gòu)建示意圖SauInplaceofphage-λderivatives,anumberofhigher-capacitycloningvectorssuchascosmids,BACs,PACsandYACsareavailablefortheconstructionofgenomiclibraries.Theadvantageofsuchvectorsisthattheaverageinsertsizeismuchlargerthanforλreplacementvectors.Butsuchlibrariesaregenerallymoredifficulttoprepare,andthelargerinsertscanbelessthanstraightforwardtoworkwith.除了λ噬菌體衍生載體之外，還有其他許多的高容量克隆載體（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因組文庫的構(gòu)建。這些載體的優(yōu)點(diǎn)是平均插入片段的大小遠(yuǎn)大于λ置換載體，但文庫較難制備，插入片段較大，不容易直接操作。161616Inplaceofphage-λderivative3.2構(gòu)建cDNA文庫分離目的基因mRNAcDNA反/逆轉(zhuǎn)錄DNA轉(zhuǎn)錄AcDNAlibraryisprepared

byreverse-transcribingapopulationofmRNAsand

thenscreenedforparticularclones.概念：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與載體重組，貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為cDNA文庫。*mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物cDNA：以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。3.2構(gòu)建cDNA文庫分離目的基因mRNAcDNA反/逆轉(zhuǎn)CharacterofcDNA

library

（cDNA文庫的特點(diǎn)）以mRNA為材料，反映的是該生物特定發(fā)育時(shí)期、特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況，有一定的時(shí)效性；包含所有編碼蛋白質(zhì)的基因（只與編碼序列有關(guān)，因此不能反映內(nèi)含子、啟動(dòng)子、終止子以及與核糖體識(shí)別等的序列的結(jié)構(gòu)和功能特征）可在原核生物中直接表達(dá)比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建，文庫的篩選比較簡單易行；181818*CharacterofcDNAlibrary

（cDNProcessconstructingacDNAlibrary

（cDNA文庫的構(gòu)建流程）191919*1：提取總RNA2：分離mRNA提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。通常分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。

ProcessconstructingacDNAli202020HowtoisolatemRNA？利用mRNA都含有一段polyA尾巴的特點(diǎn)，采用親和層析柱（oligodT纖維柱）將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。合成12－20個(gè)dT組成oligo（dT）作為引物與mRNApoly（A）尾巴雜交，用反轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)可合成cDNA第一鏈。222222HowtoisolatemRNA？利用mR3：cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成cDNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。

5’

反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物3：cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為2222cDNA克隆中使用的反轉(zhuǎn)錄酶AMV：來源于禽類的成髓細(xì)胞瘤病毒MMLV：大腸桿菌中克隆的莫羅尼氏鼠白血病病毒NativeenzymeshavepoorprocessivityandintrinsicRNaseactivity,whichleadstodegradationoftheRNAtemplate.天然來源的酶缺乏持續(xù)合成能力，但具有內(nèi)在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生產(chǎn)全長的cDNAThenativeenzymesfunctionoptimallyat37℃andthereforetendtostallatsequencesthatarerichinsecondarystructure,asoftenfoundin5’and3’untranslatedregions.(天然來源的酶，發(fā)揮功能的最適溫度是37℃，且通常會(huì)在富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列出轉(zhuǎn)錄終止——這些結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)在5端或3端的非翻譯區(qū)（這樣就不容易形成全長cDNA）)*2424cDNA克隆中使用的反轉(zhuǎn)錄酶AMV：來源于禽類的成髓2323現(xiàn)在常用的酶：天然的酶改造過以利于生產(chǎn)全長cDNASeveralcompaniesproduceengineeredmurinereversetranscriptasesthatlackRNaseHactivity,andthesearemoreef?cientintheproductionoffull-lengthcDNAs.（現(xiàn)在常用突變了的反轉(zhuǎn)錄酶（老鼠病毒來源的），它們?nèi)狈NaseH活性，因此更有利于生產(chǎn)全長cDNA）AnexampleistheenzymeSuper-ScriptII,marketedbyLifeTechnologies(Kotewiczetal.1988).Thisenzymecanalsocarryoutreversetranscriptionattemperaturesofupto50℃.(如：LifeTechnologies公司生產(chǎn)的改造后的Super-ScriptII可以在50℃下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。)2525現(xiàn)在常用的酶：天然的酶改造過以利于生產(chǎn)全長cDNAS用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物②

降解mRNA模板mRNAcDNA第一鏈3’

3’

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5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物或RNaseH堿用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRcDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。③cDNA第二鏈合成cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶剩下的cD核酸酶S1cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

核酸酶S1cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’④去掉發(fā)卡目的基因的獲得課件DevelopmentofcDNAcloningstrategiesAnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.(早期的策略：發(fā)卡方法：引導(dǎo)cDNA第二鏈的合成)282828ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.(改進(jìn)的策略：寡聚加帽法：對cDNA第一鏈同聚物加尾后，設(shè)計(jì)相對應(yīng)的引物合成cDNA第二鏈)*DevelopmentofcDNAclonings早期cDNA策略292929mRNA的分離Oligo(dT)引物與mRNA退火，cDNA第一鏈合成降解mRNA模板，cDNA3’末端形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)以發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物，合成cDNA第二鏈用S1核酸酶去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：S1核酸酶的作用，會(huì)使cDNA5’端的序列部分丟失早期cDNA策略313131mRNA的分離Oligo(dT)3030301976年，發(fā)卡方法：用發(fā)夾法獲得cDNA第二鏈。然后將cDNA雙鏈與載體各自用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行同聚物加尾后，再連接形成重組載體。發(fā)卡法的嚴(yán)重缺陷：S1核酸酶的切割會(huì)使克隆的5’端某些序列丟失。因此后來對cDNA的合成方法加以改進(jìn)。3232321976年，發(fā)卡方法：用發(fā)夾法獲得cDNA第二鏈313131改進(jìn)的cDNA克隆策略oligoT引物在mRNA多腺苷酸尾部退火cDNA第一鏈的合成在cDNA第一鏈的末端(3’端)進(jìn)行同聚物加尾，加上oligo(dC)

末端轉(zhuǎn)移酶合成相應(yīng)的寡oligo(dG)引物引導(dǎo)第二條cDNA的合成333333改進(jìn)的cDNA克隆策略oligoT引物在mRN