1、項目名稱：動脈粥樣硬硬化發病病機制及及其診治治與干預預的基礎礎研究首席科學家家：劉德培 中中國醫學學科學院院基礎醫醫學研究究所起止年限：2011.1至220155.8依托部門：衛生部二、預期目目標總體目標：本項目旨在在從我國國AS人人群特有有的遺傳傳背景及及分析致致病的內內外環境境危險因因素為切切入點，結結合系統統生物醫醫學觀念念和手段段,針對對在ASS發生中中起重要要作用的的內外環環境中有有利和不不利因素素，闡述述AS發發生、發發展和轉轉歸的規規律,揭揭示血管管重塑和和AS斑斑塊不穩穩定的機機理,結結合臨床床研究為為制定適適合我國國國情的的針對AAS及其其并發癥癥的早期期預警和和早期干干預策

2、略略及防治治方案提提供新的的思路和和科學依依據，積積極推進進臨床轉轉化。五年預期目目標：闡明能量限限制和特特殊飲食食，脂質質代謝紊紊亂和含含硫氨基基酸家族族等因素素影響AAS發病病的細胞胞分子機機制；初初步闡明明血管重重塑和動動脈粥樣樣硬化斑斑塊不穩穩定的影影響因素素及分子子機制。尋找出1-2個可可用于AAS新的的早期預預警分子子，并建建立其檢檢測方法法和預警警指標確定355種新的的抗ASS靶點分分子，明明確其功功能及臨臨床意義義。培養博士生生80名名，碩士士生600名。培培養優秀秀中青年年人才，產產生杰出出青年與與長江學學者,建建設一支支優秀的的轉化醫醫學研究究人才梯梯隊。申請一批發發明專利

3、利，促進進開發有有自主知知識產權權的成果果轉化。本項目實施施中取得得的基礎礎性研究究成果將將在國際際刊物上上發表影影響因子子（IFF）5.0有代代表性學學術論文文60篇，其其中IFF100的論文文15篇篇，頂級級雜志論論文2-5篇。三、研究方方案本課題項目目分為六六個部分分，第一一部分開開展中國國人群AAS疾病病分子遺遺傳基礎礎;第二二部分緊緊密聯系系內外環環境因素素中限制制能量飲飲食和特特殊飲食食，研究究有利和和不利因因素和機機體相互互作用在在AS發病病中的機機制;第第三部分分闡明脂脂代謝紊紊亂，尤尤其是TTG和HHDL代代謝紊亂亂導致AAS的分分子機制制;第四四部分闡闡述含硫硫氨基酸酸家族

4、特別別是Hccy與 H2SS在ASS發生和和發展中中炎癥和和免疫作作用及其其分子機機制；第第五部分分針對血血管重塑塑是ASS管腔狹狹窄的關關鍵因素素，研究究影響血血管重塑塑的因素素和作用用的分子子機制；第六部部分針對對AS斑塊塊不穩定定及早期期防治，研研究斑塊塊從不穩穩定向穩穩定的方向轉轉變的分分子機制制和干預預策略。這這六個部部分結合合系統生生物醫學學觀念和和手段，從臨床床提出科科學問題題，圍繞繞著ASS的發生生發展和和轉歸的的分子調調控機制制和早期期干預這這個科學學核心進進行研究究，尋找找AS早期期預警分分子，并并建立其其檢測方方法和預預警指標標,確定定抗ASS新靶點點分子,探討防防治AS

5、S的有效效方法和和降低心心腦血管疾疾病發病病率和死死亡率的的途徑。動脈粥樣硬化發病機制及其診治與干預的基礎研究動脈粥樣硬化發病機制及其診治與干預的基礎研究第一部分 中國人人動脈粥粥樣硬化化遺傳分分子基礎礎學術思路與與技術途途徑：1.結合中中國人群群心肌梗梗死GWWAS和和國外人人群的研研究結果果，同時選擇擇炎癥、脂脂代謝以以及血壓壓調控通通路相關關基因，在10000例急性冠脈綜合征病例對照樣本中篩查AS新的基因和遺傳變異。2.采用臨臨床技術術手段測測定頸動動脈內膜膜中膜厚厚度、脈脈搏波速速度等AAS亞臨臨床表型型和多種種生物標標記物，綜綜合評價價遺傳因因素與AAS發生生/發展展、以及及斑塊穩穩

6、定性的的關系。3.探討重重要多態態對易感感基因轉轉錄活性性的調控控作用，尋尋找與多多態可能能結合的的轉錄因因子，進進而研究究多態對對易感基基因所在在信號通通路的調調控作用用及細胞胞生理活活性改變變。應用用miccroRRNA技技術，確確定斑塊塊發生發發展過程程中炎癥癥反應系系統表達達譜，研研究炎癥癥在冠狀狀AS斑塊塊發生發發展過程程中的作作用及機機制；并并利用動動物模型型尋找冠冠狀ASS疾病新新的遺傳傳易感基基因。4.對20000例例社區高高危人群群進行前前瞻性隨隨訪，動動態監測測AS相關關生理指指標的變變化和AAS的進進展情況況。評價價遺傳位位點及其其聯合作作用與AAS指標標間的關關系，計計

7、算人群群歸因危危險度，構建遺傳因素及環境危險因素的預測模型。亞臨床指標：頸動脈IMT、PWV等亞臨床指標：頸動脈IMT、PWV等SNPs、CNVs及單體型血脂代謝、炎癥反應、血壓相關通路基因AS斑塊鈣化及穩定性評價確定遺傳變異位點中國人群GWAS研究數據的深入挖掘人體測量、血脂、生物標記物檢測2000例社區高危人群10000病例對照人群驗證歐美人群GWAS報道的AS相關位點高危人群隨訪，構建預測模型功能研究揭示遺傳分子機制研究特色與與創新：結合中國人人群GWWAS研研究中2200萬萬個遺傳傳變異信信息以及及多個代代謝通路路基因網網絡，基基于通路路和遺傳傳網絡系系統分析析SNPPs、CNVVs和

8、單體體型變異異信息，采采用CAART、MARRS、MDRR、貝葉葉斯網絡絡、隨機機森林等等數學模模型，構構建遺傳傳因素及及環境危危險因素素的預測測模型，找找到檢查查、定量量臨床疾疾病亞型型的干預預靶點，監監測疾病病進展，確確定高危危患者，最最終實現現定量風風險評估估和個性性化早期期預警。可行性分析析：目前收集了了高質量量的2000000例冠狀狀動脈綜綜合征、冠冠心病和和心肌梗梗死的病病例對照照資料，為為開展大規規模重復復驗證奠奠定了基基礎。完完成了330余個個基因與與冠心病病和腦卒卒中的關關聯和功功能研究究，發現現了數個個在國人人冠心病病和腦卒卒中發病病中具有有重要作作用的SSNPss及單體體

9、型。已已經應用用Afffymeetriix5000K芯芯片完成成了15500例例心梗病病例對照照的全基基因組關關聯研究究，在此此基礎上上進行了了impputaatioon，獲獲得2000萬個個遺傳變變異信息息，并發發現一系系列顯著著關聯位位點和區區域。應應用CAART和和MARRS模型型開展了了相關代謝謝通路中中11個個候選基基因的333個SSNPss的多基基因統計計分析，發發現SNNPs位點間間的交互互作用在在高血壓壓發生中中具有重重要作用用（Hyyperrtennsioon 220066，47：11447-554）。在易感基因功能研究方面，具備分子生物學、真核基因表達調控的研究梯隊，并已開

10、始進行心血管疾病易感基因/多態的功能研究。第二部分內內外環境境因素影影響動脈脈粥樣硬硬化發生生發展的的分子機機制學術思路與與技術途途徑：1.首先構構建ASS的誘導導模型，引引進AppoE-/-鼠鼠或LDDLR -/-鼠并給給與高脂脂飲食飼飼養誘導導AS模模型。給給與辣椒椒素及黃黃酮類物物質喂食食，分離離動脈，油油紅O染染色觀察察斑塊面面積大小小。觀察察對于斑斑塊形成成和面積積大小是是否有影影響。轉轉錄組學學發現辣辣椒素和和黃酮類類物質影影響ASS發生發發展過程程相關的的信號途途徑和分分子。對對于能量量限制，由由于小鼠鼠體內致致AS必必需要高高脂飲食食，無法法直接觀觀察能量量限制對對于ASS的影

11、響響，因此此我們在在體內和和細胞水水平進行行能量限限制，通通過轉錄錄組學發發現能量量限制影影響到的的基因，對對該基因因進行深深入研究究。2.對找到到的分子子，進行行體內和和體外實實驗闡明明其功能能。在細細胞水平平，我們們通過過過表達，干干擾以及及分子的的激活劑劑和抑制制劑處理理觀察對對于不同同細胞功功能的影影響，如如對內皮皮細胞的的衰老，對對平滑肌肌細胞的的增殖和和遷移，對對巨噬細細胞的吞吞噬功能能的影響響；在動動物水平平，我們們構建轉轉基因和和基因敲敲除動物物，并與與ApooE-/-鼠雜雜交，同同時給予予高脂飲飲食，最最后觀察察對于斑斑塊的形形成及面面積大小小有無影影響。3.對于這這些分子子

12、的起作作用的機機制，我我們利用用蛋白質質相互作作用的技技術方法法找到這這些分子子的相互互作用蛋蛋白，闡闡明信號號通路；并通過過基因表表達調控控的方法法和技術術，闡明明對于下下游基因因表達和和調控的的影響。通通過明確確信號通通路和下下游基因因構建小小范圍的的相互作作用圖譜譜。4對于研研究中發發現起作作用的關關鍵分子子，探討討其作為為診防治治靶點的的可能性性。獲取取臨床標標本，觀觀察ASS發病與與關鍵分分子的RRNA、蛋蛋白表達達水平是是否存在在相關性性；分析析關鍵分分子的激激活劑或或抑制劑劑是否抑抑制或促促進ASS的發生生發展。明明確該分分子是否否可作為為AS診診防治的的靶點。血管功能與AS斑塊

13、血管功能與AS斑塊分析轉基因/基因敲除等動物實驗過表達或干擾等分子生物學技術信號通路與細胞功能變化提供診、防、治靶點與措施基因表達譜改變，蛋白質組學變化AS關鍵調控分子構建分子作用小網絡組蛋白修飾，DNA甲基化等表觀遺傳學變化能量限制及辣椒素，黃酮等類物質的特殊飲食研究特色與與創新：1.本研究究從能量量限制這這個新視視角探討討AS的發發病機制制，具有很很強的原原創性和和新穎性性。2.提出辣辣椒素等等特殊飲飲食對于于AS發病病的影響響。將外外源性環環境因素素與其內內源性作作用靶點點聯系起起來，探探討動脈脈粥樣發發病的分分子機制制。可行性分析析：課題組長期期從事AAS的研研究，對對于內外外環境因因

14、素影響響AS的的發病及及其機制制的研究究具有較較好的實實驗基礎礎。前期期已系統統研究了了一些特特殊飲食食的作用用及靶點點和能量量限制的的相關分分子，建建立了各各種血管管細胞的的原代培培養模型型和多種種檢測細細胞功能能的方法法；擁有有成熟的的分析基基因表達達調控和和信號傳傳導以及及表觀遺遺傳調控控的分子子生物學學方法。有有轉基因因動物構構建技術術和平臺臺，并有有辣椒素素靶點TTRPVV1敲除除鼠及能能量限制制相關分分子Siirtuuinss基因家家族的轉轉基因動動物、組組織特異異性轉基基因動物物和基因因敲除動動物。第三部分 脂代謝謝紊亂導導致動脈脈粥樣硬硬化發病病的分子子機制學術思路與與技術途途

15、徑：體外研究：1.原原代培養養血管內內皮細胞胞、平滑滑肌細胞胞和巨噬噬細胞，與與不同類類型富含含TG脂脂蛋白以以及III型糖尿尿病患者者HDLL共培養養，用氧氧化應激激和炎癥癥通路相相關因子子矩陣PPCR和和蛋白組組學方法法，確認認特異性性的氧化化應激途途徑；明明確促進進內皮環環氧合酶酶2（CCOX22）活性和和表達的的分子機機制；22.應用用RNAA干擾、特特異性抗抗體和特特異性激激動和阻阻斷劑，對對脂質沉沉積、細細胞活化化、增殖殖和凋亡亡等ASS病變以以及COOX2表表達等細細胞生物物學終點點進行干干預分析析；3.免疫共共沉淀法法確認與與清道夫夫受體AA（SRR-A）胞胞漿域特特異結合合的

16、分子子，并通通過篩選選噬菌體體肽庫釣釣取與胞胞漿區特特異性結結合的多多肽，進進一步對對這些分分子和多多肽進行行抗ASS功能分分析。體內研究：1.制制備ASS易感的的高TGG小鼠模模型，喂喂飼高脂脂食物以以及損傷傷其動脈脈壁加速速AS形成成，檢測測動脈、心心臟和肝肝臟的基基因組、蛋蛋白組和和代謝組組學的改改變，并并分析這這些組織織的氧化化應激、炎炎癥以及及脂代謝謝通路中中相應的的改變，并并用其他他動物模模型進一一步驗證證。2.在此基基礎上選選擇數個個干預靶靶點進行行實驗性性治療。同同時尋找找對高TTG所致致AS有預預測性的的生物標標識物，并并在相應應的臨床床病人中中進行驗驗證。33.制備備干擾S

17、SR-AA胞漿結結合域功功能的轉轉基因小小鼠模型型，以驗驗證在體體內是否否能夠減減緩ASS的形成成。并應應用從多多肽庫篩篩選得到到的干擾擾SR-A胞漿漿結合域域的多肽肽進行實實驗性治治療，為為臨床防防治ASS提供新新的措施施。血管壁、心臟和肝臟的基因組、蛋白組及代謝組學分析氧化應激和炎癥通路矩陣PCR和蛋白組學確認靶分子；結合分子對體外實驗確認的靶點實驗性治療RNAi、抗體、抑制劑拮抗驗證激活、增值、脂質沉積、COX2表達；SR-A血管壁、心臟和肝臟的基因組、蛋白組及代謝組學分析氧化應激和炎癥通路矩陣PCR和蛋白組學確認靶分子；結合分子對體外實驗確認的靶點實驗性治療RNAi、抗體、抑制劑拮抗驗

18、證激活、增值、脂質沉積、COX2表達；SR-A胞漿域結合分子原代血管內皮、平滑肌、巨噬細胞，表達SR-A的293細胞高脂食物誘導和動脈壁球囊損傷（體內研究方案富含TG脂蛋白、II型糖尿病患者HDLAS易感的ApoCIII轉基因和LPL缺陷高TG動物模型不同類型的AS病變形成，心、肝其它器官的血管病變體外研究方案對比 分析析闡明高TG導致AS的新通路闡明高TG導致AS的新通路確定新的抗AS靶點提出早期干預AS的新措施研究創新性性：高甘油三酯酯血癥可可通過氧氧化應激激導致AAS形成成；證明明清道夫夫受體AA的胞漿漿域在AAS發生生中起關關鍵作用用；發現現HDLL具有調調節內皮皮細胞環環氧化酶酶1的

19、新新功能。應應用系統統生物學學手段對對這些新新發現進進行從分分子、細細胞到整整體水平平進行深深入探索索，從而而提出新新的假說說和理論論。可行性分析析：圍繞本課題題的設置置，已經經建立了了多項實實驗技術術，并取取得了較較多相關關的預實實驗結果果，包括括：1)發現了了富含TTG脂蛋蛋白攜帶帶大量的的脂質過過氧化產產物，并并通過氧氧化應激激反應引引起內皮皮細胞的的活化，有有可能成成為ASS形成的的始動因因素；22)通過對對巨噬細細胞中的的清道夫夫受體SSRA11胞漿域域的相互互作用研研究，發發現了具具有結合合胞漿域域功能并并干擾氧氧化LDDL內吞吞作用的的基因GGRP778。據據此合成成的多肽肽H1

20、11可以減減少巨噬噬細胞中中脂質的的沉積。33)通過對對化合物物庫的篩篩選，發發現了一一種化合合物GYYY41137可可顯著減減少AppoE基基因敲除除小鼠的的AS面面積，并并改善主主動脈舒舒張功能能；對血血漿膽固固醇和HHDL沒沒有影響響卻可降降低TGG水平。44)糖尿病病患者的的HDLL能顯著著增加內內皮細胞胞環氧化化酶2（CCOX22）表達達，促進進了PGGI2 的釋放放，表現現為對AAS的代代償性保保護作用用。5)構建了了新的具具有HDDL受體體功能的的ATPP合酶腺腺病毒載載體，將將應用于于已知HHDL載載體SRRB1基基因敲除除小鼠研研究，從從而發現現HDLL功能異異常的新新機制。

21、6）在前期工作中，已經解決了技術難題，成功制備了高TG的ApoCIII轉基因小鼠、家兔和小型豬。第四部分 含硫氨氨基酸家家族在動脈脈粥樣硬硬化發生生中的炎炎癥和免免疫調節節作用及及分子機機制學術思路與與技術途途徑：本課題采用用系統生生物醫學學的觀念念和手段段，特別別采用功功能蛋白白質組學學分析的的方法，以以血管細細胞和管管周脂肪肪細胞及及免疫細細胞（巨巨噬細胞胞， TT細胞， 樹突狀狀細胞）為為對象，探探討關鍵鍵炎性因因子的主主要來源源及其受受含硫氨氨基酸家家族調控控的機理理，闡明明細胞內內起關鍵鍵作用的的蛋白質質靶分子子及其修修飾機制制。最后后在整體體AS動動物模型型乃至臨臨床病人人中，探探

22、討血管管局部炎炎癥和抗抗炎癥系系統如何何失衡從從而介導導了血管管慢性炎炎癥的發發病機制制，并改改變關鍵鍵蛋白靶靶點后進進行功能能驗證。以以尋找出出主要慢慢性炎癥癥生物標標記物與與含硫氨氨基酸家家族作用用的主要要途徑，分分析環境境致病因因素單獨獨或協同同作用引引起相同同或相似似的動脈脈血管損損傷的原原因，以以及同一一致病因因素在不不同人群群和個體體引起不不同損傷傷的炎癥癥和抗炎炎癥機制制，為發發現具有有抗動脈脈硬化慢慢性炎癥癥潛在藥藥物的作作用靶點點奠定基基礎。研究創新性性：含硫氨基酸酸家族代謝謝成員間間的動態態平衡關關系以及及它們的的效應間間的“網網絡”調調節兩個個層面出出發，探探索ASS的炎

23、癥免免疫發病病新的調調控機制制。可行性分析析：國內合作十十年已經經形成了了包括本本課題主主要成員員在內的的從內源源性含硫硫氨基酸酸家族（代代謝同源源分子），包包括Hccy與HH2S及及其主要要代謝酶酶在ASS發生、發發展中的的作用的的精良的的研究隊隊伍；本本課題組組已經在在國內建建立了很很好的學學科交叉叉和優勢勢互補合合作研究究，包括括在蛋白白質組學學和系統統生物學學以及分分子病理理生理學學和臨床床研究的的優秀團團隊，用用新的思思維和新新的研究究模式對對內源性性含硫氨氨基酸家家族（代代謝同源源分子）代代謝物存存在和功功能展開開全面研研究；本本課題主主要承擔擔和合作作單位均均具有良良好的蛋蛋白組

24、學學平臺和和系統生生物學平平臺以及及工作經經驗；本本課題組組還擁有有研究所所需的多多種轉基基因和基基因敲除除AS實實驗動物物模型，為為工作的的順利開開展提供供了必要要條件。第五部分 血管重重塑與動動脈粥樣樣硬化發發生發展展的分子子機制學術思路與與技術途途徑：本課題建立立和優化化心肌橋橋物理仿仿真模型型，探索索內皮損損傷導致致血管重重塑造成成血管再再狹窄分分子機制制，研究究如何在在抗再狹狹窄-內皮修修復-血管正正性重構構-遠期預預后支架架尋求平平衡點，闡闡明外膜膜的細胞胞成分對對于應答答血管損損傷和導導致血管管重塑的的具體的的分子機機制。1.以內皮皮細胞作作為工作作重點，檢檢測不同同AS模模式動

25、物物內皮細細胞在不不同剪切切應力作作用下的的功能變變化，內內皮細胞胞如何感感應機械械剪切力力，并把把機械信信號轉變變為分子子信號傳傳遞到核核內并引引起一系系列下游游事件改改變。2.基于生生物醫學學工程建建立心肌肌橋物理理仿真模模型，搭搭建研究究心肌橋橋近段壁壁冠脈易易發ASS的研究究平臺，探探索該處處復合應應力對內內皮細胞胞結構功功能的影影響，闡闡明橋近近段冠脈脈易發AAS分子子機理，為為心肌橋橋是否能能成為AAS新的的解剖因因素提供供理論依依據。3.在藥物物支架抗抗再狹窄窄-內皮修修復-血管正正性重構構-遠期預預后鏈中中尋求平平衡點，尋尋求在血血管過度度正性重重塑中具具有預報報價值的的信號分

26、分子；通通過新型型的影像像學檢測測手段跟跟蹤藥物物支架植植入后血血管重構構的影像像學特征征，探索索并構建建早期篩篩查再狹狹窄和晚晚期支架架內血栓栓及貼壁壁不良風風險預報報的臨床床參數系系統。4.以血管管外膜為為研究對對象，研研究成纖纖維細胞胞分泌因因子的相相互作用用及其信信號通路路；從細細胞及器器官水平平闡明外外膜在血血管重塑塑中的作作用，尋尋找新的的干預靶靶點。特色與創新新性：心肌橋物理理仿真模模型逼真真模擬符符合體內內不同程程度的心心肌橋模模型；率率先進行行藥物支支架內皮皮化的分分子調控控研究和和藥物支支架涂層層材料分分子生物物學研究究；識別別血管外外膜產生生的血管管活性因因子，探探索調控

27、控細胞分分化和表表型轉化化的機制制，以確確定外膜膜在ASS發生中中的地位位。可行性分析析：本課題組已已經從國國外引進進SMSS2KOO小鼠、SSMS22LTgg小鼠等等AS模模式動物物，與本本項目有有關的關關鍵設備備層流切切應力平平行板裝裝置由上上海理工工大學研研制，能能保證細細胞受到到不同水水平的恒恒流剪切切力作用用，經過過10多多年的使使用和不不斷完善善，具有有更好的的可比性性和穩定定性；已已經初步步建立符符合體內內血流動動力學的的心肌橋橋模型，可可以調節節不同的的壓迫程程度；還還建立了了相關的的內皮細細胞三維維培養體體系，這這個培養養體系可可以放置置到心肌肌橋模型型中進行行觀察。第六部分

28、 動脈粥粥樣硬化化斑塊不不穩定性性和早期期防治學術思路與與技術途途徑：1.構建斑斑塊不穩穩定動物物模型，在在ApooE-/-背景景下過表表達促進進斑塊不不穩定的的基因并并評價其其作用。2.利用構構建的斑斑塊不穩穩定動物物模型，研研究免疫疫炎癥和和氧化應應激對于于斑塊不不穩定性性的影響響及其分分子機制制。3.同時研研究調節節血管內內皮細胞胞凋亡的的關鍵因因子在斑塊不不穩定性性的作用用以及信信號轉導導網絡。4.比較穩穩定和不不穩定斑斑塊中主主要細胞胞成分組組蛋白修修飾狀態態的差異異，尋找不穩穩定斑塊塊組成細細胞中出出現組蛋蛋白表觀觀遺傳學學異常的的分子機機制以及及這些組組蛋白修修飾差異異對斑塊塊穩

29、定性性的意義義。5.研究不不同生物物力學變變化對血血管細胞胞形態、排排列和生生物學標標志物以以及斑塊塊應變的的影響。多多方位探探討斑塊塊不穩定定的理化化機制，尋尋找能夠夠干預不不穩定性性斑塊形形成的新新通路和和新靶點點。ASAS斑塊不穩定動物模型的建立及評價氧化應激對于斑塊免疫炎癥的影響比較并尋找不穩定斑塊的表觀遺傳學差異血管生物力學對易損斑塊結構的影響血管內皮細胞凋亡對斑塊不穩定的作用及機制免疫細胞和免疫調控分子影響斑塊不穩定性的機制生物信息學方法確定內皮細胞凋亡和自噬的新因子利用組學技術探討DNA甲基化和組蛋白修飾狀態的調控機制明確導致斑塊破裂的關鍵力學和分子偶聯機制不穩定斑塊干預的新通路

30、和新節點研究的創新新性：首次建立與與人類不不穩定斑斑塊病變變相似的的具有高高自發破破裂率和和高血栓栓發生率率的“雙雙高”AApoEE-/-小鼠模模型。發發現的PPC-PPLC和和ITGGB4抑抑制劑尋尋找血管管內皮細細胞凋亡亡和自噬的新因子子和新通路路，發現現凋亡和和自噬信信號通路路的新節節點。建立一一種取得得高純度度血小板板的新途途徑，首首次提出出LPSS通過血血小板TTLR44/PII3K/Aktt信號通通路引起起血小板板活化。首首次提出出針對不不穩定斑斑塊的多多因子調調控網絡絡進行節節點干預預研究，提出力學與生物信號分子聯合調控斑塊易損的新機制和新思路，為防治易損斑塊提出新的干預靶點。可

31、行性分析析：本課題一直直從事AAS不穩穩定斑塊塊的基礎礎和臨床床研究，承承擔多項項國家重重大和重重點研究究課題，形形成了以以AS不穩穩定斑塊塊發生機機制、預預警技術術和防治治措施為為突出特色色的研究究方向，已成為為國內外外知名的的AS研究究中心。主要包括：在不穩定斑塊動物模型的研究方面，本課題組已建立了斑塊破裂率高達80%的新西蘭兔模型、斑塊內出血的新西蘭兔模型以及斑塊自發破裂的ApoE-/-小鼠模型，在此領域中積累了豐富的經驗，為本課題建立“雙高”的ApoE-/-小鼠模型奠定了良好的基礎；發現10多種小分子化合物對血管內皮細胞凋亡有重要調節作用，尤其發現PC-PLC抑制劑D609可顯著抑制A

32、S的發展，使斑塊趨于穩定，證明3BDO能抑制血管內皮細胞自噬；創建了PGHS-1和PGHS-2的基因打靶的小鼠4種變異體包括PGHS-2 Y385F，PGHS-1 Neo，PGHS-1PGHS-2和PGHS-2 Neo；發現了多個穩定斑塊的治療新靶點，證明不同靶點的聯合基因干擾較單一靶點的基因干擾可更有效地穩定斑塊；用不同濃度LPS刺激血小板，建立了LPS刺激血小板活化的方法，為研究血小板TLR4受體的生物學活性提供了實驗基礎；已建立了研究血管生物力學的整套實驗系統，保障了本課題的順利實施；有先進完備的蛋白質組學技術平臺和具有豐富經驗的生物信息學、轉錄組和蛋白組學領域研究人員，已建立了完善的A

33、S患者標本數據庫，為本課題的實施提供了重要保障。四、年度計計劃年度研究內容預期目標第一年篩查AS相相關基因因遺傳變變異。建立動脈粥粥樣硬化化的動物物模型和和細胞模模型以及及能量限限制，辣辣椒素處處理方法法和高脂脂誘導的的方法。探討含硫氨氨基酸家家族主要要代謝產產物及相相應的代代謝酶產產生和降降解等變變化規律律和特點點。觀察察含硫氨氨基酸家家族主要要代謝產產物對血血管和免免疫細胞胞致炎和和抗炎功功能的影影響和可可能的機機制。不同剪切應應力對于于內皮功功能分子子，細胞胞膜感受受復合體體的影響響以及有有關信號號傳導通通路的影影響。以以內皮為為研究核核心，觀觀察藥物物支架植植入后對對于血管管重塑的的正

34、反作作用及機機制。在ApoEE-/-小鼠（高高脂血癥癥遺傳背背景）中中給予高高脂喂養養（加速速斑塊形形成）、頸頸動脈放放置狹窄窄套管（造造成內皮皮損傷和和斑塊定定位）、應應激狀態態（造成成斑塊炎炎癥和自自發性破破裂）、組組織因子子TF或或纖溶酶酶原抑制制物PAAI-11基因過過表達（造造成血栓栓形成），應應用病理理學技術術測量和和對比穩穩定和不不穩定斑斑塊的自自發破裂裂率和血血栓發生生率，預預期可導導致“雙雙高”的的ApooE-/-小鼠鼠模型。篩查出潛在在的與AAS相關關的遺傳傳多態位位點，用用于進一一步鑒定定。建立能量限限制與特特殊飲食食影響動動脈粥樣樣硬化和和細胞血血管功能能的體內內和體外

35、外模型。明確含硫氨氨基酸家家族主要要代謝產產物及相相應的代代謝酶產產生和降降解等變化規規律和特點；闡明其其對不同同細胞致致炎和抗抗炎平衡衡的影響響。明確內皮細細胞如何何感應機機械剪切切力，將將機械信信號轉變變為分子子信號傳傳遞到核核內以及及一系列列下游事事件改變變。尋求求在血管管過度正正性重塑塑中具有有預報價價值的信信號分子子。建立與人類類不穩定定斑塊病病變相似似的具有有高自發發破裂率率和高血血栓發生生率的“雙雙高”AApoEE-/-小鼠模模型，為為不穩定定斑塊的的發生機機制和干干預策略略研究提提供理想想的動物物模型。第二年綜合分析遺遺傳變異異與急性性冠脈綜綜合征以以及中間間表型的的關系。在細

36、胞水平平，觀察察能量限限制，辣辣椒素和和高脂處處理對于于血管細細胞功能能和斑塊塊形成和和面積大大小的影影響。篩篩選高脂脂處理處處理細胞胞引起的氧氧化應激激、內質質網應激激、炎癥癥通路的的顯著改改變的靶靶點；采用系系統生物物醫學的的觀念和和手段尋尋找在高高同型半半胱氨酸酸加速動動脈硬化化發生和和發展的的慢性炎炎癥過程程中調控控的關鍵鍵炎性因因子，并并進行功功能驗證證。建立優化心心肌橋物物理仿真真模型。檢檢測心肌肌橋物理理仿真模模型對于于內皮細細胞形態態、凋亡亡與增殖殖功能、自自分泌及及旁分泌泌功能，粘粘附分子子、炎癥癥因子、細細胞外基基質、氧氧化應激激相關分分子等的的變化情情況以及及基因表表達譜

37、的的影響。分析POXX對ASS發生發發展的影影響；鑒鑒定影響響血管內內皮細胞胞自噬、凋凋亡的新新因子；分析免疫疫細胞和和因子在在不穩定定斑塊的的作用和和機制；研究LPPS誘導導血小板板活化的的關鍵靶靶分子；觀察血管管生物力力學對易易損斑塊塊結構的的影響；研究參與與斑塊細細胞的全全基因組組表觀遺遺傳譜式式和差異異。綜合分析基基因變異異與急性性冠脈綜綜合征以以及中間間表型的的關系。發現5-10個對AS發病危險具有重要作用的位點。明確能量限限制與辣辣椒素對對于細胞胞，血管管功能的的影響和和對于動動脈粥樣樣硬化是是否具有有的保護護/促進進作用。初步完成高脂處理和髙同型半胱氨酸處理的功能基因組學和蛋白質

38、組差異分析，篩選出炎性反應通路中的主要途徑和3-5個關鍵因子。運用此模型型，探索索該處復復合應力力對內皮皮細胞結結構功能能的影響響。闡明POXX活性對對斑塊氧氧化應激激和斑塊不不穩定的的影響及及其分子子機制。第三年應用分子細細胞生物物學技術術研究重重要多態態的生物物學功能能。篩選與能量量限制和和辣椒素素等相關關的作用用分子，對對于能量量限制和和高脂飲飲食相關關的分子子構建重重要分子子的轉基基因和基基因敲除除的動物物模型。研究Hcyy對關鍵鍵靶分子子蛋白的的調控和和翻譯后后修飾機機制,探探討其受受含硫氨氨基酸家家族調控控的可能能機理以及及分子結結構學基基礎。闡明心肌橋橋對不同同節段內內皮細胞胞變

39、化及及其機制制。尋找找引起內內皮細胞胞變化的的關鍵因因素，建建立血流流動力學學評估系系統。觀觀察藥物物支架植植入后，內內皮細胞胞和平滑滑肌細胞胞在重塑塑中的交交互作用用。分析POXX對ASS易損斑斑塊的影影響；研研究影響響血管內內皮細胞胞自噬、凋凋亡特異異性胞內內信號通通路；分分析免疫疫調控分分子在斑斑塊不穩穩定性中中的作用用和機制制；分離離、鑒定定活化血血小板中中特異的的磷酸化化蛋白和和磷酸化化位點；觀察不同同剪切力力分布的的斑塊局局部炎癥癥因子和和膠原的的測量；研究全基基因組表表觀遺傳傳譜式和和分析差異異生物信信息學數數據確定重要多多態在AAS斑塊塊進展中中的生物物學作用用。找到3-55個

40、與能能量限制制與特殊殊飲食相相關的重重要調控控分子。明確不同細細胞中，Hcy和H2S對靶蛋白分子的調控修飾機制。闡明橋近段段冠脈易易發ASS分子機機理，為為心肌橋橋是否能能成為AAS新的的解剖因因素提供供理論依依據。明確血管內內皮細胞胞自噬與與斑塊不不穩定性性的關系系及其機機制，發發現控制制血管內內皮細胞胞自噬的的新因子子，揭示示炎癥因因子引起起血小板板活化的的信號轉轉導通路路，明確確干預血血小板活活化的關關鍵靶點點，尋求求有效預預防血栓栓形成的的策略，揭示炎炎癥引起起血小板板活化的的信號轉轉導機制制。第四年1.結合合遺傳學學找到的的遺傳變變異位點點，能量量限制、脂脂質代謝謝紊亂以以及髙同型半

41、半胱氨酸酸研究中中找到的的關鍵分分子，研研究其生生物學功功能，并并找出其其相互作作用分子子和上下下游信號號分子，分分別構建建分子作作用小網網絡。2.采用用新型的的影像學學檢測手手段跟蹤蹤藥物支支架植入入后血管管重構的的影像學學特征。探探索支架架在如何何防止過過度重塑塑。3.觀察察系統性性POXX分析花花生四烯烯酸代謝謝對易損損斑塊的的影響；利用SSiRNNA、特特異性阻阻斷劑、轉轉基因/基因敲敲除觀察察對易損損斑塊的的影響；觀察免免疫抗體體誘導或或基因敲敲除阻斷斷觀察免免疫細胞胞對易損損斑塊的的影響；研究LLPS誘誘導血小小板活化化的關鍵鍵和有效效靶點；篩選機機械力與與斑塊破破裂有關關的關鍵鍵

42、因子和和作用靶靶點；篩篩選表觀觀遺傳差差異調控控斑塊破破裂相關關的關鍵鍵作用因因子。探討AS重重要相關關基因變變異的分分子遺傳傳機制。初初步明確確重要調調控分子子起作用用的信號號網絡。探索并構建建早期篩篩查再狹狹窄和晚晚期支架架內血栓栓及貼壁壁不良風風險預報報的臨床床參數系系統。明確力學改改變對斑斑塊炎性性因子、膠膠原代謝謝和血管管新生的的影響及及其分子子機制和和信號轉轉導通路路，闡明明導致斑斑塊破裂裂的關鍵鍵力學和和分子偶偶聯機制制第五年結合急性冠冠脈綜合合征病例例對照和和AS高高危人群群的前瞻瞻性研究究，評價價遺傳變變異及其其聯合作作用與AAS評價價指標間間的關系系。用于于指導AAS早期期

43、預警、風風險評估估和個性性化防治治。對于能量限限制機制制、脂質質代謝紊紊亂機制制、高同同型半胱胱氨酸機機制中發發現的關關鍵調控控分子，從從臨床獲獲得標本本，分析析這些分分子與臨臨床表型型的關系系；明確確該分子子是否可可作為AAS的生生物標記記物和診診防治的的靶點。研究血管外外膜對血血管收縮縮/舒張張功能的的影響。闡闡明血管管外膜損損傷過程程中的反反應及其其基因蛋蛋白表達達變化對對血管重重塑中的的作用，為為尋找新新的干預預靶點奠奠定基礎礎。在已知的多多種黏附附、趨化化、炎癥癥和細胞胞因子中中，利用用單一和和聯合基基因過表表達或基基因干擾擾等方法法，確定定干擾的的新靶點點；比較較穩定和和不穩定定斑

44、塊中中主要細細胞成分分組蛋白白修飾狀狀態的差差異，探探討表觀觀遺傳機機制。評價遺傳變變異及其其聯合作作用與動動脈粥樣樣硬化評評價指標標間的關關系。篩篩查出11-2個個AS早早期預警警遺傳標標記。尋找可用于于AS新新的相關關分子；確定新新的抗AAS靶點點分子，明明確其功功能及臨臨床意義義；申請請國內外外專利。明確成纖維維細胞分分泌因子子的相互互作用及及其信號號通路。從從細胞及及器官水水平闡明明外膜在在血管重重塑中的的作用，尋尋找新的的干預靶靶點。建立具有國國際先進進水平的的斑塊穩穩定性的的基礎研研究和防防治體系系，圍繞繞動物模模型、內內皮功能能、氧化化應激、炎炎癥免疫疫、血小小板活化化、生物物力

45、學和和蛋白組組學等七七個方面面，提出出穩定斑斑塊的新新理論、新新觀點和和防治新新靶點。一、研究內內容AS是多基基因，多多因素，多多階段，長長時程的的疾病。AS的發病受遺傳因素和內外環境的影響。AS受多個微效基因的影響，有家族史的人易發生AS；內外環境因素可誘發脂類平衡紊亂和炎癥免疫反應，脂類沉積到內膜下，引起炎性細胞浸潤，血管內膜增厚，斑塊形成，長期積累效應使血管重塑，管腔狹窄，阻礙血流，器官功能發生障礙；不良環境因素的刺激可能誘發斑塊不穩定而破裂，產生心梗和腦卒中等并發癥。根據我國國情，遵循基礎與臨床緊密結合的方針，設置課題方向為1）中國人動脈粥樣硬化遺傳分子基礎；2）內外環境因素影響動脈粥

46、樣硬化發生發展的分子機制；3）脂代謝紊亂導致動脈粥樣硬化發病的分子機制；4）含硫氨基酸家族在動脈粥樣硬化發生中的炎癥和免疫調節作用及分子機制；5）血管重塑與動脈粥樣硬化發生發展的分子機制；6）動脈粥樣硬化斑塊不穩定性和早期防治。第一部分中中國人動動脈粥樣樣硬化遺遺傳分子子基礎關鍵科學問問題：本研究綜合合全基因因組關聯聯研究數數據和多多個代謝謝通路相相關基因因網絡，闡闡明ASS發生發發展過程程中不同同亞臨床床和臨床床表型遺遺傳因素素的作用用，并最最終闡明明其分子子遺傳機機制，為為AS發生生的早期期預警提提供依據據。主要研究內內容：1.綜合全全基因組組關聯研研究數據據和多個個代謝通通路相關關基因變

47、變異信息息，開展展大規模模多階段段的驗證證研究，篩篩查和鑒鑒定我國國人群AAS疾病病新的易易感基因因和遺傳傳標記。2.應用分分子生物物學、細細胞生物物學、動動物模型型等手段段，研究究基因變變異對基基因表達達或生物物學功能能的影響響，明確確新的易易感基因因或遺傳傳標記的的遺傳分分子機制制。3.采用分分子影像像學和冠冠脈造影影等技術術手段檢檢測正常常人和高高危人群群的血脂水水平、血血栓形成成、斑塊塊鈣化分分級、頸頸動脈內內中膜厚厚度、脈脈搏波速速度和冠冠脈狹窄窄程度等等AS相關關亞臨床床和臨床床表型以及及中間表表型，動動態和系系統評價價多種代代謝通路路基因間間相互作作用的遺遺傳網絡絡在ASS發生、

48、發展以以及斑塊塊穩定性性及斑塊塊進展程程度的作作用。4.在大規規模前瞻瞻性研究究中評估估驗證遺遺傳標記記和環境境因素的的預警價價值，建建立ASS發生發發展的風風險預測測模型，尋尋找早期期診斷、危危險分層層及臨床床干預的的關鍵靶靶點。第二部分 內外環環境因素素影響動動脈粥樣樣硬化發發生發展展的分子子機制關鍵科學問問題：在前期研究究基礎上上，深入入探討能能量限制制和特殊殊飲食等等內外環環境因素素對ASS發生發發展的影影響；研研究這些些因素起起作用的的表觀遺遺傳調節節等的分分子及其其作用機機制，構構建作用用小網絡絡；并探探討關鍵鍵分子作作為防治治診靶點點的可能能性。主要研究內內容：1.觀察能能量限制

49、制、辣椒椒素和黃黃酮類物物質的作作用。在在細胞水水平，觀觀察能量量限制，辣辣椒素及及黃酮類類物質對對于血管管細胞功功能的影影響。在在動物水水平，觀觀察辣椒椒素及黃黃酮類物物質對斑斑塊形成成和面積積大小的的影響。2.用不同同飲食因因素處理理，尋找找與ASS發生發發展過程程相關的的表觀遺遺傳調節節的分子子。3.對于已已發現的的Sirrtuiins基基因家族族和新發發現的分分子，構構建轉基基因動物物和基因因敲除鼠鼠，觀察察其對AAS的影影響，闡闡明其功功能和作作用機制制。在細細胞水平平，觀察察對于不不同類型型細胞的的功能的的影響，包包括內皮皮細胞的的衰老狀狀態和舒舒張功能能，平滑滑肌細胞胞的增殖殖、

50、凋亡亡、分泌泌和遷移移功能，巨巨噬細胞胞的吞噬噬功能和和脂質反反向轉運運功能。明明確這些些分子起起作用相相關的表表觀遺傳傳機制和和信號通通路，構構建作用用小網絡絡。4.對于研研究中發發現起作作用的關關鍵分子子，探討討其作為為診防治治靶點的的可能性性。獲取取臨床標標本，觀觀察ASS發病與與關鍵分分子的表表達是否否存在相相關性；分析關關鍵分子子的激活活劑或抑抑制劑是是否抑制制或促進進AS的的發生發發展。通通過這些些明確該該分子是是否可作作為ASS診防治治的靶點點。第三部分 脂代謝謝紊亂導導致動脈脈粥樣硬硬化發病病的分子子機制關鍵科學問問題：高TG伴低低HDLL是國人人脂代謝謝紊亂的的主要表表型，本

51、本研究在在前期工工作基礎礎上進一一步闡明明富含TTG脂蛋蛋白和低低HDLL誘發AAS的途途徑及其其作用機機制，尋尋找防治治AS的的新靶點點；明確確干擾泡泡沫細胞胞形成的的關鍵分分子清道道夫受體體胞漿域域功能來來逆轉AAS的可可能性。主要研究內內容：1.應用原原代培養養的血管管內皮細細胞、平平滑肌細細胞和巨巨噬細胞胞，與不不同的富富含TGG脂蛋白白（乳糜糜微粒，乳乳糜微粒粒殘體，極極低密度度脂蛋白白，極低低密度脂脂蛋白殘殘體）培培養后，以以氧化應應激和炎炎癥通路路矩陣PPCR和和蛋白組組學方法法，確認認特異性性的氧化化應激途途徑，并并應用RRNA干干擾、特特異性抗抗體和特特異性激激動和阻阻斷劑，

52、對對脂質沉沉積、細細胞活化化、增值值和凋亡亡等ASS病變的的細胞生生物學終終點進行行干預分分析；應應用LPPL基因因缺陷以以及AppoCIIII轉轉基因的的高TGG模型小小鼠，與與ApooE和LLDL受受體缺陷陷的ASS易感小小鼠交配配后，分分別喂飼飼高脂食食物以及及通過動動脈壁損損傷加速速AS形形成，在在不同的的時間分分別取動動脈、心心臟和肝肝臟，以以基因組組、蛋白白組和脂脂質組學學等系統統生物學學手段，檢檢測和分分析這些些與ASS密切相相關組織織的氧化化應激通通路、炎炎癥通路路以及脂脂代謝通通路中相相應的改改變。并并應用高高TG的的ApooCIIII轉基基因家兔兔和小型型豬進一一步驗證證。

53、在此此基礎上上選擇數數個干擾擾靶點，進進行實驗驗性治療療。同時時尋找具具有對高高TG所所致ASS嚴重度度有預測測生物標標識物，并并在相應應的臨床床病人中中進行驗驗證。2.通過分分析III型糖尿尿病患者者的HDDL蛋白白組學，以以及與內內皮細胞胞孵育后后細胞基基因組和和蛋白組組的變化化，以CCOX22的表達達與活性性改變為為終點，明明確和驗驗證III型糖尿尿病患者者HDLL促進內內皮環氧氧合酶22（COOX2）的分子子機制及及其對AAS代償償性影響響的生理理意義。3.發現和和驗證AAS病變變中泡沫沫細胞形形成的新新機制，制制備干擾擾清道夫夫受體胞胞漿結合合域功能能的GRRP788的轉基基因小鼠鼠

54、模型，以以驗證在在AS易易感小鼠鼠體內是是否能夠夠減緩AAS病變變的形成成，并應用用從多肽肽庫篩選選得到的的干擾清清道夫受受體胞漿漿結合域域功能的的多肽HH11，進進行ASS實驗性性治療，為為臨床防防治ASS提供新新的措施施。第四部分 含硫氨氨基酸家家族在動動脈粥樣樣硬化發發生中的的免疫和和炎癥調調節作用及及分子機機制關鍵科學問問題：在以往長期期系列研研究的基基礎上，以以含硫氨氨基酸家家族代謝謝產物之之間形成成的網絡絡，特別別以Hccy與HH2S為為核心造造成的致致炎與抗抗炎作用用之間調調控機制制為主軸軸,研究究它們與與重要蛋蛋白質的的相互作作用機理理及重要要靶蛋白白修飾的的特點和和規律,闡明

55、它它們在AAS發生生和發展展不同階階段中的的作用及及機制。 主要研究內內容：采用高通量量的翻譯譯后修飾飾位點的的篩選方方法，探探索含硫硫氨基酸酸家族主主要成員是否否通過對對血管細胞胞和免疫疫細胞膜膜或細胞胞內與炎炎癥調控控相關的的特定靶靶分子進進行翻譯譯后修飾飾,促使或減減緩ASS發生發發展。從從內源性性含硫氨氨基酸家家族成員員間的動動態平衡衡關系和和其效應應間的“網網絡”調調節關系系中探尋尋拮抗高同同型半胱胱氨酸引引起的血血管慢性性炎癥損損傷的內內源性保保護小分分子物質質。1.在高同同型半胱胱氨酸加加速高脂脂引起的的動脈硬硬化發生生和發展展的慢性性炎癥過過程中, 含硫硫氨基酸酸家族主要要代謝

56、產產物和代代謝酶的的變化規規律，特特別是它它們產生生和降解解的特點點。2.含硫氨氨基酸家家族主要要代謝產產物對血血管和免免疫細胞胞致炎和和抗炎功功能的影影響和機機制，特特別是探探討它們們引起血管管炎癥和和免疫細細胞變化化的靶蛋白白翻譯后后修飾機機制以及及分子結結構學基基礎。3.含硫氨氨基酸家家族主要要代謝產產物（HHcy和和 H22S）及及其主要要代謝酶酶(通過過改變其其基因和和抑制蛋蛋白的活活性)在在AS發發生、發發展及治治療中的的作用；重點研研究血管管內皮、血血管外膜膜成纖維維及脂肪肪細胞與與不同免免疫細胞胞在上述述AS病病變發生生和發展展中的關關鍵起始始作用機機制和對對關鍵靶靶分子蛋蛋白的調調控和修修飾機制制。第五部分 血管重重塑與動動脈粥樣樣硬化發發生發展展的分子子機制關鍵科學問問題：AS血管重重塑是通通過血管管內膜和和外膜和和其周圍圍脂肪組組織共同同作用的的結果。本本課題將將建立和和優化心心肌橋物物理仿真真模型，探探索內皮皮損傷導導致血管管