1、微生物及無菌知識培訓微生物及無菌知識培訓一、前言我們所生活的環境中，到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中，微生物達8003500個/m3，在土壤中達1500108個/g，在嚴重污染的水中可達107個/ml。（飲用水要求細菌總數100個/ml，大腸桿菌3個/ml。經水塔或貯水池貯存后，短期內可繁殖至105106個/ml。）人的頭皮上有140萬個/cm2，兩手上約有440萬個，1g指甲污垢有38億個，1g糞便可達101000億個。可以說微生物是無處不在，無處不有。許多以前被人們認為是極端（高溫、高壓、強酸、強堿、低溫等）甚至是致死的環境，現在已發現生活著各種類型的微生物（稱為極端微 生物）。事實

2、說明，微生物有特別頑強的生存、繁殖和變異能力來適應環境。微生物種類繁多，有的對人有益，有的有害，有的無益也無害。但在藥品生產過程中，不可能對環境中的各種微生物加以區別對待，為保證藥品的安全有效，需要對其進行控制。空氣中的微生物多數附著在灰塵上，或以芽孢形式懸浮于空氣中，1m以下者處于懸浮狀態，10m以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對塵粒進行控制。大量臨床資料表明，注射劑（尤其是靜脈注射劑）如污染了712m的塵粒，可導致熱原反應、肺動脈炎、微血栓或異物肉芽腫等，嚴重的還會致人死命。而如果污染了細菌，輕則局部紅腫化膿，重則引起全身細菌性感 染。因此，對微生物和塵粒進行更加嚴格的控制對于針劑生

3、產潔凈室非常重要。人是潔凈室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以上的含菌粒子，女性為750個以上。穿無菌服時，靜止時的發菌量為10300個/min，一般活動時發菌量為1501000個/min，行走時發菌量為9002500個/min。咳嗽一次發菌量為70700個/min，噴嚏一次為400060000個/min。所以在潔凈室中，人的數量和活動應有特別嚴格的限制。二微生物簡介微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微小（直徑小于1mm）、結構簡單、肉眼看不見，必須藉助光學或電子顯微鏡放大數百至數萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是，微生物是一個比較籠統的概念，界線有時非常模糊

4、。如單細胞藻類和一些原生動物也應算是微生物，但通常它們并不放在微生物中進行研究。微生物具有以下特點：體積小，面積大；吸收多，轉化快（2000倍體重/h）；生長旺，繁殖快（20min分裂一次）；易變異，適應強；分布廣，種類多（10萬種以上）。微生物按其結構、化學組成及生活習性等差異可分成三大類：1真核細胞型細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體；胞質內有完整的細胞 絕大多數微生物對人類和動、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環靠微生物的代謝活動來進行。例如空氣中的大量氮氣只有依靠微生物的作用才能被植物吸收，土壤中的微生物能將動、植物蛋白質轉化為無機含氮化合物，以供植物生

5、長的需要，而植物又為人類和動物所利用。因此，沒有微生物，植物就不能新陳代謝，而人類和動物也將無法生存。另一方面，由極少數微生物引起的傳染病發病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，嚴重危害著人民健康。三微生物的形態結構1細菌（原核單細胞生物）細菌按形狀可分為：球菌（0.52m）、桿菌（長15m，寬0.31m）和螺形菌（大小與桿菌相似）。按革蘭氏染色法染色的不同，分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的細胞壁表面含較多的磷壁酸，會產生外毒素，如金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌的細胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，會產生內毒素（即熱原），如大腸桿菌。細菌一般有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核，有的還有莢膜

6、、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結構。細菌一般為無性繁殖，以二分法繁殖，幾十分鐘或12小時分裂一次。霉菌是真菌的一部分。在培養基上長成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統稱為霉菌。霉菌細胞呈狹長的管狀，稱為菌絲。菌絲直徑比細菌、放線菌大，約210m。菌絲分枝連接，交錯集合在一起的總體稱為菌絲體。霉菌大多數是多細胞微生物，菌絲細胞由細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器組成。細胞壁很薄，往往在表面產生色素，使菌落出現各種顏色。霉菌靠孢子繁殖，有無性繁殖和有性繁殖兩種方式，以無性繁殖為主。有些真菌可用釀酒造醬，或用于發酵生產檸檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素（如青霉素、頭孢菌素）；少數真菌能引起各種真菌病。真菌產

7、生的真菌毒素（如黃曲霉素）有毒。3酵母菌（真核單細胞生物，屬真菌）酵母菌以單細胞存在，呈圓形、卵圓形和香腸形，比細菌大，細胞長530m，寬15m。細胞結構有細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核和各種細胞器等。酵母菌的增殖分無性繁殖和有性繁殖兩個階段，有三種方式：芽殖、裂殖、孢子生殖。酵母菌是重要的工業微生物，用于釀酒，生產單細胞蛋白、B族維生素、核酸、輔酶A、細胞色素C等。一般對人體無害。4放線菌（原核單細胞生物）放線菌有生長發育良好的菌絲體，呈分枝狀，菌絲寬為0.21.2m，革蘭氏陽性。其內部構造與細菌相似，無完整的細胞核。菌落常呈幅射狀，因此稱放線菌。繁殖方式為無性孢子繁殖。最適pH6.77.5

8、，溫度2530。放線菌可用于生產抗生素、維生素和酶類，少數可引起人畜放線菌病。5病毒病毒是一類體積十分微小，結構簡單，只含一種核酸（DNA或RNA），沒有產生能量的酶系統，只能在活細胞內以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物，人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。病毒體主要由核酸和蛋白質組成。病毒體積微小，最大直徑300nm（如牛痘病毒），最小直徑20nm（如口蹄疫病毒），絕大多數在 在含水的環境中微生物才能存活。但也有人發現在無水碳氫化合物中微生物可長期存活。2碳源：碳源是構成細胞的重要物質。有些微生物的碳源必須來自有

9、機碳化合物如糖、蛋白質、脂肪、有機酸等（同時利用其化學能），屬異養型；有些微生物不需有機碳化合物，以CO2為碳源，屬自養型（分為光能自養型和化能自養型）。3氮源：氮是組成蛋白質和核酸的重要元素。4無機鹽類：細菌所需無機鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鈷、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。5生長因子：生長因子是某些微生物生長發育所必需，而其自身又不能合成的一類營養物質。包括維生素、嘌呤和嘧啶等。五微生物生長的影響因素1營養物2pH值：各種微生物都有其最適宜的pH值，大多數細菌最適pH為6.87.4，但一般有較大的容忍度，在49也可存活和生長，少數細菌能在極端

10、pH值范圍內生長。真菌適于pH值36的微酸性環境，但在210也可生長。3溫度：微生物適于生長繁殖要有適宜的溫度，當超過其最低或最高可耐受的溫度時，即停止生長或死亡。一般細菌最適溫度為 它是影響細菌生長的因素之一。很多革蘭氏陰性菌，特別是大腸菌群可很好地在表面活性劑包圍的介質中生長，而大多數革蘭氏陽性菌在表面張力低時（0.05N/m）不能很好生長。陽離子表面活性劑對很多有機體有毒性，陰離子表面活性劑毒性很小，非離子表面活性劑幾乎沒有毒性，并可成為某些微生物的營養物。六消毒與滅菌消毒與滅菌是微生物實驗技術中最基本的操作，從事藥品生產和檢驗的人員都應當了解消毒與滅菌的方法及其意義，嚴格遵守操作規程，

11、否則會影響產品質量，危害患者安全。1概念1概念無菌不存在活的生物（GMP指南）。“無菌”從定義上來說是一個絕對的概念，但遺憾的是，在科學和技術高度發展的今天，藥品的絕對無菌即做不到，也無法加以證實。然而，無菌制劑的安全性要求人們設定無菌的相對標準。FDA、歐洲制藥工業界曾將百萬分之一微生物污染率作為滅菌產品“無菌”的相對標準，它和蒸汽滅菌后產品中微生物存活的概率為10-6（即產品的無菌保證值為6），系同一標準的不同表示法。這一標準于1980起收錄于USP XX中，如今已為世界各國普遍接受和采用。滅菌使達到無菌狀態的方法（GMP指南南）。用物理或化學方法殺滅傳播媒介上所有的微生物，使其達到無菌（

12、GB）。通常是指殺滅或除去全部活的微生物（包括繁殖體和芽孢）。消毒用物理或化學方法殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使其達到無害化（GB）。通常是指殺死病原微生物的繁殖體，但不能破壞其芽孢。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。無菌制劑不存在活的微生物的制劑（GMP指南）。非無菌制劑所含活的微生物量符合衛生學標準的制劑（GMP指南）。2常用消毒劑消毒劑 常用量 用途乙醇 70%75%水溶液 0.5%洗必泰溶于70%乙醇，再加入2%甘油 用于皮膚、器具等消毒供洗手用消毒異丙醇 75%水溶液 用于皮膚、器具等消毒甲醛 37%40%甲醛液89ml，再加入45g高錳酸鉀 每m3熏蒸量，密閉1224h。刺激

13、性強戊二醛 2%水溶液 用于空氣、器具等消毒。廣譜、高效、低毒，可殺芽孢和病毒。刺激性較輕。新潔爾滅（苯扎溴銨） 0.1%水溶液 用于皮膚、粘膜、器具等消毒，有清潔和消毒雙重功效。抗菌譜較窄。杜滅芬（消毒寧） 0.05%0.1%水溶液 用于皮膚、器具等消毒過氧乙酸 0.2%0.5%水溶液 新配0.5%水溶液 1g/m3 用于器具等消毒抗菌譜廣，可用于皮膚消毒殺滅某些病毒熏蒸但性質不穩定乳酸 0.331mol/L 11.5ml/m3熏蒸或與等量苯酚合用熏蒸 噴霧，用于空氣消毒，有強殺菌作用熏蒸，密閉12h以上麝香草酚 5%麝香草酚溶于50%乙醇 噴灑墻面、地面，殺霉菌3常用滅菌法1）干熱滅菌法常

14、見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等。火焰、燒灼：通常用于實驗室無菌操作中金屬或其它耐火材料制成的器具的滅菌。干烤和紅外線：利用干熱空氣或熱輻射進行滅菌。一般135145需35h，160170需2h以上，170180需1h以上，180200需0.51h。除熱原則需25030min，或20045min，1802h。空氣傳熱慢，穿透力不強，故干熱滅菌時間長。干熱滅菌時烤箱內裝入物品應留有空隙，以利空氣流動，否則使箱內溫度不均，部分物品滅菌不徹底。高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。它簡便、經濟、可靠、無毒，是最可靠、應用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為：11

15、5.5 30min121.5 20min126.5 15min注意事項：a. 必須完全排出滅菌器內的空氣。否則會影響滅菌器內溫度達到規定的要求。b. 注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內溫度與被滅菌物品的溫度一般是一致的，但在蒸汽輸入過快時，后者可能低于前者，所以升溫時要有一定的預熱時間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對于一種滅菌產品， 應制定一固定的滅菌曲線（象凍干曲線一樣）。c. 定期檢查滅菌器內溫度的準確性。3）化學滅菌法利用化學試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環氧乙烷（又稱氧化乙烯）。環氧乙烷是廣譜殺菌劑，能殺滅細菌、芽孢和多種病毒，還能殺死昆蟲及蟲卵。但由于環氧乙烷易

16、燃易爆且有毒（有致變異性），用于藥品方面極有限，多用于醫療器械、塑料制品等滅菌。（不能用于橡膠和乳膠手套，能將其溶解。）4）濾過除菌法利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩定的藥品溶液或液體物質中的細菌的方法。過濾法一般只能除菌，不能除去支原體和病毒。另外，空氣中的氧受紫外線照射后，可微量轉變為臭氧共同起殺菌作用。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時間、溫度和濕度等因素有關。我國規定紫外燈照射強度在距離1m處不低于70W/cm2（以紫外線測強儀測定）。在操作面上要求強度達40W/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支，工作前開3060min。紫外燈的輸出功率

17、隨使用時間增加而降低。國產紫外燈的平均壽命（點到70%額定功率的時間）一般為2000h，超過平均壽命時，就達不到預期效果，必須更換。紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強烈吸收小于350nm的紫外線，石英玻璃能吸收 小于200nm的紫外線。因此，它主要用于空氣和物體表面消毒，特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。紫外線對眼、皮膚有損壞，照射過程中產生的臭氧對眼、鼻腔有刺激，臭氧過多時使人頭暈、胸悶、血壓下降。紅外線：通過加熱碳化硅板產生的輻射熱能，由空氣傳導加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達180左右。熱效應特點是由表及里。微波：微波滅菌主要是因其熱效應。微波加熱

18、升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強。熱效應特點是由里及表。不同性質的物品吸收微波的能力不同，其熱效應和消毒效果也不同。微波有一定穿透力，但不強。微波對人體有害，要注意防護。60Co滅菌：放射性同位素60Co（或137Cs）衰變時可放射出射線，射線的能量高、穿透力強，可使細胞內各種活性物質發生化學變化，從而使細菌損傷或死亡。經60Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5，故又稱“冷滅菌”。60Co輻射存在兩個方面的安全問題：一是輻射的直接作用。射線對人體細胞同樣有害；二是經過輻射的食品、藥品的安全性。附錄：1藥品生產潔凈室（區）的空氣潔凈度等級（GMP1998）潔凈度級別 塵粒最大允許數（個/m

19、3） 微生物最大允許數 0.5m 5m 浮游菌（個/m3） 沉降菌（個/皿）100級 3,500 0 5 110,000級 350,000 2,000 100 3100,000級 3,500,000 20,000 500 10300,000級 10,500,000 60,000 15 注：我國GMP1998附錄規定：“潔凈室（區）在靜態條件下檢測的塵埃粒子數、浮游菌數或沉降菌必須符合規定，應定期監控動態條件下的潔凈狀況。”因此，潔凈室（區）空氣潔凈度的測定要求為靜態測試，動態監控。對塵粒和微生物中的兩項測定指標，至少各測一項。空氣潔凈度為100級的潔凈室，室內大于等于5m塵粒的計數，應進行多次

20、采樣，當某一測試值多次出現時，該值方可認可。測試按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法。2水和一些物料的衛生學（法定）標準： 飲用水 某些輔料# 二部片劑 二部膠囊劑% XX霜*細菌總數 100/ml 1000/g 1000/g 1000/g 100/g霉菌、酵母菌數 100/g 100/g 100/g 10/g大腸桿菌 3/100ml NC沙門氏菌 NC NC NC NC銅綠假單胞菌 NC NC NC 金黃色葡萄球菌 NC NC NC 注：#：包括有乳糖、藥用炭、淀粉、葡萄糖、糊精。%：XX膠囊屬中藥制劑，含胎盤粉，按中國藥典2000版一部規定，還不得檢出沙門菌。*：XX霜

21、屬中藥制劑，用于創傷、燒傷，故要求細菌總數100個/g、霉菌數10個/g。說明：表示每1g或每1ml不得檢出。NC：表示無規定。可不檢查。無菌操作無菌操作：一般指在無菌環境下，使用無菌制品或無菌器材進行操作的過程，能防止微生物污染與干擾的一種常規操作方法。目的：一是保證待用物品不被環境中微生物污染，二是防止樣品中的微生物在操作的過程中污染環境或感染操作人員。注意事項：1、操作中不應大幅度或快速動作，以免擾動空氣中的塵埃顆粒。2、使用玻璃器皿輕取輕放，避免破損，以防培養物擴散。操作進行前，75%酒精擦拭無菌操作臺面，配制好的新潔爾滅對無菌間及緩沖間空氣進行噴霧，拖洗地面，無菌室風機應運行30分鐘

22、以上，紫外照射30分鐘以上，無菌操作臺紫外照射30分鐘以上，空吹30分鐘以上，操作人員才能進入。進入及離開時，兩扇門不能同時打開，控制空氣對流，減少外界臟空氣中的微粒、灰塵進入無菌間。所有帶入無菌間的物品必須經過滅菌處理，先放于內部緩沖間，開啟紫外照射殺菌30分鐘以上；操作前用新潔爾滅對其外部進行消毒后搬入無菌操作間，在搬上凈化工作臺時，必須使用75%酒精將其外部再次進行擦洗消毒。 進入無菌間的操作人員必須用肥皂或洗手液清洗雙手及手腕，在外緩沖間更換白大褂，更換無菌拖鞋，操作人員不得留長指甲，不得化妝，不得佩戴首飾，平時做好個人衛生。進入內緩沖間后新潔爾滅清洗雙手及手腕，更換無菌服，戴好口罩，

23、不得將頭發暴露于外，再次更換拖鞋，進入無菌操作間，使用75%酒精對雙手及手腕消毒后方可進行無菌操作。每次使用一次性耗材前檢查其包裝完整性，外包裝有破損的耗材暫停使用。每次取用試劑前目測其顏色和質地是否正常，對于有疑問的試劑暫停使用。所有操作必須在火焰下進行，培養基在未用前，不要過早開瓶。小心取用無菌之物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作。在接種前將培養好的無菌平皿放于凈化臺臺面上，打開皿蓋的2/3，接種完畢后蓋好皿蓋，放入培養箱中進行培養，用于檢測接種時的空氣質量，保證接種環境符合要求；將滅菌過的料液進行無菌平皿涂布培養，檢測料液是否滅菌徹底；將原菌取少量在無菌平皿上進行涂布培養。一旦染菌，便于查找原因。無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如酒精燈、接種針等可以暫時放置，操作完畢后，將所有帶入的物品帶出工作間（帶菌物品必須經滅菌后才可處理），75%酒精擦拭無菌操作臺面，新潔爾滅空氣噴霧，拖工作間及內緩地面，開啟紫外照射30分鐘以上。每周清潔一次無菌操作間：先用純水，再用新潔爾滅擦拭工作臺面、儀器設備表面、墻壁及天花板、地面（擦兩遍以上），并用甲醛熏蒸過夜消毒（*注：清潔時從上到下，從內到外，從潔凈區到非潔凈區），次日擺放培養好的無菌平板進行檢查，不合格要重新清潔、消毒，直至合格。98版GMP潔凈