1、肝星狀細胞分離培養及鑒定的試驗方案肝星狀細胞分離培養及鑒定的試驗方案肝星狀細胞分離培養及鑒定的試驗方案V:1.0精細整理，僅供參考 肝星狀細胞分離培養及鑒定的試驗方案日期：20 xx年X月肝星狀細胞（hepatic stellate cells,HSCs）分離培養及鑒定的試驗方案【試驗原理】在用循環灌注法去除肝膠原組織后,根據HSC內含富含脂滴,密度較輕,它與肝臟內其它細胞在不同密度的離心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度離心方法(連續性和非連續性兩種)使HSC存在于 一高度提純的區帶中而得以分離。【試驗動物】 雄性清潔級Sprague-Dawsey大鼠（購自浙江省實驗動物中心,合格證號：

2、）,體重400500g,常規飼料喂養,正常飲水,在分離HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。【試劑與儀器】主要試劑型膠原酶、鏈霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均為美國Sigma公司產品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培養干粉(高糖型)為Gibco公司產品,鼠抗人Desmin抗體SP試劑盒為福州邁新生物工程公司產品,其它試劑均為國產分析純試劑。主要儀器設備蠕動恒流泵、超凈工作臺(2臺)、電子分析天平、超速低溫離心機、二氧化碳培養箱、多功能動物手術臺等。【試驗方法】肝星狀細胞的分離制備肝星狀細胞的分離采用改良的Friedman方法,大鼠術前禁食12

3、16h,自由飲水。用1戊巴比妥鈉40mg/kg 腹腔內注射麻醉大鼠。胸腹部皮膚消毒,移入超凈工作臺中。沿腹部正中線剪開腹腔,分離下腔靜脈及門靜脈,在門靜脈距肝外10mm處用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,結扎固定。接通恒流蠕動泵,灌注預熱37的D-Hanks肝臟灌流液,剪開下腔靜脈,此時可見灌流液自下腔靜脈流出,肝臟逐漸飽滿,由紫紅色逐漸變成淡黃白色。游離肝臟,保留下門靜脈血管插管及下腔靜脈的標志縫線。將游離之肝臟置于平皿中,灌注預熱37的含酶Hanks液I(含的膠原酶、鏈霉蛋白酶溶液并調PH ,并將灌注系統進液端放入平皿中,使流出的酶液可進行循環灌流,可見肝臟變軟無彈性,肝包膜下出

4、現小液泡。倒除灌流液,撕去肝臟外膜,撕碎或剪碎肝組織,加入預熱37的含酶HankS液(含的膠原酶、鏈霉蛋白酶、DNA酶I溶液并調PH ,再次消化20min。經200目濾網過濾,用磨錘輕輕研磨,并用4的HankS液沖冼。將燒杯內細胞懸液分裝入2只50 ml的刻度離心管,550r/min 離心8min；吸除上清入2只50 ml的刻度離心管,1750 r/min 離心8min。去上清,用4的HankS液沖冼重懸,2管合1定容至10 ml。加入20 ml的18 Nycodenz,將細胞懸液分裝入6只10 ml帶蓋的刻度離心管中,每管液面覆蓋23 ml的HankS液,3200 r/min 離心15 mi

5、n。吸取中間細胞懸液層入50 ml刻度離心管,加入無血清DMEM培養液至50 ml,550 r/min 離心8 min,取沉淀。加入預熱37的含血清的DMEM完全培養基至10ml。2、 肝星狀細胞的鑒定1)光鏡下觀察新分離的肝星狀細胞含有豐富的脂滴,細胞透光度增加。2)維生素A 自發熒光鑒定：熒光顯微鏡下觀察,在328 Bin波長的紫外光激發下,新分離的肝星狀細胞能發出藍綠色的自發熒光,但在數秒內迅速減退。3）新鮮肝星狀細胞產量測定倒置相差顯微鏡下,使用血細胞計數板計數肝星狀細胞產量。4）肝星狀細胞活力的鑒定常規臺盼藍拒染法5)免疫組織化學(簡稱免疫組化)法鑒定Desmin陽性的細胞：用鼠抗人

6、Desmin抗體,SP法做免疫細胞化學染色。3、肝星狀細胞純度的鑒定：倒置顯微鏡下于細胞片上隨機數200個細胞,計數Desmin染色胞漿黃色的細胞,并計算純度。肝星狀細胞純度()=Desmin陽性的細胞細胞總數100。4、肝星狀細胞的培養1）原代培養用含20(體積分數)胎牛血清的DMEM完全培養基稀釋細胞懸液,留取少量的細胞進行細胞純度及活力鑒定。以11051 106 ml 的密度接種到50ml塑料培養瓶中,在37、體積分數為5co：、95潮濕空氣的C02恒溫培養箱里培養。培養瓶內細胞24 h后首次換新鮮DMEM培養液,以后每3 d換液1次,培養液改為含10胎牛血清的DMEM完全培養基。2）傳代培養原代培養星狀細胞長滿單層后,吸去培養基,025胰蛋白酶于37消化1015 min。等細胞附著松動,顯微鏡下觀察細胞質邊緣卷起,間隔加大,便終止消化。吸去胰蛋白酶,用Hanks液清洗1次。加入3 ml DMEM,反復吹打培養瓶壁制成單個細胞懸液,收集細胞懸液,1 500 rmin 離心10 min,離心2次后加入含10胎牛血清的DMEM重懸,以2 X 105個/ml 濃度。注意事項（1）灌注速度要恒定在10ml/min，防止血栓的形成，影響以后的消化。（2）灌注液的PH要準確控制在PH ，減輕對HSC的