1、實時熒光定量PCR技術的實驗研究摘要實時熒光定量pr技術是在普通pr定性技術根底上開展起來的核酸定量技術,已廣泛應用于不同研究領域。闡述了熒光定量pr技術的根本原理、主要類型和定量實驗方法,討論了實驗條件的控制、影響因素和優化實驗結果的方法。關鍵詞熒光定量pr技術;原理;主要類型;定量方法;優化abstratreal-tiefluresentquantitativeprisanekindfnuleiaidquantitativetehnique,hihdevelpsintheprqualitativetehniquebase.ithasbeenidelyusedindifferentresea

2、hepaper,theexperientpriniples,theaintypesandquantitativeethdsfthistehnlgyeredesribed.thentrlfexperientalnditins,affetingfatrsandptiizatinfexperientalresultseredisussed.keyrdsreal-tiefluresentquantitativepr;priniple;aintypes;quantitativeethd;ptiizing實時熒光定量pr技術于1996年由美國appliedbisystes公司推出,

3、該技術不僅實現了pr從定性到定量的飛躍,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強、能實現多重反響、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點1。目前,該技術已廣泛應用于分子生物學、醫學等學科和根底研究領域,特別是在現代農業轉基因作物的定性檢測、品系鑒定、轉基因成分含量的檢測中發揮著重要作用2。1熒光定量pr技術的原理熒光定量pr技術是在pr反響體系中參加熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個pr進程,最后通過標準曲線對未知模板進展定量分析的方法3。由于常規pr無法對擴增反響進展實時檢測,需借助凝膠電泳等手段對擴增終產物進展定性和半定量分析,不僅費時、費事、易污染,且無法對起始模板準確定量。熒光定

4、量pr技術是在反響體系中參加熒光基團,熒光基團發出的熒光信號隨著反響進程而變化,每經過一個pr循環反響,定量pr儀搜集1個熒光強度信號,通過熒光強度變化檢測產物量的變化,從而得到1條熒光擴增曲線,熒光擴增曲線一般由基線、指數擴增期和平臺期組成4。只有在熒光信號指數擴增階段,pr產物熒光信號的對數值與起始模板量之間存在線性對應關系,才可以在這個階段進展定量分析。為了便于對所檢測樣本進展比擬,在熒光定量pr反響的指數期,需要設定1個熒光信號的閾值(threshld)。熒光閾值是熒光擴增曲線上人為設定的一個值,熒光閾值的缺省設置是315個循環的熒光信號的標準偏向的10倍,用它可以定義樣本的循環閾值(

5、ylethreshld,t)。t值是pr擴增過程中,反響管的熒光信號到達設定閾值時的循環次數。可見,t值取決于閾值。經數學證明5,每個模板起始拷貝數的對數與t值存在線性關系。起始拷貝數越多,t值越校利用起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,只要獲得未知樣品的t值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數6。2熒光定量pr技術的主要類型熒光定量pr所使用的熒光化學材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以sybrgreen為主要代表,是非特異性熒光化學材料。熒光探針包括taqan、分子信標、熒光標記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。2.1sybrgreensybrgreen是一種可以與雙

6、鏈dna小溝結合的染料。在游離狀態下,sybrgreen發出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈dna結合,其熒光強度大大增強。因此,一個反響發出的全部熒光信號與出現的雙鏈dna量成正比,可以根據熒光信號檢測出pr體系中的雙鏈dna的數量7。其優點是檢測方法簡單,通用性好,價格相對較低,是許多實驗室開展熒光定量實驗的首眩sybrgreen的缺點在于它可以和所有的雙鏈dna相結合,因此由引物二聚體、單鏈二級構造、非特異性擴增產物引起的熒光信號會影響定量的準確性。但可以通過優化pr的反響條件、選擇設計良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產物的產生;另外,也可以通過對擴增產物的溶解曲線進展分析來判斷熒

7、光信號的真實性。2.2taqan探針taqan探針技術是有美國perkineler(pe)公司研制的一種實時pr定量技術,在pr擴增參加一對引物的同時參加1個特異性的熒光探針,此熒光探針為一個3045bp的寡核苷酸,它設計為與目的序列上游引物和下游引物之間的序列配對,其5端標記熒光發射基團,3端標記熒光淬滅基團。當探針保持完好時,3端淬滅基團抑制了5端發射基團的熒光發射。但在pr擴增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時與模板結合,在引物的介導下,沿模板向前延伸至探針結合處,發生鏈的置換,taqdna聚合酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光發射基團從探針上切割下來,游離于反響體系中,從而脫離

8、3端熒光淬滅基團的屏蔽,承受光刺激發出熒光信號。由于被釋放的熒光基團數目和pr產物數量是相對應關系,且熒光強度同被釋放的熒光基團的數目也是正比關系,因此該技術可對模板進展準確定量8。taqan探針技術特異性好、準確性高、假陽性低、重復性比擬好。但是需要設計特異性的探針,因此本錢較高9。2.3分子信標分子信標技術是一種呈發夾構造的莖環狀雙標記寡核苷酸探針,環部與靶dna序列互補,為1535bp;莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶dna無序列同源性,約8bp。在探針的5端和3端分別標記熒光發射基團和熒光淬滅基團。當溶液中的模板與分子信標結合配對時,分子信標的構象改變成鏈狀使得熒光發射基團與淬滅基團

9、分開,當熒光基團被激發時,就發出熒光信號。與探針互補的靶分子數量越多,熒光信號也就越強,從而實現了對目的基因的定量檢測。分子信標的方法優點是特異性強,熒光背景低。其缺點是設計困難,雜交探針不能完全與模板結合,穩定性較差,價格高10。3熒光定量pr技術的定量方法實時熒光定量pr技術是dna定量技術的一次飛躍。運用該技術,可以對dna、rna樣品進展定量和定性分析。定量方法包括絕對定量和相對定量。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度;后者可以對不同方式處理的2個樣本中的基因表達程度進展比擬。3.1標準曲線法的絕對定量法用一系列濃度的標準品,作為模板進展pr反響,以標準品濃度的對數值為橫坐標,以

10、測得的t值為縱坐標,繪制標準曲線,在一樣條件下檢測未知樣品的t值,從而根據標準曲線計算出未知樣品的濃度(拷貝數)。制作1個好的標準曲線對定量結果至關重要,在制作標準曲線時,應至少選擇5個稀釋度的標準品,涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現的全部濃度范圍,最好與目的基因有較高的同源性;絕對定量標準品通?？梢允羌兓馁|粒dsdna,體外轉錄的rna,或者是體外合成的ssdna、標準品的量可根據260n的吸光度值并用dna或rna的分子量轉換成其拷貝數來確定。3.2雙標準曲線法的相對定量法在某些不需要對基因進展絕對定量、只需要確定基因相對表達差異的情況下,如某基因在經過某種處理后表達量是增加了還是減少了

11、,用相對定量的方法就可以得到結果。雙標準曲線法是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因,并用目的基因和管家基因的標準品分別作出標準曲線,處理與未處理樣品同時擴增目的基因和管家基因,獲得t值,然后從各自的標準曲線上求出初始模板量,經管家基因均一化處理后,求出目的基因的相對含量。定量的表達是相對于某個參照物的量而言的,因此相對定量的標準曲線就比擬容易制備,對所用的標準品不需要知道絕對拷貝數,只要知道其相對稀釋度即可。通常選用的管家基因有gapdh、-atin、2-微球蛋白和rrna。此方法在擴增效率較低、目的基因與管家基因擴增效率有差異時適用,且需要很準確的結果計算。3.3比擬t法的相對定量

12、法假如反響條件控制較好,擴增效率較高,目的基因和管家基因的擴增效率根本一致,這時就不需要作標準曲線,而是通過與管家基因t值之間的相差來計算目的基因的表達差異。比擬t法運用了數學公式來計算相對量,前提是假設每個循環增加1倍的產物量,根據數學推導得出:目的基因的量=2-t在該公式中,t=(t目的基因-t管家基因)實驗組-(t目的基因-t管家基因)對照組。因此,2-t表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數,使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量,而不必制作標準曲線11。4熒光定量pr技術實驗條件的優化定量pr技術已經在生物學研究中得到了廣泛的應用,技術也日臻完善,并且敏感

13、度極高,特異性強;正因為敏感度高,很容易受其他因素的影響,因此要得到準確可靠的反響結果,必須根據不同的反響類型優化實驗條件,如特異性探針及引物的設計、選擇適宜的g2+濃度、引物和探針濃度、循環數等,標準操作步驟,并仔細配制pr反響體系。4.1引物及探針一是設計要求。引物設計是實時定量pr中最重要的一步,擴增片段長度根據技術的不同有所區別:sybrgreeni技術要求擴增片段不大于500bp,taqan探針技術要求擴增片段長度在50150bp。引物序列選取應在基因的保守區段并具有特異性,長度一般為1824bp,防止引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對,引物自身不能形成環狀發卡構造,熔解

14、溫度t值在5565,g含量在40%60%,上、下游引物之間的t值相差不要超過4。在taqan探針的設計上要求絕對保守,長度為3045bp,t值在6870,探針的5端不能為g和防止多個堿基同時出現,探針應盡可能靠近上游引物。二是濃度。引物和探針的濃度也會影響反響的特異性,引物濃度太低會致使反響不完全,引物濃度太高會導致非特異性產物擴增。最正確的引物濃度一般在0.10.6l/l,探針的濃度在0.050.30l/l,可以在這個根底上再進一步優化,以到達引物探針整體的最正確濃度。三是穩定性。一般從生物技術公司定制引物是以干粉形式運輸的,使用時最好用te溶液溶解,使其最終濃度為100l/l,-20保存。

15、純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高,且保存時間可以長達1年以上。由于反復凍融易導致探針降解,在確認探針質量好的情況下,最好稀釋成2l/l(10),作為工作濃度分裝多支,避光保存。四是退火溫度。退火溫度一般設定比引物的t值低5。在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火;同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度一般為5570。4.2模板質量與濃度模板的質量會影響pr擴增的效率。模板應在-20保存,防止反復凍融。用te溶液溶解和稀釋模板,這能大大延長保質期。模板濃度應根據t值選擇,使t值位于1530個循環比擬適宜,假設t值大于30,那么應進步的模板濃度;假如小于15,那

16、么應降低的模板濃度。4.3鎂離子濃度g2+是影響taq酶活性的關鍵因素。g2+的濃度過高,會增加非特異性擴增,降低忠實性;g2+的濃度過低影響taq酶發揮最正確活性。一般來說,對以dna或dna為模板的pr反響,應選擇25l/l濃度的g2+。4.4循環數一般的實時定量pr反響只需2530個循環便可獲得滿意的結果,但是對于那些極微量的待測樣本而言,適當增加循環數可以進步反響的檢出底限,建議循環數為40個,但是并非循環數增加的越多,其敏感性就會越高。實際上,當循環數增加到某一值時,敏感性便不再升高。4.5重復實驗和陰性、陽性對照定量實驗,誤差是不可防止的,設立重復實驗,對數據進展統計處理,可以將誤

17、差降低到最小,因此定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上。為了增加pr擴增反響的可信度,在擴增的同時,需進展陰性、陽性對照反響。陰性反響中不加模板dna,而以水或緩沖液代替,用于檢驗是否存在pr污染。陽性對照那么用于檢驗pr試劑和實驗操作上可能出現的問題。相對來說,儀器、pr試劑、sybrgreen染料是很穩定的,而操作和模板是薄弱環節,模板的參加量一定要準確,為確保實驗數據的有效性,每個樣品至少平行做3次重復。使用微量移液器時,假如不仔細,就會產生較大的用量誤差甚至錯誤。在實驗過程中應當防止室溫下混合各種試劑,應在冰上進展,防止所配體系產生氣泡,并且在一經混合后立即開場進展擴增。5結語通過設計

18、針對目的基因的特異性引物和探針,并優化反響體系和控制反響條件,可以成功地建立快速、靈敏、特異的熒光定量pr檢測方法,實現大樣本同時檢測,節省大量的時間和反響本錢。隨著基因科學技術的開展,熒光定量pr技術將會深化和拓展,在現代農業中得到更廣泛的應用。6參考文獻1ikaelka,jsea,artinb,etal.thereal-tieplyerasehainreatinj.leularaspetsfediine,2022(27):95-125.2lerats,vinentl.real-tieplyerasehainreatinquan-tifiatinfthetransgenesfrrundupr

19、eadyrnandrundupreadysybeaninsilsaplesj.jurnalfagriulturalandfdhei-stry,2022,53(5):1337-1342.3agindtanb,shielpj,bergerph.siultaneusdetetinfptatviruses,plrv,pva,pvxandpvyfrdrantptattubersbytaqanreal-tiert-prj.jvirlethds,2022(142):1-9.4shubertj,fithevav,sztangret-isnieskaj.diff-erenti-atinfptatvirusystrainsusingiprvedsetsfdiagnstipr-priersj.jvirlethds,2022(140):66-74.5singhrp,niex,singh.duplexrt-prreagentnentratinsatreversetransriptinstageaffettheprperfranej.jvirlethds,2000(86):121-129.6keld,henz,yungk.areliabil