1、第六章芳酸類非甾體抗炎藥物的分析 第六章芳酸類非甾體抗炎藥物的分析 典型藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 鑒別試驗特殊雜質(zhì)及其檢查法含量測定4123體內(nèi)藥物分析5第六章熟悉: 主要芳酸類非甾體抗炎藥物雜質(zhì)的結(jié)構(gòu),危害,檢查方法與限度 了解: 影響芳酸類非甾體抗炎藥物穩(wěn)定性的主要因素,體內(nèi)樣品與臨床監(jiān)測 掌握: 芳酸類非甾體抗炎藥的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 主要芳酸類藥物的鑒別,檢查和含量測定的原理與特點 概述結(jié)構(gòu)特點藥物特點理化特性分析方法作用臨床基本結(jié)構(gòu)基本性質(zhì)鑒別,檢查含量測定;體內(nèi)分析抗炎, 抗風濕, 止痛, 退熱 關節(jié)炎, 發(fā)熱, 慢性疼痛芳基取代羧酸游離羧基和苯環(huán)酸性; 水解性; 光譜特性基團(酚)/元素 (硫)

2、特性Fe3+; UV, IR, LC中間體或水解產(chǎn)物酸堿滴定; UV; HPLC體內(nèi)過程與分析非甾體抗炎藥(NSAIDs)是一類不含有甾體骨架的抗炎藥, 是目前臨床使用最多的藥物種類之一第一節(jié)典型藥物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、典型藥物與結(jié)構(gòu)特點 二、主要理化性質(zhì)一、典型藥物與結(jié)構(gòu)特點 羧基狀態(tài) 游離:水楊酸,阿司匹林,雙水楊酯,二氟尼柳,甲芬那酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生,吲哚美辛鹽/酯:雙氯芬酸鈉,雙水楊酯酰胺:吡羅昔康,美洛昔康 具有苯環(huán)和羧基 水楊酸 阿司匹林 雙水楊酯 二氟尼柳一、典型藥物與結(jié)構(gòu)特點 苯環(huán)結(jié)構(gòu)特征 鄰羥基苯甲酸: 水楊酸, 阿司匹林, 雙水楊酯, 二氟尼柳鄰胺基苯甲酸: 甲芬那酸二

3、苯甲酮: 酮洛芬羥基不飽和酮: 吡羅昔康, 美洛昔康雜環(huán): 吲哚美辛, 吡羅昔康, 美洛昔康特殊元素: 二氟尼柳(氟); 雙氯芬酸鈉/吲哚美辛(氯) 吡羅/美洛昔康(硫) 對乙酰氨基酚 尼美舒利二、主要理化性質(zhì) (一) 酸性較強酸性: 原料藥可在中性乙醇或甲醇,丙酮等水溶性有機溶劑中,用氫氧化鈉直接滴定雙氯芬酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生,吲哚美辛: 羧基不與苯環(huán)直接相連, 酸性較弱吡羅昔康,美洛昔康,尼美舒利,對乙酰氨基酚:酰胺結(jié)構(gòu), 無明顯酸性 pKa = 3.49 2.95 4.26二、主要理化性質(zhì) (二) 水解性酯鍵:阿司匹林/雙水楊酯酰胺鍵:吲哚美辛,吡羅昔康,美洛昔康,尼美舒利,對乙酰

4、氨基酚水解反應及其產(chǎn)物的特性反應鑒別水解可快速,定量含量測定(剩余堿量法)美洛昔康 定量過量的氫氧化鈉水解 剩余的氫氧化鈉用鹽酸回滴定美洛昔康二、主要理化性質(zhì) (三) 吸收光譜特性紫外特征光譜 :鑒別;含量均勻度,溶出度/釋放度紅外特征光譜 :鑒別酮洛芬酚羥基:對乙酰氨基酚,水楊酸與Fe3+顯色鑒別 二苯甲酮: 酮洛芬與苯肼縮合顯色鑒別 硫:美洛昔康熱分解后產(chǎn)生的硫化氫與醋酸鉛生成黑色硫化鉛鑒別(四) 基團/元素特性第二節(jié) 鑒別試驗一、與三氯化鐵反應二、縮合反應三、重氮化-偶合反應四、氧化反應五、水解反應六、特征元素反應七、光譜法八、色譜法一、與三氯化鐵反應中性或弱酸性(pH值46)條件下進行

5、, 強酸性溶液中配位化合物分解阿司匹林 加水煮沸雙水楊酯 在氫氧化鈉試液中煮沸水解生成水楊酸, 與三氯化鐵試液顯紫堇色二氟尼柳 于乙醇中與三氯化鐵試液呈深紫色 1. 水楊酸反應一、與三氯化鐵反應對乙酰氨基酚:水溶液加三氯化鐵試液顯藍紫色吡羅昔康(三氯甲烷): 與三氯化鐵顯玫瑰紅色美洛昔康顯淡紫紅色 烯醇式羥基具有酚羥基性質(zhì),與FeCl3生成紅色配位化合物2. 酚羥基反應二、縮合反應酮洛芬的二苯甲酮, 在酸性下與二硝基苯肼縮合生成橙色偶氮化合物沉淀三、重氮化-偶合反應對乙酰氨基酚酸中水解生成對氨基酚, 游離芳伯氨基與亞硝酸鈉試液重氮化, 重氮鹽再與堿性-萘酚偶合生成紅色偶氮化合物 四、氧化反應甲

6、芬那酸: 溶于硫酸, 被重鉻酸鉀氧化顯深藍色隨即變?yōu)樽鼐G色吲哚美辛: 溶液在硫酸酸性下與重鉻酸鉀溶液共熱, 被氧化顯紫色在鹽酸溶液中與亞硝酸鈉溶液反應顯綠色, 放置后漸變黃色 五、水解反應阿司匹林, 水解得水楊酸鈉與醋酸鈉, 酸化生成水楊酸白色沉淀; 并發(fā)生醋酸的臭氣雙水楊酯水解后酸化, 生成白色水楊酸沉淀;2 CH3COONa + H2SO4 2 CH3COOH +Na2SO4六、特征元素的反應氯的鑒別與堿共熱分解產(chǎn)生氯化物, 顯氯化物的鑒別反應雙氯芬酸鈉: 與碳酸鈉熾灼灰化, 加水煮沸, 濾過, 濾液顯氯化物鑒別反應 硫的鑒別經(jīng)高溫分解產(chǎn)生硫化氫氣體, 遇醋酸鉛生成硫化鉛黑色沉淀美洛昔康:

7、 試管中熾灼, 產(chǎn)生的氣體使?jié)駶櫟拇姿徙U試紙顯黑色七、光譜法(一) 紫外-可見分光光度法最大吸收波長法: 雙氯芬酸鈉溶液: 276nm有最大吸收吡羅昔康片,含量測定溶液: 243與334nm最大吸收最大與最小吸收波長法: 布洛芬及制劑氫氧化鈉溶液: 265,273nm最大吸收245,271nm最小吸收259nm肩峰 七、光譜法(一) 紫外-可見分光光度法吸光度法: 甲芬那酸鹽酸-甲醇溶液: 279與350nm最大吸收吸光度(20g/ml)分別:0.690.74與0.560.60吸光度比值法: 二氟尼柳鹽酸-乙醇溶液: 251與315nm最大吸收吸光度比值應為4.24.6 七、光譜法(二) 紅外

8、分光光度法 阿司匹林 峰位(cm-1)歸屬33002300vO-H(羧基)1760, 1690vC=O(羧酸酯和羧酸)1610, 1570, 1480, 1460vC=C(苯環(huán))1310, 1230, 1180vC-O(羧酸酯和羧酸)775Ar-H(鄰位取代苯環(huán))330023001760,16901610146013101180775八、色譜法(一) 薄層色譜法個別藥物制劑采用溶劑提取法去除輔料后IR鑒別;部分藥物制劑采用TLC鑒別: 二氟尼柳, 美洛昔康等 (二) 高效液相色譜法隨著HPLC在藥物制劑含量測定中的大量應用, 更多應用HPLC進行制劑的鑒別:阿司匹林等多種制劑均直接取含量測定項

9、下記錄的HPLC色譜圖進行鑒別 當TLC和HPLC均有收載時: 二者可任選其一 如美洛昔康片的鑒別 藥物名稱特殊雜質(zhì)游離水楊酸與有關物質(zhì)/FeCl3阿司匹林/雙水楊酯甲芬那酸二氟尼柳第三節(jié)特殊雜質(zhì)及其檢查法2.3-二甲基苯胺有關物質(zhì) 6-甲氧基-2-萘乙酮 對氨基酚和對氯苯乙酰胺A.TLC; B.HPLCGC萘普生對乙酰氨基酚一、阿司匹林與雙水楊酯(一) 阿司匹林與雙水楊酯的合成一、阿司匹林與雙水楊酯(二) 阿司匹林中游離水楊酸與有關物質(zhì)1. 游離水楊酸: 酚羥基易被空氣(氧)逐漸氧化生成淡黃,紅棕至深棕色醌型化合物1. 游離水楊酸: ChP 用水楊酸與 Fe3+ 生成紫堇色配離子的原理, 用

10、稀硫酸鐵銨溶液顯色法檢查 供試品溶液制備過程中阿司匹林水解 ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制備供試品溶液(防阿司匹林水解); 并用RP-HPLC檢查 2. 有關物質(zhì):阿司匹林中“有關物質(zhì)”系指除“游離水楊酸”外的合成原料(苯酚)及副產(chǎn)物2. 有關物質(zhì):阿司匹林 水楊酸 乙酰水楊酰水楊酸a:阿司匹林供試品(10mg/ml)；b:0.5%自身對照(50g/ml)；c: 0.05%自身對照(靈敏度試驗5g/ml)；d:水楊酸對照(10g/ml)；e:空白原料：0.1%；阿司匹林片：0.3%；阿司匹林腸溶片：1.5%；阿司匹林栓：3.0%（HPLC法）注意：通常,制劑不再檢查原料藥項下的有關雜質(zhì)

11、。但阿司匹林制劑的生產(chǎn)中也易引入水楊酸。因此阿司匹林制劑也需控制水楊酸限量。一、阿司匹林與雙水楊酯(三) 雙水楊酯中游離水楊酸利用水楊酸與三價鐵生成有色配離子的原理, 用硝酸鐵溶液顯色, 在530nm的波長處測定吸光度, 限度為0.5%; 雙水楊酯片同法檢查, 限度為1.5% 二、甲芬那酸(一) 合成工藝 甲芬那酸主要以鄰-氯苯甲酸(o-chloroben- zoic acid)和2,3-二甲基苯胺(2,3-dimethyl- aniline)為原料, 在銅的催化下縮合而成 二、甲芬那酸(二) 2,3-二甲基苯胺的檢查 ChP曾采用HPLC法檢查: 單一雜質(zhì)的限量為0.1%雜質(zhì)總量為0.5%C

12、hP2010規(guī)定HPLC法檢查: “有關物質(zhì)”GC檢查: 2,3-二甲基苯胺(0.01% ) 三、二氟尼柳(一) 合成工藝 原料(I) : 2,4-二氟苯胺中間體(II): 2,4-二氟聯(lián)苯中間體(III) : 4-(2,4-二氟苯基)苯乙酮中間體(IV) : 4-(2,4-二氟苯基)苯酚乙酯中間體(V): 4-(2,4-二氟苯基)苯酚產(chǎn)品(VI): 二氟尼柳三、二氟尼柳(二) 有關物質(zhì)A和B的檢查 1. 有關物質(zhì)A的檢查TLC(正相): 極性較小的雜質(zhì)單一雜質(zhì)的限量為0.5%2. 有關物質(zhì)B的檢查HPLC(反相): 極性較大的雜質(zhì)各面積的和為0.5%四、萘普生 (一) 合成工藝 原料(I)

13、: 2-萘甲醚中間體(II): 6-甲氧基-2-乙酰萘(6-甲氧基-2-萘乙酮)中間體(III): 2-羥基-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸產(chǎn)品(IV): 萘普生 四、萘普生(二) 6-甲氧基-2-萘乙酮及其它有關物質(zhì)1. 溶液制備 供試品溶液: 0.5mg/ml流動相溶液 對照品溶液: 6-甲氧基-2-萘乙酮(雜質(zhì)I), 50g/ml 對照溶液: 供試品溶液1ml + 對照品溶液2ml200ml2. 限度 雜質(zhì)I: 不得大于雜質(zhì)I峰面積(0.1%) 其他單個雜質(zhì): 不得大于雜質(zhì)I峰面積的2倍(0.2%) 各雜質(zhì)總量: 不得大于對照溶液中萘普生峰面積(0.5%) 五、對乙酰氨基酚 (一) 合

14、成工藝 (二) 有關雜質(zhì): 對硝基酚,對氨基酚,對氯苯胺,對氯苯乙酰胺,o-乙酰 基對乙酰氨基酚,偶氮苯,氧化偶氮苯,苯醌和醌亞胺 1. 對氨基酚及(其它)有關物質(zhì)HPLC 對氨基酚: 0.005% 有關物質(zhì): 單個0.1%; 總量0.5%2. 對氯苯乙酰胺(極性較小)HPLC (0.005%) 第四節(jié) 含量測定一、酸堿滴定法二、紫外-可見分光光度法三、高效液相色譜法一、酸堿滴定法酸堿滴定法水解后剩余量滴定法阿司匹林 USP, BP, JP非水溶液滴定法吡羅昔康具有吡啶環(huán), 顯堿性, 可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定 剩余量滴定法美洛昔康水及與水混溶的有機溶劑中難溶,溶于氫氧化鈉滴定液后鹽酸

15、回滴定 直接滴定法水楊酸,阿司匹林,雙水楊酯,二氟尼柳,甲芬那酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生,尼美舒利(一) 直接滴定法1. 測定法本品約0.4g, 精密稱定, 加中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴, 用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定T=18.02mg2. 討論滴定在不斷振搖下稍快進行, 防阿司匹林水解受阿司匹林的水解產(chǎn)物水楊酸及醋酸的干擾3. 應用水楊酸,阿司匹林,雙水楊酯,二氟尼柳,甲芬那酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生及尼美舒利(二) 剩余量滴定法1. 原理美洛昔康含有與羰基共軛的烯醇式羥基, 具有羧酸性質(zhì), 可用氫氧化鈉滴定液滴定本品甲醇,乙醇,丙酮及水中難溶

16、, 定量過量的氫氧化鈉滴定液溶解后, 用鹽酸滴定液回滴定2. 測定法本品約0.4g, 精密稱定, 精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L) 25ml, 微溫溶解, 加中性乙醇(對溴麝香草酚藍指示液顯中性)100ml與指示液10滴,用鹽酸滴定液(0.1mol/L) 滴定; T=35.14mg(三) 水解后剩余量滴定法1. 原理阿司匹林酯結(jié)構(gòu)在堿性溶液中易水解, 加入定量過量的氫氧化鈉滴定液, 加熱使酯鍵水解后, 再用硫酸滴定液回滴定剩余的氫氧化鈉滴定液2NaOH + H2SO4Na2SO4 + 2H2O2. 測定法(USP32-NF27)本品約1.5g,精密稱定,加氫氧化鈉滴定液(0.5mol/

17、L) 50.0ml,緩緩煮沸10min,放冷,加酚酞指示液,用硫酸滴定液(0.25mol/L)滴定; T=45.40mg(三) 水解后剩余量滴定法3. 兩步滴定法水解后剩余量滴定法的改進 阿司匹林片劑: 水解產(chǎn)物水楊酸及醋酸;穩(wěn)定劑酒石酸或枸櫞酸兩步滴定法:第1步: 中和, 中和干擾物和阿司匹林的游離羧基第2步: 水解與滴定, 水解后剩余量滴定法阿司匹林片含量測定方法(ChP2010)如下: 本品10片,精密稱定,研細,精密稱取片粉(阿司匹林0.3g),中性乙醇(酚酞指示液顯中性)20ml, 振搖, 加指示液3滴,滴加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L) 至溶液顯粉紅色, 精密加氫氧化鈉滴定液

18、(0.1mol/L) 40ml, 加熱15min, 放冷, 用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定; T=18.02mg(三) 水解后剩余量滴定法含量計算供試品中阿司匹林的含量,由水解時消耗的堿量計算第1步: 中和時, 阿司匹林的游離羧酸中和第2步: 水解后剩余量滴定法時阿司匹林與氫氧化鈉反應的摩爾比為1:1滴定度: T = 0.1(1/1) 180.16=18.02(mg/m1)片劑含量: (四) 非水溶液滴定法1. 原理（非水堿量法 ）吡羅昔康具有吡啶環(huán), 顯堿性, 可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定 2. 測定法本品約0.2g, 精密稱定, 加冰醋酸20ml使溶解, 加結(jié)晶紫指示液1滴,

19、 用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯藍綠色, 并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正T=33.14 mg/ml二、紫外-可見分光光度法(一) 直接分光光度法二氟尼柳,美洛昔康,尼美舒利制劑,對乙酰氨基酚及其部分制劑; 二氟尼柳膠囊含量測定:精密稱取內(nèi)容物適量(二氟尼柳0.1g),置100ml量瓶,加溶劑(0.1mol/L的鹽酸乙醇溶液)適量,超聲處理10min,用溶劑稀釋至刻度, 搖勻, 濾過, 精密量取續(xù)濾液5ml, 置l00ml量瓶, 用溶劑稀釋至刻度,搖勻, 在315nm的波長處測定吸光度; 另取二氟尼柳對照品,用溶劑溶解并定量稀釋制成每1ml中約含50g的溶液作為對照品溶液,同法測定

20、, 計算式中, D為供試品溶液稀釋體積(ml, D=100100/5=2000); 標示量為膠囊劑的規(guī)格(mg/粒) 二、紫外-可見分光光度法(二) 柱分配色譜-紫外分光光度法 USP32-NF27采用柱色譜分離法消除阿司匹林膠囊和栓劑中輔料及降解產(chǎn)物的干擾 柱分配色譜-紫外分光光度法不需特殊儀器, 結(jié)果重現(xiàn)性較好, 但操作較繁瑣三、高效液相色譜法阿司匹林栓的含量測定: 取本品5粒, 精密稱定, 置小燒杯中, 在4050水浴上微溫熔融, 在不斷攪拌下冷卻至室溫, 精密稱取適量(阿司匹林0.1g), 置50ml量瓶中, 加溶劑(1%冰醋酸的甲醇溶液)適量, 在4050水浴中充分振搖使阿司匹林溶解

21、, 放冷, 用溶劑稀釋至刻度, 搖勻, 置冰浴中冷卻1小時, 取出, 迅速濾過, 取續(xù)濾液作為供試品貯備液; 精密量取供試品貯備液5ml, 置100ml量瓶中, 用溶劑稀釋至刻度, 搖勻, 精密量取10l進樣分析; 按外標法以峰面積計算 流動相中添加冰醋酸是為抑制阿司匹林的解離, 消除色譜峰拖尾; 同時, 流動相及供試液中的醋酸也可抑制阿司匹林的水解D為稀釋體積(ml,D=50100/5=1000);標示量為栓劑規(guī)格(mg/支) 第五節(jié) 體內(nèi)藥物分析一、血漿中阿司匹林與水楊酸的HPLC測定法二、血漿中布洛芬的HPLC測定 與立體選擇性代謝研究 血漿中阿司匹林與水楊酸測定ASA在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為活

22、性代謝物(SA), 進一步轉(zhuǎn)化為非活性代謝物水楊尿酸及葡糖醛酸結(jié)合物在進行阿司匹林藥代動力學研究時, 要求同時監(jiān)測原形藥物ASA和活性代謝物SA 質(zhì)譜條件 離子化方式: 電噴霧(ESI)離子源, 負離子模式; 掃描方式: 多反應監(jiān)測(MRM) ASA: m/z 178.9136.8 SA: m/z 136.992.8 4-ABS(內(nèi)標物): m/z 162.9118.9 血漿中阿司匹林與水楊酸測定血漿樣品處理: 血漿200l, 置1.5ml離心管中, 加1mol/L鹽酸溶液50l和內(nèi)標溶液200l, 混勻, 加入乙酸乙酯600l, 振蕩1min, 離心(13 000 r/min)5min; 取

23、上層清液, 吹干, 加流動相300l復溶, 取10l進樣空白血漿與定量下限QC樣品色譜圖血漿中阿司匹林與水楊酸測定結(jié)果與討論 人血漿中阿司匹林和水楊酸線性范圍 2510 000ng/ml(r0.990) 定量下限(LOQ)為25ng/ml 日內(nèi)和日間精密度RSD15% 準確度RE15% 適用于阿司匹林的人體藥代動力學研究布洛芬的立體選擇性代謝 布洛芬(Ibuprofen, IBP)的左、右旋光異構(gòu)體在體內(nèi)的藥理活性及代謝過程存在顯著差異體外右旋體的藥理作用是左旋體的160倍, 體內(nèi)僅為1.4倍; 主要原因是在體內(nèi)無活性的R-(-)-布洛芬部分轉(zhuǎn)化為活性的S-(+)-布洛芬 色譜條件與洗脫程序

24、手性柱Chiralcel OJ-H柱(2504.6mm, 5m) 非手性柱SiO2柱(504.6mm, 5m) 流動相正己烷-異丙醇-三氟醋酸(96.5:3.5:0.1) 預處理流動相為正己烷-異丙醇(99.5:1) 利用柱切換技術用流動相將預處理洗脫保留時間在1.704.09min范圍內(nèi)的非手性柱流出組分正沖進入手性柱布洛芬的立體選擇性代謝血漿樣品處理: 樣品0.2ml, 加內(nèi)標溶液0.05ml, 渦旋混勻, 加0.1mol/L醋酸鈉溶液(pH 3.7)0.2ml, 渦旋混勻, 加入正己烷-異丙醇(95:5)3ml, 渦旋萃取7min, 低溫離心(3000r/min)7min, 上清液于50

25、水浴中空氣吹干; 殘留物溶于0.1ml流動相, 渦旋混勻1min, 進樣40lA.布洛芬和內(nèi)標對照品；B.空白血漿；C.空白血漿+布洛芬和內(nèi)標；D.血漿樣品1.R-(-)-布洛芬；2.S-(+)-布洛芬；3.內(nèi)標(p-BBA)布洛芬的立體選擇性代謝方法學驗證 線性范圍與定量限: 布洛芬:200.208mg/L; S-(+)-布洛芬:100.104mg/L精密度與準確度(10,2.5,0.625mg/L): 日內(nèi),日間RSD6.5%準確度: 布洛芬100.2%103.2%;S-(+)-布洛芬93.3%105.8%; R-(-)-布洛芬97.3%107.1%萃取回收率(10,2.5,0.625mg/L): 布洛芬80.0%85.9%;S-(+)-布洛芬84.1%86.6%; R-(-)-布洛芬82.2%85.6% 布洛芬的立體選擇性代謝方法應用 8名男性健康志愿者口服300mg布洛芬緩釋膠囊S-(+)-布洛芬的AUC0-t均數(shù)占布洛芬(消旋體)的60%, 是R-(-)-布洛芬的148%S-(+)-布洛芬的Cmax