1、微生物的保藏方法 微生物的保藏方法 主要內容常用的保藏方法1保藏原理2注意事項3主要內容常用的保藏方法1保藏原理2注意事項3菌種保藏的原因 通過分離純化得到的微生物純培養物，還必須通過各種保藏技術使其在一定時間內不死亡，不會被其他微生物污染，不會因發生變異而丟失重要的生物學性狀，否則就無法真正保證微生物研究和應用工作的順利進行。 菌種保藏就是根據菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續。菌種保藏的原因 通過分離純化得到的微生物純菌種保藏原理根據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態，生長繁殖受到抑制但又不

2、至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養等環境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。菌種保藏原理根據微生物的菌種生理、生化特性，在人工創造的條件美國標準生物保藏中心 ATCC是美國標準生物品收藏中心 。ATCC的成立可追溯到1925年，一個科學委員會認識到科學研究對于微生物的大量需求而萌發了創建一個微生物相關制品供應中心的想法。ATCC以生命科學領域全方位知識的獲取，分類，匯總，完善進而廣泛傳播為己任，以期為推動生物原料，生物信息，生物技術，知識產權，規范等相關領域的前沿性、合法化、實用性發揮一定的作用。 ATCC擁有目前世界上最大的、品種最豐

3、富的微生物、細胞系以及重組DNA原料，同時它也是科研工作者公認的提供世界級的可靠的研究材料的供應商。 美國標準生物保藏中心 ATCC是美國標準美國標準生物保藏中心 美國典型微生物菌種保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC) ATCC 主要從事農業、遺傳學、應用微生物、免疫學、細胞生物學、工業微生物學、菌種保藏方法、醫學微生物學、分子生物學、植物病理學、普通微生物學、分類學、食品科學等的研究。 該中心保藏有藻類111株，細菌和抗生素16865株，細胞和雜合細胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，

4、動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務。該中心保藏的菌種可出售。 美國標準生物保藏中心 美國典型微生物中國菌種保藏管理中心中國菌保會是國際認可的菌種保藏機構，下設7個全國性菌種保藏管理中心： （1）普通微生物菌種保藏管理中心；（2）農業微生物菌種保藏管理中心；（3）工業微生物菌種保藏管理中心； （4）醫學微生物菌種保藏管理中心； （5）抗生素菌種保藏管理中心； （6）獸醫微生物菌種保藏管理中心； （7）林業微生物菌種保藏管理中心。（1984 年增加） 中國菌種保藏管理中心中國菌保會是國際認可的菌種保藏機構，下設中國標準生物保藏中心

5、我國唯一的國家級工業微生物菌種資源保藏管理中心，中國微生物菌種保藏管理委員會和國際菌種保藏聯合會成員之一，隸屬于中國食品發酵工業研究院，專業從事工業微生物菌種資源保藏管理的公益基礎性資源保藏機構，負責全國工業生產與研究應用微生物菌種資源的收集、整理、鑒定、保藏、供應與國際交流。 中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）保藏各種工業微生物菌種資源包括：細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支 。中國標準生物保藏中心 我國唯一的國家級工業中國標準生物保藏中心中國農業微生物菌種保藏管理中心Agricultural Culture Colle

6、ction of Chin（ACCC） ACCC是中國國家級農業微生物菌種保藏管理專門機構,負責全國農業微生物菌種的收集、鑒定、評價、保藏、供應及國際交流任務. 庫藏菌種2490株,其中細菌1004株,放線菌69株,絲狀真菌355株,酵母菌124株,食用菌582.中國標準生物保藏中心中國農業微生物菌種保藏管理中心中國標準生物保藏中心 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心成立（英文縮寫：CGMCC，設立在中國科學院微生物研究所） 1985年，開始用于專利程序的微生物保存 1995年，獲得布達佩斯條約國際保藏中心（IDA）的資格 1995年，加入中國科學院典型培養物保藏委員會 宗旨和任務 。

7、 作為一個非贏利性、公益性、服務性技術支撐機構，CGMCC的宗旨是廣泛收集國內外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機構的名義為工農業生產、衛生健康、環境保護、科研教育提供標準化的實驗材料,在保證生物安全和保護知識產權的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務，最大限度的實現微生物資源的保護、共享和持續利用。 中國標準生物保藏中心 中國微生物菌種保藏管德國與韓國標準生物保藏中心 德國微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有9400種細菌、2400種真菌、500種酵母菌、300種質粒、500種動物細胞、500種植物細胞、170種動物雜腫瘤、600種植物病毒、90種細菌病毒等（德文，英文

8、）。 韓國國家農業生物技術研究所農業微生物菌種保藏（KACC），保藏有細菌890種、真菌1581種、酵母菌62種、cDNA 600種（英文）。 德國與韓國標準生物保藏中心 德國微生物菌物法國標準生物保藏中心 法國國家歷史自然博物館Algotheque du實驗室菌種保藏中心Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National dHistoire Naturelle（ALCP） ALCP隸屬于法國國家歷史自然博物館，主要從事于工業微生物學，應用微生物學，微生物系統分類學，培養和保藏方法等方面的研究，以及藻類等微生物的分離，鑒定，保藏工

9、作。保藏有藻類600種、細菌200種。該中心保藏的菌種可出售。 法國標準生物保藏中心 法國國家歷史自然博各國標準生物保藏中心法國巴斯德研究所LInstitut Pasteur菌物保藏中心Collection de LInstitut Pasteur Of Institut Pasteur(CIP) 加拿大國家微生物健康實驗室微生物菌種保藏中心National Microbiology Laboratory Health Canada Culture Collections（NML-HCCC）日本生物技術研究所微生物菌種保藏中心Marine Biotechnology Institute Cul

10、ture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC) 各國標準生物保藏中心法國巴斯德研究所LInstitut P微生物的保藏技術課件傳代培養保藏傳代培養保藏一、傳代培養保藏原理1優缺點2注意事項3一、傳代培養保藏原理1優缺點2注意事項3傳代培養的原理 有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。傳代培養的原理傳代培養優缺點 傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：菌種管棉塞經常容易發

11、霉；菌株的遺傳性狀容易發生變異；反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期轉種，工作量大；雜菌的污染機會較多。傳代培養優缺點 傳代培養保存法雖然簡便，但傳代培養的注意事項 傳代保存時，培養基的濃度不宜過高，營養成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。 一般地，大多數菌種的保藏溫度以5為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。 傳代培養的注意事項 傳代保存時，培養基的濃度

12、不二、冷凍保藏原理 適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，使其代謝作用停止，可達到保藏的目的。二、冷凍保藏原理 常用的冷凍保藏法液氮保藏法1低溫冰箱保存法2干冰保存法3常用的冷凍保藏法液氮保藏法1低溫冰箱保存法2干冰保存法3液氮保存法一、適用范圍 液氮溫度在-196以下,用于快速制冷,速凍,機械安裝等,一般不用于日常生活,此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變

13、異。缺點是需要特殊設備。 二、保藏方法 a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.21ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。 b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（150170）時，則不需熔封。 液氮保存法一、適用范圍c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡230分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1/min的速度冷卻至25左右，也可在2025的冰箱內緩慢冷卻3060min。e、速冷：最后浸入液氮中快速冷

14、卻至196。 這種方法適用范圍廣，而且是目前常用的較理想的，繁而高效。保藏期23年，甚至長達9年。c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4下，將熔封安瓶管在適當的微生物的保藏技術課件低溫冰箱保存法一、適用范圍 20、50或85二、保藏方法 低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。低溫冰箱保存法一、適用范圍干冰保存法一、適用范圍 70左右 二、保藏方法 將菌種管插入干冰內，再置于冰箱內進行冷凍保存。干冰保存法一、適用范圍菌種保藏的共同注意點

15、：1、嚴格的無菌操作；2、用于保存的微生物在生長前必須處于它生長良好的狀態；3、保藏過程中要防止退化的發生（不同的保藏方法，分別有不同的保存時間。） 菌種保藏的共同注意點：1、嚴格的無菌操作；注意事項要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異；要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；最好在菌液內不添加電解質（如食鹽等）；可在菌液內添加甘油（甘油管冷凍保藏法）等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言

16、，不加保護劑時更有效。原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。就動物細胞而言，應在20范圍內以1/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多注意事項要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞； 數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在35范圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在3540溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降?？傊?，首先保持原菌優良性狀長期穩

17、定，同時考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。 數微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在3三、干燥保藏法1、沙土管保存2、冷凍真空保藏三、干燥保藏法1、沙土管保存沙土管保存1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如：芽孢桿菌、放線菌等。2、方法：將菌種接種斜面，培養至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸液，加入無菌的沙土管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置冰箱保存。沙土管保存1、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏，如 沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽真空的干燥器中，然抽干后將真空干燥器的旋塞關閉即可。不用火焰封口，用時將真空

18、干燥器放氣打開取出，剩余的繼續抽真空，抽至真空后關閉旋塞保藏即可。 此法簡單易行，并可以將微生物保藏較長時間，適合一般實驗室及以放線菌等為菌種的發酵工廠采用。 沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能夠抽冰凍真空保藏 原理是首先將加有保護劑的細胞樣品先預冷，使其凍結，然后在減壓下利用升華現象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用于絕大多數微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存。冰凍真空保藏 原理是首先將加有保護劑的細 達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態，生命

19、活動處于休眠，可以達到長期保藏的目的。 用冰升華的方式除去水分，手段比較溫和，細胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均不錯，而且經抽真空封閉的菌種安瓿瓶的保存、郵寄、使用均很方便。因此冷凍真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法。 達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉注意事項 a、冷凍干燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜；菌齡以達到對數生長期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好；菌液濃度以高為好，如細菌應達到1091010/ml。b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封

20、入標簽。c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，60恒溫干燥。d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。注意事項 a、冷凍干燥前的培養條件：首先檢驗總結 除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方法還有很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。 由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應性，迄今為止尚沒有一種方法被證明對所有的微生物適宜。 因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現有條件等進行綜合考慮。對一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失。總結 除上述方法外，各種微生物菌種保藏的方樹立質量法制觀念、提高全員質量意識。9月-229月-22Sunday, September 25, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。