1、Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.基因工程復習歸納第一章 緒論1.基因工程的定義：是指按照人們的愿望，經過嚴密的設計，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體/宿主）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳、并表達出新的性狀的技術。2.基因工工程概念念的發展展：遺傳工工程DNAA重組技技術分子/基因克克隆（MMoleecullar/Genne基因工工程基因操操作。應用領領域以“基因工工程”、“DNAA重組”為主基因工程基基因工程程的歷史史性事件件1973：B

2、oyyer和和Cohhen建建立DNNA重組組技術1978：Genneteech公公司在大大腸桿菌菌中表達達出胰島島素1982：世界上上第一個個基因工工程藥物物重組人人胰島素素上市1988：PCRR技術誕誕生1989：我國第第一個基基因工程程藥物rrhIFFN1b上上市2003: 世界界上第一一個基因因治療藥藥物重組組腺病毒毒-p553上市市3.基因工工程的三三大關鍵鍵元件基因（供體體）：外外源基因因、目的的基因載體：能將將外源基基因帶入入受體細細胞，并并能穩定定遺傳的的DNAA分子（克克隆載體體、表達達載體）。宿主（受體體）：，能能攝取外外源DNNA、并并能使其其穩定維維持的細細胞（組組織、

3、器器官或個個體）。4.基因工工程的基基本步驟驟（切、接接、轉、增增、檢（大大腸桿菌菌是中心心角色）（1）目的的基因的的獲取：從復雜雜的生物物基因組組中，經經過酶切切消化或或PCRR擴增等等步驟，分分離出帶帶有目的的基因的的DNAA片斷。 （2）重組組體的制制備：將將目的基基因的DDNA片片斷插入入到能自自我復制制并帶有有選擇性性標記（抗抗菌素抗抗性）的的載體分分子上。 （3）重組組體的轉轉化：將將重組體體（載體體）轉入入適當的的受體細細胞中。 （4）克隆隆鑒定：挑選轉轉化成功功的細胞胞克隆（含含有目的的基因）。 （5）目的的基因表表達：使使導入寄寄主細胞胞的目的的基因表表達出我我們所需需要的基

4、基因產物物。 第二章 DDNA重重組克隆隆的單元元操作一、用于核核酸操作作的工具具酶1. 限制制性核酸酸內切酶酶(主要存存在于原原核細菌菌中，幫幫助細菌菌限制外外來DNNA的入入侵)。限制性核酸酸內切酶酶的功能能與類型型主要特征I型II型III型功能限切/修飾飾限切限切/修飾飾蛋白結構異源三聚體體單體異源二聚體體輔助因子ATP MMg2+ SAAMMg2+ATP MMg2+ SAAM識別序列TGAN88TGCCTAACN66GTGGC旋轉對稱序序列GAGCCCCAGCAAG切割位點距識別序列列1kbb處識別序列內內距識別序列列下游24-266bp處處其中II型型限制性性核酸內內切酶：切割位位點

5、專一一，適于于DNAA重組，是是DNAA重組中中最常用用工具酶酶。特點：1.識別、并并切割雙雙鏈DNNA分子子中特異異序列的的DNAA內切酶酶。2.識別序序列為44-6堿堿基對的的回文對對稱結構構（旋轉轉對稱結結構）。33.單體體蛋白、僅僅有限制制性內切切酶活性性，無甲甲基化酶酶活性。44.切割割產物末末端：55突出末末端、33突出末末端、平平頭末端端.6.最適溫溫度：大大多為337,適鹽濃濃度：高高鹽、中中鹽、低低鹽。88.當反反應條件件不適合合時，識識別和切切割序列列發生變變化（星星號反應應）。星活性（sstarr acctivvityy）：在在極端非非標準條條件下，限限制酶能能切割與與識

6、別序序列相似似的序列列，這個個改變的的特殊性性稱星活活性。引起星活性性的因素素： 高濃濃度甘油油（55%）、 酶過過量（1000U/mmg）、 低離離子強度度（pH88.0)、 有機機溶劑、 用其其它二價價陽離子子代替MMg2+，如Mnn2+，CCu2+，Coo2+, Znn2+。 II型限制制性核酸酸內切酶酶的命名名具體規則是是：以生生物體屬屬名的第第一個大大寫字母母和種名名的前兩兩個小寫寫字母構構成酶的的基本名名稱，如如果酶存存在于一一種特殊殊的菌株株中，則則將株名名的一個個字母加加在基本本名稱之之后，若若酶的編編碼基因因位于噬噬菌體（病病毒）或或質粒上上，則還還需用一一個大寫寫字母表表示

7、這些些非染色色體的遺遺傳因子子。酶名名稱的最最后部分分為羅馬馬數字，表表示在該該生物體體發現此此酶的先先后次序序。例子：Esscheericcha（屬屬名）ccolii（種名名）R （質粒粒）大腸腸桿菌RR質粒EcooR I EccoR VHaemoophiiluss（屬名名） iinflluennzaee（種名名） d（株株名） 嗜血血流感桿桿菌d株株- H ii n d II H i nn d IIII。羅羅馬數字字表示同同一菌株株中所含含的多個個不同的的限制性性核酸內內切酶。特殊性質的的II型型限制酶酶：同裂裂酶，同同尾酶同裂酶：又又稱異源源同序酶酶或異源源同工酶酶，是指指識別位位點與切

8、切割位點點均相同同的不同同來源的的酶識別別相同序序列，如如HinndIIII HssuI: A / AAGCTTT同尾酶：是是指識別別位點不不同，但但切出的的片段具具有相同同的末端端序列的的一類酶酶，如BBglIII：A / GAATCTT；BammHI: G / GAATCCC。同尾酶酶的切割割產物互互為粘性性末端，并并能連接接，但連連接后二二個酶的的識別序序列均被被破壞。2.DNAA連接酶酶（T44-DNNA連接接酶）功能：體外外連接片片段常用的連接接酶： 連連接酶參與連接反反應的基基團：端羥基基和端端磷酸基基團，形形成磷酸酸二酯鍵鍵DNA連接接酶的基基本性質質 ：修修復雙鏈鏈DNAA上缺

9、口口處的磷磷酸二酯酯鍵、修修復RNNA-DDNA雜雜合分子子中DNNA鏈上上缺口處處的磷酸酸二酯鍵鍵、連接接多個平平頭雙鏈鏈DNAA分子T4 DNNA連接接酶的活活性單位位定義：在 220l 反反應體系系中于 16 ，使使 Hiind 切過過的 ll DNNA （3300g/mml，00.122M 55 末末端）在在 300 分鐘鐘內連接接 500% 所所需的酶酶量為 1 個個 NEEB 單單位。3.DNAA聚合酶酶大腸桿菌菌DNAA聚合酶酶 I（ DNAA pool II ）基本性質：1. 53的DNNA聚合合酶活性性 2. 53的核酸酸外切酶酶活性 3. 35的核酸酸外切酶酶活性大腸桿菌D

10、DNA聚聚合酶 I 的的基本用用途：1.切口口平移標標記法 2.NNickk trransslattionn 3.制備322P標記記的探針針。所有的的DNAA聚合酶酶中只有有此酶有有該反應應。缺口平平移標記記原理見見pptt。大腸桿菌DDNA聚聚合酶 I 大大片段（ Kleenoww 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenoow酶的的基本用用途：11. 補補平由核核酸內切切酶產生生的5粘性末末端 22.DNNA片段段的同位位素末端端標

11、記 3.ccDNAA第二鏈鏈的合成成 4.雙脫氧氧末端終終止法測測定DNNA序列列。T4-DDNA聚聚合酶基本特性：1.53的DNNA聚合合酶活性性和35的核酸酸外切酶酶活性(極強) 2. 在無ddNTPP時，可可以從任任何3-OHH端外切切 3.在四種種dNTTP均存存在時，聚聚合活性性占主導導地位基本用途：1.切切平由核核酸內切切酶產生生的3粘性末末端，該酶也也能降解解雙鏈DDNA，只只是其活活性比單單鏈降解解活性低低很多。22.DNNA片段段的同位位素末端端標記。依賴于RRNA的的DNAA聚合酶酶（反轉轉錄酶）基本用途：1. 以RNNA為模模板合成成cDNNA鏈 2.雙雙向外切切DNAA

12、-RNNA雜合合鏈中的的RNAA鏈4.核酸酶酶單鏈核酸外外切酶：核酸外外切酶VVII（EExoVVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（Exo）【特異性地從5 端外切】；單鏈核酸內切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5核酸修修飾酶末端脫氧核核苷酰轉轉移酶（TTdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）&大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）二、用于克克隆的載載體1. 載體體（Veectoor）：是把外外源DNNA（目目的基因因）導入入

13、宿主細細胞，使使之傳代代、擴增增或表達達的工具具。載體應具備備的條件件： 1.具有有針對受受體細胞胞的親緣緣性或親親和性（可可轉移性性）2. 具有有與特定定受體細細胞相適適應的復復制位點點或結合合位點 3. 具有較較高的外外源DNNA的載載裝能力力 4. 具有有多種單單一的核核酸內切切酶識別別切割位位點(多克隆隆位點 ) 55. 具具有合適適的篩選選標記 2.載體類類型：（1）根據據主要用用途可以以分為：克隆載載體和表表達載體體克隆載體體：主要要用于在在大腸桿桿菌細胞胞中克隆隆目的基基因，或或在大腸腸桿菌或或釀酒酵酵母細胞胞中構建建基因文文庫。克隆載體關關鍵元件件：A.多多克隆位位點 BB.篩

14、選選標記基基因 CC.復制制起始位位點 = 2 * GB3 表達載體體：除含基基因克隆隆所需元元件外，還還有供外外源基因因表達用用的啟動動子、終終止子等等順式元元件，用用于在特特定的宿宿主中表表達目的的基因。（2）按傳傳代特性性分：自主復制制型載體體：含復復制子，可可獨立于于宿主染染色體外外復制與與傳代（穿梭載體：裝有針對兩種不同受體的復制起點，便于基因克隆）。 = 2 * GB3 整合型載載體：不不含復制制子，需需借助同同源重組組機制整整合于宿宿主基因因組。3.分子克克隆載體體常用類類型：（1）質粒粒：155kb以以下 嚴緊緊型復制制控制的的質粒：1 - 5 拷貝，如如pSCC1011 松弛

15、弛型復制制控制的的質粒：30 - 550 拷拷貝，如如 CoolE11氯霉素擴增增：在宿宿主菌生生長的中中后期，通通過添加加氯霉素素抑制蛋蛋白質合合成、關關閉主要要代謝途途徑，以以使松弛弛型質粒粒 迅迅速大量量擴增（可可達上千千拷貝）的的操作。質粒載體的的特點：分子量量小，便便于操作作；易于于構建，可可作為其其他宿主主系統載載體的骨骨架；用用途廣泛泛；缺點點：裝載載量小（小小于100kb），不不能用來來克隆大大片段。重要的大腸腸桿菌質質粒載體體：pBRR3222：松弛弛型復制制；氯霉霉素可擴擴增；拷拷貝數 50 1000 / ceell；用于基基因克隆隆。還有有pUCC18/19；T載體體，詳

16、見pppt，了了解一下下。實驗室一般般使用下下列三種種方法制制備質粒粒DNAA： 氯化銫密度度梯度離離心法：質粒DDNA純純度高、周周期長、設設備要求求高、溴溴乙錠污污染；堿裂解解法（最最常用）：質粒DDNA純純度、操操作周期期介于氯氯化銫法法和沸水水浴法之之間；沸水浴浴法：質質粒DNNA純度度底、快快速、操操作簡便便。質粒的不相相容性的的分子機機制兩種含有相相似復制制子結構構的不同同質粒，在在復制時時受到同同一種拷拷貝數控控制系統統的干擾擾，致使使兩種質質粒的最最終拷貝貝數不同同，可導導致子代代細胞質質粒組成成不同，且且這種差差異具隨隨機性，經經過若干干代后宿宿主細胞胞中處于于數量弱弱勢的質

17、質粒必然然被淘汰汰，而僅僅剩強勢勢質粒。質粒載體不不穩定性性的類型型分離的不穩穩定性：在細胞胞分裂過過程中發發生的質質粒不平平均的分分配，有有的細胞胞沒有獲獲得質粒粒 DNN拷貝，并并最終增增殖成為為無質粒粒的優勢勢群體。結構的不穩穩定性：由轉位位作用和和重組作作用所引引起的質質粒DNN的重排排與缺失失。 影響質粒載載體穩定定性的主主要因素素新陳代謝負負荷對質質粒載體體穩定性性的效應應；拷貝貝數差度度對質粒粒載體穩穩定性的的影響低差差度-穩定 / 高高差度-不穩定定；寄主主重組體體系對質質粒載體體穩定性性的效應應形成成重組質質粒二聚聚體，便便會以高高出質粒粒單體分分子兩倍倍的速度度進行復復制，

18、從從而導致致出現質質粒寡聚聚體的克克隆增殖殖。（2）laamdaa噬菌體體DNAA:225kbb噬菌體是是大腸桿桿菌的溫溫和型噬噬菌體，由由外殼包包裝蛋白白和l-DNNA組成成。DNNA重組組技術一一般需要要噬菌體體進入溶溶菌狀態態-DNAA是線性性雙鏈DDNA分分子，全全長4885022個核苷苷酸。-DNAA兩端各各帶有一一個122bp的的粘性末末端，稱稱為coos位點點。噬菌菌體感染染細菌以以后，雙雙鏈DNNA分子子通過CCOS位位點成環環狀。插入型載載體：改造后后的長度度正好為為包裝的的下限，因因而本身身也能被被包裝，叫叫插入型型載體1.cI基基因失活活：cII基因失失活后將將導致噬噬菌

19、體不不能溶原原化，產產生清晰晰的噬菌菌斑。相相反，產產生混濁濁的噬菌菌斑。22. LLac Z基因因插入失失活：在在lacc Z基基因上有有EcooR II位點，插插入失活活后利用用X-ggal法法篩選（藍藍白篩選選）。 取代型載載體：長度為為40kkb，在在非必需需區域有有酶切位位點，距距離為114kbb。載量為為10-25kkb。用取代型載載體克隆隆外源DDNA可可能需要要經過哪哪些步驟驟？第一，應用用適當的的核酸內內切限制制酶消化化載體，除除去基因因組中可可取代的的DNAA區段。第二，將上上述所得得的 DNNA臂同同外源DDNA片片段連接接。第三三，對重重組體的的DN A分子子進行包包裝

20、和增增殖，以以得到有有感染性性的重組噬噬菌體。-DNAA重組分分子需在在體外人人工包裝裝成有感感染力的的噬菌體體重組顆顆粒，方方可高效效導入受受體細胞胞。-DNAA作為載載體的優優點：1. -DNNA可在在體外包包裝成噬噬菌體顆顆粒，能能高效轉轉染大腸腸桿菌 2.-DNNA載體體的裝載載能力為為25 kb，遠遠遠大于于質粒的的裝載量量 3.重組l-DNNA分子子的篩選選較為方方便 4. 重組-DNNA分子子的提取取較為簡簡便 5. -DNNA載體體適合克克隆和擴擴增外源源DNAA片段，但但不適合合表達外外源基因因。cos質粒粒：laamdaa DNNA的ccos區區和質粒粒組成的的載體: 31

21、1-455 kbb（3）考斯斯質粒載載體的特特點：1.能像-DNNA那樣樣進行體體外包裝裝，并高高效轉染染受體細細胞2.能像質質粒那樣樣在受體體細胞中中自主復復制 33.重組組操作簡簡便，篩篩選容易易 4. 裝載載量大（445 kkb）且且克隆片片段具有有一定的的大小范范圍 55.不能能體內包包裝，不不裂解受受體細胞胞.（4）人工工染色體體載體人工染色體體實際上上是一種種“穿梭”克隆載載體：含含有質粒粒克隆載載體所必必備的第第一受體體（大腸腸桿菌）源源質粒復復制起始始位點（oori），還還含有第第二受體體（如酵酵母菌）染染色體DDNA著著絲點、端端粒和復復制起始始位點的的序列，以以及合適適的選

22、擇擇標記基基因。細菌人工工染色體體（BAAC）:50-3000kb,主要要用于基基因文庫庫構建易于于發生重重組、缺缺乏穩定定性、制制備工藝藝繁瑣酵母人工染染色體（YAC）: 350-400kb，主要用于基因文庫構建克隆大型基因簇（gene cluster）結構&構建動植物基因文庫三、用于基基因轉移移的受體體菌或細細胞（1）受體體（宿主主）應具具備的條條件1.限制性性缺陷型型外切切酶和內內切酶活活性缺陷陷（hssdR-） 22. 重重組整合合缺陷型型用于于基因擴擴增或高高效表達達的受體體細胞（recA- ， recB-，recC- ）3. 具有較高的轉化效率 4. 具有與載體選擇標記互補的表型

23、5. 感染寄生缺陷型防止重組細菌擴散污染，生物武器除外。（2）各種種基因工工程受體體（宿主主）的特特性A. 大腸腸桿菌遺傳傳背景清清楚，載載體受體體系統完完備，生生長迅速速，培養養簡單，重重組子穩穩定。適適用于外外源DNNA的擴擴增和克克隆、基基因文庫庫的構建建和外源源基因的的高效表表達，是是DNAA重組實實驗和基基因工程程的主要要受體菌菌。產生生結構復復雜、種種類繁多多的內毒毒素。B. 枯草草芽孢桿桿菌遺傳背背景清楚楚，蛋白白質分泌泌機制健健全 ，生長長迅速，培培養簡單單，不產產內毒素素。遺傳傳欠穩定定，載體體受體系系統欠完完備。適適用于重重組蛋白白與多肽肽、特別別是微生生物來源源的酶的的高

24、效分分泌表達達。C.鏈霉菌菌抗生生素的主主要生產產者，相相對操作作簡便，不不產內毒毒素。遺遺傳不穩穩定，生生長相對對緩慢。主主要用于于抗生素素生產菌菌株的改改良。D. 酵母母菌具有真真核生物物的特征征，遺傳傳背景清清楚，生生長迅速速，培養養簡單，外外源基因因表達系系統完善善，遺傳傳穩定。內源性性蛋白產產物種類類繁多且且含量高高。適用于于外源DDNA的的擴增、克克隆以及及真核生生物基因因的高效效表達、基基因文庫庫的構建建、真核核生物基基因表達達調控的的研究，是是DNAA重組實實驗和基基因工程程重要的的真核性性受體菌菌。E. 昆蟲蟲細胞（家家蠶，桿桿狀病毒毒表達系系統）具有有真核生生物的特特征，外

25、外源基因因表達量量高，繁繁殖相對對較快，培培養成本本低廉，遺遺傳穩定定。DNAA重組操操作系統統欠完善善。適用于于真核生生物基因因的高效效表達。F. 哺乳乳動物細細胞（中中國倉鼠鼠卵巢細細胞 CCHO）與人的親緣關系近，表達系統完善，具有合適的糖基化修飾系統。細胞培養條件苛刻，生長緩慢。適用于哺乳類動物和人的基因表達調控研究、基因藥物的生產，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體。G . 植植物細胞胞（擬南南芥菜、煙煙葉） 農作作物的經經濟意義義重大，轉轉基因植植物細胞胞易于分分化，細細胞培養養簡單且且成本低低廉，具具有光合合作用。遺傳操操作繁瑣瑣。適用于于高等植植物基因因表達調調控的研

26、研究、基基因藥物物的生產產，農作作物品質質的改良良。實驗室常用用的基因因工程受受體（宿宿主）：大腸桿桿菌；真真菌：酵酵母菌（畢畢赤酵母母，漢森森酵母，啤啤酒酵母母）&絲絲狀真菌菌（黑曲曲霉、青青霉）；哺乳動動物細胞胞 CHOO （3）大腸腸桿菌轉轉化常用用方法感受態（ccomppenttentt )：受體(宿主）細細胞經過過一些理理化或生生物學方方法處理理后，細細胞膜的的通透性性發生暫暫時性的的改變，成成為能允允許外源源DNAA進入的的一種生生理狀態態。感受受態細胞胞（coompeenteent celll )CaCll2法原原理Ca2+誘誘導的完完整細胞胞的轉化化適用于于革蘭氏氏陰性細細菌（

27、如如大腸桿桿菌等），119700年建立立此技術術，其原原理是CCa2+與細菌菌外膜磷磷脂在低低溫下形形成液晶晶結構，轉轉化混合合物中的的DNAA與其形形成抗DDnasse的羥羥基-鈣鈣磷酸復復合物黏黏附于細細胞表面面，后者者經熱脈脈沖發生生收縮作作用，使使細胞膜膜出現空空隙，細細菌細胞胞此時的的狀態即即為感受受態。具體大腸桿桿菌感受受態細胞胞的制備備及質粒粒轉化詳詳見pppt。電轉化法法 熱激法法轉化率的定定義：每微克克DNAA分子轉轉化宿主主菌能獲獲得的轉轉化子數數。例如，pUUC188對大腸腸桿菌的的轉化率率為1008，即即每微克克pUCC18中中只有1108個個分子能能進入受受體細胞胞。

28、一微微克pUUC188共有33.4XX10111個分分子（66.022X10017 / 226866X6660），也也就是說說，每334000個pUUC188分子才才有一個個分子進進入受體體細胞。 另另一方面面，在實實際操作作過程中中，轉化化一微克克pUCC18共共需2mml感受受態細胞胞，大約約含有22X10010個個大腸桿桿菌細胞胞，也就就是說，每每2000個細胞胞只有一一個細胞胞能接納納pUCC18 DNAA。 不同轉化方方法轉化化率：Ca2+誘誘導轉化化1006 1007 / mg DDNA 原生質質體轉化化1005 1006 / mg DDNA -DNAA轉染1007- 1108 /

29、 mg DDNA 電電穿孔轉轉化106 1009 / mg DDNA 轉化子的篩篩選和鑒鑒定（檢檢）由于重組率率和轉化化率不可可能達到到理想極極限，因因此必須須借助各各種篩選選和鑒定定方法區區分轉化化子與非非轉化子子、重組組子與非非重組子子、目的的重組子子與非目目的重組組子。轉化子篩選選和鑒定定流程1、篩選選擇性性平板篩篩選2、重重組子初初步鑒定定顯色色、PCCR、比比大小、酶酶切、分分子雜交交、生物物/免疫疫學活性性3、重重組子確確證DNAA序列分分析4、外外源基因因表達產產物檢測測僅當當外源基基因克隆隆于特定定表達載載體和宿宿主中時時才需要要。常規規基因克克隆則否否。轉化子篩選選方法：抗藥

30、性篩選選法；營營養缺陷陷型篩選選法；顯顯色篩選選法laccZ基因（藍藍色反應應）、鏈鏈霉菌質質粒pIIJ7002攜帶帶的meelC基基因（黑黑色反應應）等；DNAA電泳檢檢測【直直接電泳泳檢測法法；限制制性酶切切圖譜法法；PCCR擴增增檢測法法】；原原位雜交交法（高高通量篩篩選）；DNAA序列分分析雙脫氧氧末端終終止測序序法；外外源基因因表達產產物檢測測法【聚聚丙烯酰酰胺凝膠膠電泳法法（SDDS-PPAGEE）；酶酶聯免疫疫吸附法法ELIISA；免疫印印記（WWestternn bllotttingg）；蛋蛋白質生生物功能能測定法法（高通通量篩選選）淀粉酶酶基因；原位免免疫沉淀淀法（高高通量篩

31、篩選）；放射免免疫原位位雜交鑒鑒定】四、基因克克隆基因文庫：從特定定生物個個體中分分離的全全部基因因，這些些基因以以克隆的的形式存存在（人人工構建建）。根根據構建建方法的的不同，基基因文庫庫分為：基因組組文庫（含含有全部部基因）&cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）。在高度分化的生物體中cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因克隆常常用方法法：鳥槍法基本策略：染色體體DNAA的切斷斷：超聲聲波處理理片段段長度均均一，大大小可控控，平頭頭末端；全酶切切片段段長度不不均一，粘粘性末端端便于連連接，但但有可能能使目的的基因斷斷開，大大小不可可控；部部分酶切切片段段長度可可控，含含有粘性性末端

32、，目目的基因因完整。與載體體連接：如果轉轉化子采采用菌落落原位雜雜交法或或限制性性酶切圖圖譜法篩篩選，則則選擇多多拷貝克克隆載體體；如果果轉化子子采用基基因產物物功能檢檢測法篩篩選，則則選擇表表達型載載體。轉化受受體細胞胞如果果轉化子子采用菌菌落原位位雜交法法或限制制性酶切切圖譜法法篩選，則則選擇大大腸桿菌菌作為受受體細胞胞；如果果轉化子子采用基基因產物物功能檢檢測法篩篩選，則則選擇能能使目的的基因表表達的受受體細胞胞。篩選含含有目的的基因的的目的重重組子：菌落原原位雜交交法、基基因產物物功能檢檢測法（篩篩選模型型的建立立）。cDNAA法基本策略：【cDDNA第第一鏈的的合成cDNNA第二二鏈

33、的合合成（自自身引導導法、置置換合成成法、引引導合成成法、）】/雙鏈ccDNAA的克隆隆 離目的的基因（完完備分離離程序、特特異分離離程序、差差異分離離程序）PCR法法使用PCRR法克隆隆目的基基因的前前提條件件是：已已知待擴擴增目的的基因或或DNAA片段兩兩側的序序列，根根據該序序列化學學合成聚聚合反應應必需的的雙引物物基本策略：由Taaq DDNA聚聚合酶擴擴增的PPCR產產物中，其其3末端總總是會帶帶有一個個非模板板依賴型型的突出出堿基，而而且這個個堿基幾幾乎總是是A，因因為Taaq DDNA聚聚合酶對對dATTP具有有優先聚聚合活性性。由于于該突出出堿基的的存在，克克隆時即即可以采采取

34、TddT末端端加同聚聚尾的方方法與載載體拼接接，也可可以使用用專門的的T載體體克隆。化學合成成法（全全基因合合成）基因文庫的的完備性性是指：在構建建的基因因文庫中中任一基基因存在在的概率率，它與與基因文文庫最低低所含克克隆數NN之間的的關系可可用下式式表示：N = lnn ( 1 P ) / lnn ( 1 f )其中： PP = 任一基基因被克克隆（或或存在于于基因文文庫中）的的概率，ff = 克隆片片段的平平均大小小 / 生物基基因組的的大小。基因文庫的的構建程程序1.基因組組DNAA的制備備：2.基因組組DNAA的切割割：用于于基因組組文庫構構建的DDNA片片段的切切割一般般采用超超聲波

35、處處理和制制性內限限切酶部部分酶切切兩種方方法，其其目的是是：第一一，保證證DNAA片段之之間存在在部分重重疊區；第二，保保證DNNA片段段大小均均一。連連接前，上上述處理理的DNNA片段段必須根根據載體體的裝載載量進行行分級分分離，以以杜絕不不相干的的DNAA片段隨隨機連為為一體3.載體和和受體的的選擇：出于壓壓縮重組組克隆的的數量，用用于基因因組文庫庫構建的的載體通通常選裝裝載量較較大的-DNNA或考考斯質粒粒；對于于大型基基因組（如如動植物物和人類類）需使使用YAAC或BBAC載載體。ccDNAA文庫構構建的載載體通常常選質粒粒；用于于基因文文庫構建建的受體體則根據據載體使使用大腸腸桿菌

36、或或酵母菌菌。4.從基因因文庫中中篩選目目的基因因：可以以采用特特殊的正正選擇篩篩選程序序（如抗抗藥性篩篩選法、酵酵母雙雜雜交技術術等）直直接篩選選外，一一般的基基因組文文庫篩選選均需多多輪操作作步驟。原原位雜交交法。第三章 大大腸桿菌菌基因工工程一、大腸桿桿菌表達達（生產產）系統統的優缺缺點大腸桿菌表表達系統統的優點點1.遺傳背背景清楚楚（44405個個ORFF），便便于基因因操作 2.表表達水平平高，遺遺傳較穩穩定3.優良的的工業性性能：繁繁殖迅速速、培養養簡單、操操作方便便 4. 被美國國FDAA認定為為安全的的重組藥藥物生產產系統大腸桿菌表表達系統統的缺點點缺乏翻譯后后修飾加加工系統統

37、（不能能表達糖糖基化蛋蛋白、結結構復雜雜的蛋白白等）22.胞內內缺乏高高效的表表達產物物折疊機機制（形形成包涵涵體），分分泌機制制不完善善 3.細胞周周質內含含有種類類繁多的的內毒素素二、大腸桿桿菌系統統高效表表達原理理大腸桿菌菌系統表表達載體體的基本本元件A、目的基基因：編編碼外源源蛋白的的結構基基因 BB、轉錄錄元件：啟動子子、終止止子C、翻譯元元件：核核糖體結結合位點點、翻譯譯起始位位點D、克隆元元件：克克隆位點點、復制制原點、標標記基因因E、翻譯后后元件（非非必須） ：信號號肽、融融合肽外源基因因在大腸腸桿菌中中高效表表達原理理A、啟動子子 (PPrommoteer)是DNA鏈鏈上一段

38、段能與RRNA聚聚合酶結結合并能能起始RRNA合合成的序序列。是是基因表表達最關關鍵和最強的的表達調調控元件件，啟動動子的強強弱對表表達水平平有決定定性影響響。（沒沒有啟動動子，基基因就不不能轉錄錄）。啟動子有種種屬特異異性（如如真核的的在原核核宿主中中無效），有有組成型型（組成型型表達系系統）和誘導導型（誘導型型表達系系統）二大類類。原核基因啟啟動子是是由兩段段彼此分分開且又又高度保保守的核核苷酸序序列組成成：（11）Priibnoow盒，位位于轉錄錄起始位位點上游游5110bpp，一般般由68個堿基基組成，富富含A和T，故又又稱為TTATAA盒或110區。（22）355區，位位于轉錄錄起始

39、位位點上游游35bbp處，故故稱335區，一一般由110個堿堿基組成成。常用原核基基因啟動動子：【lac (乳糖啟動子)；trp (色氨酸啟動子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子Ptac = Ptrp 的-35區+ Plac的-10區）；T7啟動子】IPTG誘導；PL和PR(噬菌體的左向和右向啟動子)溫控（熱誘導），30/37培養， 42誘導。T7啟動子子最成成功的啟啟動子 A.強大的的 T7 啟動動子完全全專一受受控于 T7 RNNA 聚聚合酶，B.T7 RNAA 聚合合酶合成成 mRRNA 的速度度比大腸腸桿菌RRNA 聚合酶酶的快 5 倍倍 C.由于大大腸桿菌菌本身不不含 TT7 RN

40、NA 聚聚合酶 ，需要要將外源源的 T7 RNNA 聚聚 合酶酶引入宿宿主菌（采采用DEE3溶源源菌，TT7RNAA聚合酶酶置于LLacUUV5啟啟動子控控制下，IIPTGG間接誘誘導）。B、終止子子轉錄過頭現現象：AA.RNNA聚合合酶滑過過終止子子結構繼繼續轉錄錄質粒上上鄰近的的 B.DNAA序列，形形成長短短不一的的mRNNA混合合物。防止轉錄過過頭策略略：A、采用用強終止止子大腸桿桿菌rRRNA操操縱子上上的rrrnT11T2TT7&噬噬菌體DDNA上上的T B、二聚聚體終止止子串聯聯的特殊殊結構C、核糖體體結合位位點（RRBS） mRNA 5端非翻翻譯序列列,包括括SD、起起始密碼碼

41、子、SSD與起起始密碼碼子間的的序列、起起始密碼碼子下游游序列。SD序列（SShinne-DDalggarnno）：位于翻翻譯起始始密碼子子上游的的6-88個核苷苷酸序列列（5UAAAGGAAGG 3），它它通過識識別大腸腸桿菌核核糖體小小亞基中中的166S rrRNAA 3端區域域3AUUUCCUUCC 5并與之之專一性性結合，將將mRNNA定位位于核糖糖體上，從從而啟動動翻譯。D、質粒拷拷貝數 策略：較低拷拷貝質粒粒（幾個個至數十十個）& 調控控重組質質粒的擴擴增E密碼子 滿足宿宿主對密密碼子偏偏愛性的的策略:外源基基因全合合成 & 同步步表達相相關tRRNA編編碼基因因三、大腸桿桿菌工程

42、程菌的構構建策略略1、包涵體體型異源源蛋白的的表達包涵體：胞胞內高效效表達時時，工程程菌因大大量合成成異源蛋蛋白質所所形成的的水不溶溶性積聚聚物。性質：致密密（密度度大于細細胞碎片片和所有有細胞器器）、還還含有標標記蛋白白、RNNA聚合合酶和少少量的DDNA、RRNA和和脂多糖糖等非蛋蛋白分子子。裸露露或被膜膜包裹。包涵體形成成原因：大腸桿桿菌細胞胞內呈“還原”型環境境，不不不利于二二硫鍵的的形成，當當高效表表達時，新新合成肽肽形成二二硫鍵的的速度和和折疊效效率跟不不上合成成速度。表達產物結結構形式式：a)部分屬屬于折疊疊過程中中的產物物；b)部分為為無序卷卷曲與聚聚集，分分子內二二硫鍵錯錯配

43、; c)分子間間存在大大量錯配配二硫鍵鍵。以包涵體形形式表達達目的蛋蛋白的優優缺點包涵體表達達形式的的優點：、便于表表達產物物分離包涵涵體的水水難溶性性及其密密度遠大大于其它它細胞碎碎片和細細胞成分分，菌體體經超聲聲波裂解解后，直直接通過過高速離離心即可可將重組組異源蛋蛋白從細細菌裂解解物中分分離出來來、利于表表達產物物在宿主主細胞內內穩定存存在在形成成包涵體體之后，大大腸桿菌菌的蛋白白酶降解解作用基基本上對對異源重重組蛋白白的穩定定性已構構不成威威脅包涵體表達達形式的的缺點：以包涵涵體形式式表達的的重組蛋蛋白喪失失了原有有的生物物活性，必必須通過過有效的的變性復復性操作作，才能能回收得得到具

44、有有正確空空間構象象（因而而具有生生物活性性）的目目標蛋白白，因此此包涵體體變復性性操作的的效率對對目標產產物的收收率至關關重要。然然而，這這也是一一個技術術難題，尤尤其當目目標蛋白白分子中中的Cyys殘基基數目較較高時，體體外復性性蛋白質質的成功功率相當當低，一一般不超超過300%。包涵體的溶溶解與變變性 包涵涵體的溶溶解與變變性的主主要任務務是拆開開錯配的的二硫鍵鍵和次級級鍵在人人工條件件下，使使包涵體體溶解并并重新進進入復性性途徑中中。常采采用高濃濃度變性性劑：88M尿素素、6MMGuCC打開各各種次級級鍵，以以DTTT等巰基基試劑打打開二硫硫鍵。能有效促進進包涵體體溶解變變性的試試劑和

45、條條件包括括：促溶劑 最最常用, 鹽酸酸胍、尿尿素，前前者昂貴貴，尿素素便宜，但但常被自自發形成成的氰酸酸鹽污染染，后者者能與多多肽鏈中中的氨基基反應表面活性劑劑 SDSS、正十十二醇肌肌氨酸，廉廉價，但但影響復復性和純純化混合溶劑 如尿尿素與醋醋酸、二二甲基砜砜等聯合合使用，溶溶解力增增強極端pH 廉廉價，但但許多蛋蛋白質在在極端ppH條件件下發生生修飾反反應包涵體的復復性與重重折疊：二硫鍵鍵形成（將將多肽鏈鏈中被拆拆開的游游離巰基基氧化重重新形成成二硫鍵鍵（關鍵鍵）；通過次次級鍵的的形成使使蛋白質質重折疊疊形成二硫鍵鍵的方式式主要有有：A化學氧氧化法需要要電子受受體，最最廉價的的電子受受體

46、為空空氣，二二硫鍵形形成是隨隨機的，僅僅適用于于那些不不含游離離半胱氨氨酸殘基基的蛋白白質的重重折疊 B二硫鍵鍵交換需要要還原型型和氧化化型谷胱胱甘肽（GGSH和和GSSSG），二二硫鍵形形成相對對特異，因因此適用用性較廣廣，重折折疊效果果好包涵體復性性操作的的方法：緩慢降降低變性性劑濃度度，并盡盡量減低低蛋白濃濃度。詳詳見老師師pptt。包涵體的復復性與重重折疊的的主要挑挑戰是： 聚集沉沉淀2、融合型型異源蛋蛋白的表表達以融合形式式表達目目的蛋白白的優缺缺點目的蛋白白穩定性性高 尤其對對分子量量較小的的多肽效效果更佳佳 目的蛋蛋白易于于分離 利用用受體蛋蛋白成熟熟的抗體體、配體體、底物物進行

47、親親和層析析，可以以快速獲獲得純度度較高的的融合蛋蛋白 目的蛋蛋白表達達率高 與受受體蛋白白共用一一套完善善的表達達元件 目的蛋蛋白溶解解性好 由于于受體蛋蛋白的存存在，融融合蛋白白往往能能在胞內內形成良良好的空空間構象象，且大大多具有有水溶性性 缺點：融合蛋蛋白需要要裂解和和進一步步分離，才才能獲目目的蛋白白。在實實際生產產中，產產品主要要的成本本往往就就在該工工段用于融合蛋蛋白構建建的Taag（55種）A、Hiss6 易于于親和層層析、不不影響目目的蛋白白結構、無無免疫原原性 BB、谷胱胱甘肽轉轉移酶（GGST） 維持持良好空空間構象象 C、硫氧氧化還原原蛋白（TTrxAA） 維持良良好空

48、間間構象 pTTrxFFus D、麥芽芽糖結合合蛋白（MMBP） 促進進分泌 E、內內含肽（IInteein)：類似似內含子子的多肽肽，與目目的能蛋蛋白融合合表達，在在表達后后可進行行自剪接接，兼有有蛋白酶酶和蛋白白連接酶酶的特性性。4、DTTT條件件下切割割。目的蛋白的的回收化學裂解解法-溴溴化氰（CCNBrr）法原理： CCNBrr與Meet的硫硫醚基反反應，生生成高絲絲氨酸(HMSS)殘基基留于上上游肽段段C端基因操作：在二個個多肽基基因融合合處設置置Mett的密碼碼子酶促裂解解法原理：利用用蛋白酶酶的專一一性識別別殘基與與位點切切開融合合肽基因操作：在二個個多肽基基因融合合處設置置蛋白

49、酶酶識別殘殘基的密密碼子常用多殘基基識別位位點蛋白白酶Thrommbinn(凝血血酶） Leeu-VVal-Proo-ArrgGlyy-SeerEnterrokiinasse（腸腸激酶） Asp-Asp-Asp-Asp-LysFactoor XXa （X因子） Ille-GGlu/Aspp-Glly-AArgPreSccisssionn（5切割！GE） LLeu-Gluu-Vaal-LLeu-Phee-GllnGlyy-Prro TEV pprotteasse（Invvitrrogeen) GGlu-Asnn-Leeu-TTyr-Phee-GllnGlyyInteiin（內內含肽，自自切割，N

50、EB） dithiothreitol cleavage ！3、分泌型型異源蛋蛋白的表表達蛋白質的分分泌機制制在信號肽牽牽引下跨跨膜，進進入周質質腔；BB、信號號肽酶切切下信號號肽，釋釋放目的的蛋白于于周質腔腔。以分泌形式式表達目目的蛋白白的優缺缺點A、分泌表表達形式式的優點點：目的蛋蛋白以呈呈正確折折疊的可可溶形式式存在（周周質為氧氧化型環環境，利利于二硫硫鍵形成成）目的蛋蛋白穩定定性高（周周質腔蛋蛋白酶少少）目的蛋蛋白末端端完整 相當當多的真真核生物物成熟蛋蛋白N端端并不含含有的甲甲硫氨酸酸殘基便便可在信信號肽的的剪切過過程中被被有效除除去 B分泌表達達形式的的缺點：相對其它生生物細胞胞而言

51、，大大腸桿菌菌的蛋白白分泌機機制并不不健全。外外源真核核生物基基因很難難在大腸腸桿菌中中進行分分泌型表表達，少少數外源源基因即即便能分分泌表達達，但其其表達水水平通常常要比包包涵體方方式低很很多，因因此目前前用于產產業化的的異源蛋蛋白分泌泌型重組組大腸桿桿菌盡管管有，但但并不普普遍。主主要用于于實驗室室小規模模制備。4、寡聚型型異源蛋蛋白的表表達以寡聚形式式表達目目的蛋白白的優缺缺點穩定表達小小分子短短肽短肽由由于缺乏乏有效的的空間結結構，易易受蛋白白酶攻擊擊，易降降解，串串聯短肽肽具有與與蛋白質質相似的的長度及及空間結結構，可可抗蛋白白酶降解解。目的蛋蛋白高效效表達在不不提高質質粒拷貝貝數的

52、前前提下，增增加目的的基因的的拷貝數數 目的產產物回收收困難四、工程菌菌構建、分分析、發發酵與產產物分離離純化(1)工程程菌構建建與分析析(2)工程程菌遺傳傳穩定性性分析 在非選選擇條件件下連續續傳代數數代后，對對工程菌菌重組質質粒存在在狀況、結結構完整整性和功功能完整整性進行行一下三三項分析析： A、存存在狀況況：宏觀觀逃逸率率 B、結結構完整整性：酶酶切圖譜譜分析、序序列分析析 C、功功能完整整性：表表達水平平工程菌遺傳傳不穩定定性的表表現形式式分配不穩定定性（主主要）：整個重重組DNNA分子子從受體體細胞中中逃逸（ccuriing）結構不穩定定性：重重組DNNA分子子上某一一區域發發生缺

53、失失、重排排、修飾飾，導致致其表觀觀生物學學功能的喪喪失重組質粒的的逃逸：工程菌菌部分細細胞因質質粒丟失失而不再再攜帶重重組質粒粒的現象象。重組質粒逃逃逸的原原因目的基因因本底表表達產物物引起的的毒性反反應關閉質質粒DNNA合成成途徑，啟啟動降解解程序目的基因因高效表表達誘導導宿主細細胞產生生應激反反應 抗性標標記基因因過表達達，抗生生素消耗耗過快。目的基因表達盒“轉錄過頭”，影響Ori區域。環境因素誘導的重組質粒滲漏高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）重組質粒的的宏觀逃逃逸率：工程菌菌培養液液中丟失失質粒的的細胞占占細胞總總數的百百分比。宏觀逃逸率率（%）=（非選擇性平板

54、菌落數選擇性平板菌落數）/非選擇性平板菌落數100(3)發酵酵工藝研研究工程菌生長長與表達達主要影影響因素素1、培養基基：影響菌菌體生長長、質粒粒穩定性性、表達達水平、產產物可溶溶性等碳源：葡萄萄糖、甘甘油、乳乳糖、甘甘露糖、果果糖等應應避免外外源基因因表達的的“葡萄糖糖效應”。氮源：有機機氮：酵酵母提取取物、蛋蛋白胨、酪酪蛋白水水解物、玉玉米漿 無機機氮： 氨水、硫硫酸銨、硝硝酸銨、氯氯化銨等等 其他：無機機鹽、微微量元素素維生素素、生物物素等2、菌齡與與接種量量菌齡：自接接種起培培養的時時間（小小時） 影響響停滯期期、質粒粒宏觀逃逃逸率接種量：是是指接入入的種子子液體積積占培養養液體積積的

55、百分分比 過小：延長長菌體停停滯期，質質粒宏觀觀逃逸率率高過大：菌體體生長過過快，代代謝產物物積累過過多，抑抑制后期期菌體的的生長，降降低表達達水平。3、pH值值、溫度度與溶解解氧 pH值：影響生生長速度度、表達達水平和和產物可可溶性。生生長最適適pH范圍圍在6.8-77.4，表表達最適適pH為6.00-6.5 溫度：影響生生長速度度、表達達水平和和產物可可溶性。生生長最適適37，較低低溫度利利于可溶溶表達。溶解氧：影影響生長長速度和和表達水水平4、誘導時時機與收收菌時機機誘導時機：過早影影響生物物量、過過晚影響響表達水水平。一般在在生長曲曲線對數數中期或或對數后后期進行行誘導收菌時機：過早影

56、影響表達達水平、過過晚影響響產物穩穩定性、可可溶性、并并造成浪浪費。一一般在表表達曲線線平臺期期（誘導導后3-4小時時）收菌菌工程菌搖瓶瓶水平生生長與表表達試驗驗主要研究參參數：培培養基、接接種量、ppH值、溫溫度、誘誘導與收收菌時機機等主要觀察指指標： 表達水水平（%）、生生物量、表表達產物物積累（包包涵體形形成）情情況、質質粒宏觀觀逃逸率率等結果：生長長曲線與與表達曲曲線(4)工程程菌工業業發酵工工藝研究究工程菌發酵酵工藝基基本要求求與重點點問題：基本要求：高表達達、高生生物量、便便于放大大、低成成本重點問題：1）質粒穩穩定性問問題2）表達與與生長的的矛盾問問題（誘誘導時機機）3）發酵方方

57、式問題題：分批批式orr流加式式發酵？常規發發酵orr高密度度發酵？發酵方式： 1）批式式發酵：較常用用，高表表達、但但菌體量量較少。 2）流加加發酵：較常用用，主要要補充碳碳源，菌菌體量大大、表達達水平下下降，碳碳源流加加時機和和速度是是關鍵。 高密密度發酵酵：無機機鹽介質質，通過過碳源限限制和流流加實現現高密度度發酵。 3）連續續發酵：少用，高高表達、高高總生物物量、難難控制。 工程菌工業業發酵工工藝流程程（如圖圖所示）：(5)表達達產物分分離純化化工藝研研究表達產物分分離純化化原則：1）要建立立一個方方便靈敏敏的蛋白白檢測方方法，以以估價每每一步的的提純程程度；2）分離步步驟要盡盡可能少

58、少，每一一步便于于工業放放大；3）盡量采采用柱層層析技術術，各步步驟間樣樣品應無無需復雜雜處理；4）初步分分離要快快速、大大規模，精精純要高高分辨率率；5）盡可能能避免帶帶入有害害物質;6）每步需需統計：得率、純純度、純純化倍數數分離提純有有三步策策略：粗粗提、中中度純化化、精細細純化 以下是粗提提的圖示示第四章 非非腸道原原核細菌菌基因工工程芽孢桿菌基基因工程程1、芽孢桿桿菌表達達系統的的優、缺缺點優點：1、強強大的分分泌功能能：如蛋蛋白酶、淀淀粉酶，20g/L 2、不形成包涵體，產物可正確折疊 3、非病原菌，無內毒素和外毒素，被美國FDA認定為GRAS（總體安全）系統 4、容易操作，背景清

59、楚 5、易于培養、生長旺盛缺點：同源源蛋白表表達高（g/L)、異源蛋白低(mg/L)2、大腸桿桿菌與芽芽胞桿菌菌在表達達外源基基因方面面的比較較大腸桿菌芽胞桿菌 HYPERLINK F:基因工程模式生物.exe 模式生物是否革蘭氏染色色G-G+表達產物的的分泌功功能極少大多數包涵體形成不形成表達水平高對同源蛋白白高，異異源蛋白白較低生物安全性性高高分離純化過過程復雜：復性性、去內內毒素簡單糖基化修飾飾無無3、高效表表達原理理1）異源啟啟動子：大腸桿桿菌系統統的啟動動子結構構與芽孢孢桿菌的的高度相相似，異異源啟動動子有效效2）短小芽芽孢桿菌菌胞壁蛋蛋白操縱縱子調控控元件：中壁蛋蛋白（MMWP）和

60、和外壁蛋蛋白基因因組成一一個操縱縱子（ccwp），由由啟動子子、SDD序列和和分泌信信號肽序序列組成成的5端（0.6kbb)序列列可用于于外源基基因分泌泌表達。調控機制：完整的的胞壁阻阻遏轉錄錄，生長長平臺期期胞壁蛋蛋白的脫脫落和介介質中的的低濃度度的Mgg+誘誘導（去去阻遏）。3）利用枯枯草芽孢孢桿菌胞胞外果聚聚糖酶操操縱子調調控元件件果聚糖酶操操縱子（sacB）由啟動子PsacB 、上游正調控序列DegQ和SacU、果聚糖酶基因(sacX)、下游終止子樣序列和抗終止蛋白SacY基因組成。第五章 真菌基基因工程程一、真菌表表達系統統的優缺缺點具有原核系系統的操操作簡便便、分子子生物學學背景清