1、一種肽類激素及其受體蛋白激酶對植物細胞擴增的調控作用植物細胞是不動的；因此，植物的生長發育依賴于細胞的擴增，而不是細胞遷移。通過 該質膜引發細胞擴增率變化的分子機制仍不清楚。我們發現，在擬南芥中，(1)一種分泌肽 RALF(快速堿化因子)，通過激活細胞表面受體FERONIA抑制了初生根的細胞伸長RALF 和 FERONIA 特異性結合直接證明了肽受體間的相互作用，減少固定的和不敏感的 RALF 受體會抑制 FERONIA 突變體的生長。磷酸化蛋白質的測量表明，(2)該 RALF-FERONIA 相互作用導致質膜H+-腺苷三磷酸酶2在Ser899磷酸化，并參與抑制質子的運輸。本結果 揭示了 RA

2、LF誘導的胞外堿性化和信號傳導途徑調節細胞擴展分子機制。細胞擴增是一個基本的細胞過程驅動的植物生長，并且在其生長過程中其速度和方向的 調節是一個高度動態變化的過程，并借此適應外部環境的變化。維持合適的細胞膨脹速率， 植物細胞微調涉及由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化蛋白質磷酸化級聯信號轉導途徑。植物細胞 微調涉及由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化蛋白質磷酸化級聯信號轉導途徑來維持合適的細胞 膨脹速率。例如，光，生長刺激素生長素增加細胞擴增率，并在質膜H +-ATP酶(H+-ATP 酶)的C-末端調節結構域，通過磷酸化的倒數第二Thr947殘基的減少質外體的pH值。(3)RALF (快速堿化因子)，一種5- K

3、D的分泌肽首次發現，并分析尋找植物內源肽， 增加培養細胞介質的pH值，同時誘導細胞胞漿鈣的快速增加。在擬南芥基因組中RALF類 基因超過30種，根中RALF最高度表達應該是參與根發育。我們在這里報告的信號過程涉及 質膜上肽-受體相互作用抑制根細胞伸長oRALF調用鈣的方式類似的動物肽生長因子的信 號轉導途徑，其中所述因子結合到細胞表面受體則自動進行磷酸化。我們證明了FERONIA 類受體激酶結合RALF，并啟動下游的磷酸化信號級聯反應并抑制血漿質膜H+-ATPase舌性, 提高質外體pH值，并減少細胞伸長。我們確定RALF和FERONIA作為配體-受體對，并提供 的分子機制的FERONIA介導

4、的生長抑制信號轉導途徑，這可能是相交的先天免疫響應途 經。圖1，RALF誘導后FERONIA受體激酶磷酸化的增加趨勢。質譜圖顯示，經RALF處理后，含pS871和pS874的FERONIA磷酸肽大量增加。提取F ERONIA磷酸化離子色譜圖表明RALF誘導會增加Ser858磷酸化。FERONIA受體激酶的結構。SP，信號肽;TM,跨膜結構域;JM,近膜結構域;KD,激 酶結構域。箭頭指示的是FER突變體的T-DNA插入的位置。氨基酸的縮寫：A,丙氨酸;D, ASP; E,谷氨酸;F，苯丙氨酸，G,甘氨酸，我，法蘭西島大區，K,賴氨酸，L,亮氨酸， M#, oxidizedMet, N,天冬酰胺

5、，P,親，Q,谷氨酰胺，R,精氨酸，S,絲氨酸，T,蘇 氨酸，V，纈氨酸，Y,酪氨酸;秒，磷酸化絲氨酸。在生化和遺傳的研究中為了獲得材料，我們將RALF作為N-末端6xHis融合肽在用親 和柱和反相高性能液相色譜法純化一致的大腸桿菌中進行表達。具有標簽的 RALF 在細胞 質鈣動員時具有生物活性。作為陰性對照，我們也生產和純化非活性RALF類似體，RALF （D2-8）,在其N末端缺少7個氨基酸并且是無生物活性的類似物。為了檢驗RALF誘導質 膜蛋白的迅速磷酸化變化，我們采用一個15N代謝標記技術進行質譜磷酸化蛋白質組學定量 分析，幼苗用1 um的RALF肽（水處理為對照）處理5分鐘，然后混勻

6、，并純化質膜。用 于生物重復的，則樣品標記為往復。質譜分析磷酸允許量化 550 14N/15N 磷酸對， A （i4NRALF/i5Ncontrol）和 B （i4Ncontrol/i5NRALF）的圍繞中位數 1.14 和 1.17 變化，磷素 定量測定中，五種蛋白的豐度發生變化，通過反復的觀察，這個變化至少有2.倍。這些蛋白 質中的四種蛋白豐度都增加FERONIA受體激酶（pS871和pS874, 8.3至13.4因素，圖1A； 質膜H+-ATP酶2（AHA2;系數為2.64.3，無花果。S8）；鈣依賴蛋白激酶9 （CPK9;系 數為4.012.1,圖S9）；和PEN3/ABCG36轉運體

7、（4.17因子.52）,和其中一種蛋白質豐度 下降:這種蛋白是我們長期猜測的有關FERONIA類受體激酶（ERU;系數為0.22,圖S10A）； 和 PEN3/ABCG36 轉運（4.17 因子 4.52）。我們還觀察到包含絲氨酸磷酸化位點（pS858）的FERONIA磷酸化豐度的大量增加。 在液相色譜-質譜分析過程中受到無關的共洗脫肽阻礙，但我們重建FERONIA磷酸化色 譜圖，SSDVYEGNVTDsR （圖1B）。該pS858磷酸在RALF處理的組織增加了約20倍。使 用選擇性反應監測含有pS858 （fig.S7, C和D）的同位素標記的合成磷酸肽，我們確定在 RALF處理的秧苗中pS

8、858是增加了 6.4-11.5倍。通過類比哺乳動物表皮生長因子受體磷酸 化調節過程，我們推測FERONIA是RALF受體，C端的磷酸化激活蛋白激酶和引起RALF 誘導的信號級聯反應（圖 1C）。該FERONIA受體類似激酶在花粉管伸長受阻的擬南芥突變體重第一次被發現。在正常 的施肥，在花粉管停止伸長并釋放其精子到細胞核，而在FER突變體中，花粉管消長和無 法釋放精子到細胞核，從而降低生育能力。FERONIA是malectin受體激酶家族的最廣泛表 達成員之一。除了改變FERONIA,我們檢測到的malectin受體家族中另一個RALF的受體， 在這種情況下，在豐富的含磷酸 pS497 位于近

9、膜結構域下降的另一個成員。為了測試這兩 種受體激酶（FERONIA和ERULUS）在植物體中依賴RALF進行磷酸化的功能，我們比較了敲除FER5和敲除FER4與野生型在RALF的存在和不存在時的轉移DNA （T-DNA）的生長。在1 m mol RALF，野生型生長受到抑制，而fer4無效突變體對RALF 是不敏感的，敲出FER5的突變體屬于受抑制程度適中（Fig.2A）。與此相反，ERULUS的 T-DNA的突變體顯示出較短的根毛，但相對于野生型，景觀有響應RALF并改變其磷酸化 的，也有對RALF敏感性不顯著的（圖2B）。RALF處理后抑制野生型根伸長的原因是由 于細胞的伸長減少所致。為表

10、征RALF處理后的幾秒鐘內發生RALF誘導早期細胞應答，我們使用表達擬南芥 幼苗水母發光蛋白作為胞質鈣受體，檢測FER4突變體的胞內鈣變化。經RALF誘導后，野 生型觀察到鈣增加，而FER4突變株缺沒有出現（圖2C）,但采用ATP控制處理對照實驗表 明，該突變體fer4充分響應此鈣動員激動劑，因而不是通常有缺陷的鈣響應阻礙（圖12）。 這些結果表明，該FER4突變體是特異性缺乏在依賴RALF鈣信號系統。RALF 和 FERONIA 在苗期根的成熟區都高度表達，以及它們的 mRNA 表達模式和 RALF誘導的根生長抑制表明，這兩種蛋白在伸長區限制細胞的伸長存在共同作用。與此相 一致的想法， RA

11、LF 處理 30 分鐘后進行轉錄組分析發現：已知參與編碼細胞膨脹的基因 SAUR63， expansin， BR6OX2 和 Gibberellin-3-Oxidase 1 的生物合成都是下調。經 RALF 處理后，鈣和乙烯信號，包括鈣調素和乙烯響應因子相關的基因表達上調。 RALF 誘導 BR6OX2表達的變化在FER4突變體中是不存在的。來源于致病菌鞭毛的肽flg22被受體FLS2檢測，并誘導了 Ser899上AHA2的磷酸化， 該磷酸化與質外體堿化同步進行。一個AHA2 S899D（Ser899 -Asp）突變體在酵母菌中表 達證明這個單擬磷酸突變相對于野生型AHA2增長減少；因此，RA

12、LF處理后，預測Ser899 中AHA2磷酸化增長使得H+-ATPase功能下降，這為觀測到的RELF引起的質外體堿化提 供了分子層面的解釋。在對RALF-FERONIA反應特異性的檢測后，我們測到fer突變體中 flg22靈敏度以及fls2突變體中RALF靈敏度。Fer4突變體對RALF不敏感但對肽flg22敏 感，并且fls2突變體對flg22不敏感，但對RALF敏感。我們認為激酶和細胞表面受體以及 與RALF發射信號相關的蛋白質（與RAL協同調節或在處理過后30分鐘被RALF誘導） 挑選了 17 行其他含有基因敲除突變。這些材料在根伸長過程中對 RALF 敏感度與野生型 （Fig.2B）

13、沒有區別，因此我們可以下結論，fer4對RALF的反應是特異性的。上述觀察表明，FERONIA通過抑制AHA2的活性介導RALF對根伸長的抑制作用，同時 分泌質子到質外體。我們的模型預測，FER 4突變體中H +- ATP酶的活性組成上調，與此預 測一樣，實驗測量表明，FER4突變體基質酸化比野生型更快。此外，抑制劑陽離子鋰存在 時進行根長測定，FER4突變根表現出高度敏性，其生長明顯比野生型更差（圏B）這個響 應是一個典型的突變植物H +-ATP酶活性增加和質膜超極化的表型，這會導致制陽離子進入 細胞質。通過藍色光育苗測定根H +-ATPase舌性增加的影響，其促進根伸長。FER4和RALF

14、 功能缺失突變體的根均長于野生型的(圖 3C)。為了驗證 RALF是否結合 FERONIA，我們在 Nicotiana benthamiana中利用 HisRALF、 HisRALF (D2-8)與血球凝集素(HA)標記FERONIA(FER-HA)進行免疫共沉淀試驗。 FER-HA蛋白質的表觀分子質量大部分在40 kD，以HisRALF蛋白為8 kD (圖4, A和B)。 His-RALF結合比非活性類似物高出4.5至6倍。添加時缺乏HisRALF (D2-8)的影響 當加入H isRALF進行根抑制試驗時缺少HisRALF(D2-8)的影響，表明HisRALF(D2-8)不能與 RALF受

15、體相互作用(圖4, A和C)。在另一項實驗中用25nmol RALF (標記呵)，我們測量 有非放射性的25nmol存在或不存在時RALF肽與野生型和FER4突變體細胞膜的結合情況(圖4D)。約一半的碘化RALF的約束到野生型質膜減少非放射性RALF通過過量，顯示該綁 定的區域不僅是具體而卻還能飽和。在FER4突變體中，飽和結合區減少了 40%，但不能 完全消失。我們的觀察在更高的濃度(5mmol)下，根生長抑制試驗和胞質鈣離子濃度測定 試驗中FER4突變體對RALF不是完全不敏感，這支持了在野生型質膜中除了 FERONIA外還 有其它能結合RAL F的位點。在體外通過大腸桿菌融合實驗進一步證

16、實RALF和FERONIA直 接和特異的結合。RALF特異性結合到GST-ectoFER和HisMBP-ectoFER，無活性的RALF很 少或根本沒有結合ectoFER蛋白(圖4, E和F)。我們的結果表明，FERONIA是受體RFLA和 這個受體激酶介導我們的結果表明，FERONIA是RALF的一種受體，該受體激酶介導擬南芥根系中RALF 抑制細胞生長率的功能。我證明了RALF是FERONIA的一種天然存在的配體，這個激酶對以 后工作中負向調節細胞擴增具有推動作用。圖2, FER功能缺失的突變體對RALF特別不敏感。幼苗用ImmolRALF處理后，FER4和FER5植株對RALF抑制根系生

17、長的敏感性降低。對RAL F的不敏感的FER突變體是很特殊的。突變體的其他18種類受體蛋白對RAL F的響 應正常。(C)正常FERONIA功能是RALF誘導胞質鈣增加所必需的。幼苗用500nmol的 RALF處理。(D)RAL F處理不僅導致野生型BR6OX的表達下降，在FER4突變體中也一樣。圖3, FER功能缺失突變體顯示植物典型的表型為具有更高的質膜H+-ATPase活性。fer4突變體幼苗酸化的的速度比野生型更快。FER4根的生長對鋰離子脅迫更敏感，這與其具有大量的泵和更低的膜電位保持一致。幼苗在藍光下生長7天。FER4突變體具有更長的根系。圖4, RALF結合FERONIA。HisRALF (D2-8)是RALF的無活性類似物，根生長抑制試驗中它不與RALF相互競爭。煙草RALF特異性結合FERONIA蛋白質的表現形式。紅色箭