1、中國藥科大學本科生畢業論文（設計）PAGE PAGE 19中國藥科大學本 科 畢 業 論 文論文題目英文題目Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLC專 業藥物分析院 部藥學院學 號姓 名指導教師課 題 完成 場 所論文工作時間： 2015 年 3 月 至 2015 年 5 月HPLC法測定人血漿中亞胺培南的藥物濃度目錄TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc368 摘要2 HYPERLINK l _Toc3726 前言 PAGEREF _Toc3726 4 HYPERLINK l _Toc26932 第二章 儀器與試

2、藥6 HYPERLINK l _Toc17326 1.1 儀器 PAGEREF _Toc17326 6 HYPERLINK l _Toc25516 1.2 藥品與試劑 PAGEREF _Toc25516 6 HYPERLINK l _Toc26974 第二章 方法與結果 PAGEREF _Toc26974 7 HYPERLINK l _Toc2936 2.1 色譜條件 PAGEREF _Toc2936 7 HYPERLINK l _Toc19346 2.2 溶液的配制 PAGEREF _Toc19346 7 HYPERLINK l _Toc23561 2.2.1標準溶液的配制 PAGEREF

3、_Toc23561 7 HYPERLINK l _Toc12907 2.2.2內標溶液的配制 PAGEREF _Toc12907 8 HYPERLINK l _Toc10625 2.2.3穩定劑的配制 PAGEREF _Toc10625 8 HYPERLINK l _Toc26771 2.3 血漿樣品預處理 PAGEREF _Toc26771 8 HYPERLINK l _Toc604 2.4 方法專屬性（考察血漿內源性物質的干擾） PAGEREF _Toc604 8 HYPERLINK l _Toc24029 2.5 標準曲線及定量下限 PAGEREF _Toc24029 10 HYPERL

4、INK l _Toc5819 2.6 回收率試驗 PAGEREF _Toc5819 11 HYPERLINK l _Toc4236 2.7 精密度試驗 PAGEREF _Toc4236 13 HYPERLINK l _Toc6473 2.8 穩定性試驗14 HYPERLINK l _Toc13497 第三章 討論 PAGEREF _Toc13497 15 HYPERLINK l _Toc20410 3.1 亞胺培南的立體異構 PAGEREF _Toc20410 15 HYPERLINK l _Toc31622 3.2流動相組分的選擇 PAGEREF _Toc31622 15 HYPERLINK

5、 l _Toc18659 3.3 蛋白沉淀方法的選擇 PAGEREF _Toc18659 16 HYPERLINK l _Toc18063 3.4 內標化合物的選擇 PAGEREF _Toc18063 16 HYPERLINK l _Toc20083 3.5 血漿中亞胺培南的穩定性以及穩定劑的選擇 PAGEREF _Toc20083 16 HYPERLINK l _Toc10695 第四章 臨床應用 PAGEREF _Toc10695 17 HYPERLINK l _Toc11031 第五章 結論 PAGEREF _Toc11031 17 HYPERLINK l _Toc5495 參考文獻 P

6、AGEREF _Toc5495 18 HYPERLINK l _Toc13523 致謝20HPLC法測定人血漿中亞胺培南的藥物濃度摘要：目的 建立并優化一種快速、簡單、可靠、靈敏度高、選擇性好的高效液相色譜法來測定人血漿中亞胺培南的濃度，為其臨床合理用藥和藥代動力學研究提供理論依據為其臨床合理用藥和藥代動力學研究提供試驗方法。方法 以比阿培南(Biapenem ,BIP)作為內標，以0.5 mol/L(pH6.0)嗎啉乙磺酸(4-Morpholineethanesulfonic acid，MES)作為穩定劑，血漿樣品預處理采用溶劑解法沉淀蛋白法：乙腈：含藥血漿以3:1的體積比一步沉淀蛋白，經高

7、速冷凍離心機離心后，取上清液進樣。色譜柱為Alltima HP HILIC 5m(4.6 mm250 mm)；流動相為10mMol10mmol/L乙酸銨：乙腈（40:60）；流速為1.0mL/min；柱溫：35 ；檢測波長:298nm。結果 亞胺培南在1?50g/mL的濃度范圍內線性關系良好，R=0.9997；定量下限為1g/mL；高，中，低，LLOQ濃度點的亞胺培南提取回收率相一致，均在60%左右，并且高，中，低，LLOQ4個濃度點的亞胺培南的提取回收率的RSD均小于15%，具有良好的精密度和重現性；日內、日間RSD 均小于15%。結論 本方法操作簡單、快捷、準確、靈敏度高，重復性和選擇性良

8、好，適用于臨床上對亞胺培南進行血藥濃度監測的快速。關鍵詞：高效液相色譜；亞胺培南；血藥濃度Determination of Imipenem in Human Plasma by HPLCAbstract: Objective To establish and optimize a fast, simple, reliable, high-sensitivity and good-selectivity High high Performance lLiquid cChromatography method for determining the concentration of imipen

9、em in human plasma for providing a pratical methoda theoretical basis for pharmacokinetic studies and clinical use of imipenemdrugs. Methods: Plasma samples were spiked with 0.5mol/L(pH6.0) MES as the stabilizer solution, biapenem as the internal standard, plasma protein was precipitated with aceton

10、itrile of 3 times volumn of it, after mixed for 3 mins, they were containing drug plasma followed through centrifuginged with high speed freezing centrifuge and the supernatant phase was injected. Separation was achieved on an Alltima HP HILIC column 5m(4.6 mm250 mm). The mobile phase was a mixture

11、of 10mMol10mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (40:60,v/v), and the pump flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 35 . The uV UV detection wavelength was 298 nm. Results: Calibration curves of imipenem showed good linear regression in the range of 1?50 g/mL(R= 0.9997). The lower lim

12、it of quantification of imipenem was 1?g/mL. The extraction recovery between the high, medium, low and LLOQ concentration of imipenem in quality control samples was consistent with each other, and was around 60%. The RSD of the four concentration level QC sample was less than 15% with good precision

13、 and reproducibility. And Intra- and inter-day variations were MIC)的情況下才能獲得。對于重癥患者而言，其病理生理存在特殊性，亞胺培南在其體內藥物分布和半衰期等將發生改變，血藥濃度個體差異大并且將難以預測。據國外文獻報道，在推薦劑量下使用亞胺培南治療由銅綠假單胞菌或鮑曼不動桿菌引起的肺炎，約有15%30%的患者無法達到最佳治療效果。而當大劑量給予亞胺培南治療嚴重感染如感染性心內膜炎、骨髓炎等，又容易引起驚厥、意識障礙等嚴重中樞神經系統不良反應，因此，在臨床治療中對亞胺培南進行血藥濃度監測是十分必要的，特別是對于一些重癥監護室患者

14、，嚴重感染已成為其主要死亡原因之一，對其進行亞胺培南TDM工作意義重大，有利于降低死亡率，改善臨床預后。要實現亞胺培南的臨床藥物濃度監測，就必需建立簡便、快速、靈敏、穩定的定量測定人血中亞胺培南濃度的方法，目前，國內外已有文獻對建立人血漿中亞胺培南濃度測定的HPLC法進行了研究和闡述，對本實驗的開展具有一定的借鑒和指導意義，但是色譜條件不同，所建立HPLC方法學也將存在差異。考慮到不同實驗室實驗條件的差異性（主要是色譜條件的差異），再加上針對于重癥患者在臨床上藥動學/藥效學研究數據相對的缺乏，經典的藥動學參數不適用于重癥患者，臨床急需這類患者的藥動學研究數據作為用藥依據，所以很有必要結合本臨床

15、實驗室實驗條件，在相關文獻的指導下，建立適合人血漿中亞胺培南濃度測定的HPLC-UV 方法，并利用藥代動力學原理將其應用于臨床患者的血藥濃度監測，以獲得優化的療效和產生低細菌耐藥性，提供藥動學研究數據用以指導亞胺培南臨床個體化用藥以確保安全性和有效性。圖1.亞胺培南的分子結構 第二章 儀器與試藥圖1.亞胺培南的分子結構 1.1 儀器島津高效液相色譜系統（日本Shimadzu公司）：包括LC-20AD泵，SPD-20A紫外檢測器，DGU-20A在線脫氣單元，CBM-20A系統控制器，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進樣器；十萬分之一天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水

16、系統（美國Millipore）；KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；VIicro CL21R型高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific公司），IKA GENIUS 3渦旋震蕩儀（德國IKA 公司，），PHS-25 pH計（上海精密科學儀器廠），移液槍移液器（德國Eppendorf公司）。1.2 藥品與試劑血漿樣品（東南大學附屬中大醫院提供）；乙腈（色譜純，TEDIA公司）；乙酸銨（色譜純確定是色譜純么？，西隴化工股份有限公司）；亞胺培南標準品IMP（公司）；比阿培南標準品BIP（公司）；嗎啉乙磺酸MES（Aladdin Industrial Cor

17、poration ShangHai China）；氫氧化鈉NaOH(上海展云化工有限公司)；超純水（美國MILLIPORE設備）確定是色譜純么？第二章 方法與結果2.1 色譜條件Alltima HP HILIC色譜柱（4.6mm250mm，5m）；流動相：乙腈-10mmol/L乙酸銨（60:40，V/V）；流速：1mL/min;柱溫：35；檢測波長：298nm；洗脫方式：梯度洗脫；進樣量：25L梯度洗脫時間程序如下表表格繁瑣了，簡化即可，如果用真實的，也可以，但是把命令那一欄寫清楚，一行是A泵，一行是B泵：表格繁瑣了，簡化即可，如果用真實的，也可以，但是把命令那一欄寫清楚，一行是A泵，一行是B

18、泵時間min單元處理命令值0.010.01泵FlowFlow0.40.66.306.30泵FlowFlow0.40.67.007.00泵FlowFlow0.60.49.009.00泵FlowFlow0.60.49.309.30泵FlowFlow0.40.612.01控制器Stop2.2 溶液的配制2.2.1標準溶液的配制采用十萬分之一天平精密稱取亞胺培南標準品適量，用稀釋液（ACN：MES ，60：40）配制成1mg/mL的亞胺培南標準貯備液，于-20攝氏度符合，可能在我這里顯示不出來吧的條件下冰箱保存備用。精密量取適量亞胺培南標準貯備液，采用稀釋液定量稀釋，配制成質量濃度從高到底依次為500

19、，400，200,100,50,20,10g/mL的亞胺培南系列標準品溶液，系列亞胺培南標準品溶液現用現配。攝氏度符合，可能在我這里顯示不出來吧2.2.2內標溶液的配制采用十萬分之一天平精密稱取比阿培南適量，用甲醇：水（1:2）溶解稀釋得1mg/mL的比阿培南內標貯備液，冰箱保存備用。精密量取內標貯備液適量用甲醇：水（1:2）定量稀釋，配制成100g/mL的內標溶液在-20的條件下保存，臨用時取出。2.2.3穩定劑的配制采用十萬分之一天平精密稱取嗎啉乙磺酸（MES）適量，用超純水（美國MILLIPORE設備制得）溶解后，采用5Mol/L的氫氧化鈉溶液，pH計調pH至6.0，配制成0.5mMol

20、/L的穩定劑嗎啉乙磺酸MES（pH6.0）溶液，冷藏保存于8的條件下，臨用時取出。2.3 血漿樣品預處理本實驗在臨床上所獲得的血漿與穩定劑1:1混合均勻后，移液槍精密吸取濃度為100g/mL的比阿培南內標溶液液10L，置于1.5mL的EP管中，再準確加入血漿樣品（已與穩定劑混合均勻）100L，渦旋儀上渦旋混勻30 s 后，加入乙腈300L（含藥血漿：乙腈，1:3，V/V），渦旋1 min，在高速冷凍離心機中以20000g，4，離心5 min，吸取上清液200L于進樣小瓶中，進樣25L。2.4 方法專屬性（考察血漿內源性物質的干擾）采用“2.1”項下的本實驗的色譜條件，考察空白血漿（6個不同個體

21、的空白血漿和6個不同個體的空白血漿的混合血漿），空白血漿加入亞胺培南標準品溶液及內標溶液，以及給藥后臨床患者的血漿樣品色譜圖，結果，注射用亞胺培南的保留時間在5.1左右，內標化合物比阿培南的保留時間在5.5左右，二者分離度R1.5達到定量要求，而且二者峰形對稱性良好，血漿中的內源性物質以及西司他汀鈉均在1.5-4.5min內出峰，對亞胺培南及內標物的測定不存在干擾，并且本實驗色譜條件能夠抑制亞胺培南構象異構體的分離，有效避免亞胺培南色譜峰形的列分或者展寬。高效液相色譜圖如下：A. 空白血漿B. 空白血漿+亞胺培南標準溶液+內標物C. 給藥后臨床患者血漿色譜圖+內標物圖2. HPLC色譜圖. 1

22、為亞胺培南，2為內標物比阿培南2.5 標準曲線及定量下限取1mg/mL的亞胺培南標準貯備液，用稀釋液定量配制系列標準溶液。取解凍后的空白血漿90L，置于1.5mL的EP管中，分別精密加入500,400,200,50,20,10g/mL的亞胺培南系列標準品溶液各10L于90L空白血漿中，渦旋儀上混合均勻，使得血藥濃度相當于50,40,20,5,2,1g/mL，精密量取100L的穩定劑嗎啉乙磺酸MES（pH6.0）渦旋混勻后，按照“2.3 血漿樣品預處理”項下方法同法處理后，進樣25L,記錄色譜圖，記錄亞胺培南與比阿培南的保留時間和峰面積，以亞胺培南血漿濃度為橫坐標，亞胺培南與內標物比阿培南的峰面

23、積之比為縱坐標，對亞胺培南血藥濃度進行線性回歸，所得到的線性回歸方程為：Y=0.0523X+0.0318，=0.9997，結果表明，亞胺培南在150g/mL的濃度范圍內，濃度與峰面積具有良好的線性關系，標準曲線上的最低濃度點1g/mL的RSD1.5。3.3 蛋白沉淀方法的選擇 亞胺培南屬于碳青霉烯類抗生素，在血漿中是很不穩定的，溶液的pH 偏酸或偏堿均會加快其降解。目前實際工作中常用的血漿樣品預處理方法有：去除蛋白質法，液液萃取法（LLE），固相萃取法（SPE）等。其中去除蛋白質的方法常用的有：溶劑解法，加入中性鹽，加入強酸，超濾法等。采用10%的三氯醋酸去除蛋白質在本實驗中不適用，因為強酸直

24、接沉淀將會使亞胺培南快速降解，使得提取回收率大大降低。查閱文獻資料后考慮使用乙腈一步沉淀蛋白，與甲醇，丙酮相比乙腈沉淀效率最高，含藥血漿與乙腈體積比為1:3，可將90%蛋白質沉淀除去。3.4 內標化合物的選擇檢索查閱已報道的國內外文獻，整理總結后得知目前測定亞胺培南血藥濃度所采用的內標化合物有：5-溴脲嘧啶，5-羥基吲哚-3-醋酸，以及培南類系列抗生素同時測定時相互彼此作為內標化合物。考慮使用培南類系列抗生素作為本實驗的內標物，重點考察了法羅培南與比阿培南，在2.1項下的色譜條件下，法羅培南標準品溶液直接進樣后發現其保留時間為2.552min,而血漿中的內源性物質也在此處出峰，血漿內源性物質將

25、會對法羅培南峰面積造成影響，因此法羅培南不能作為本實驗的內標物。將比阿培南標準品溶液直接進樣后發現，比阿培南保留時間為5.40-5.50min之間，在流動相為乙腈：乙酸銨（60:40，V/V）的條件下，比阿培南與亞胺培南色譜峰能達到基線分離，分離度R1.5,滿足色譜峰達到分離的指標，最終本實驗選擇比阿培南作為本實驗的內標化合物,濃度為100g/mL。3.5 血漿中亞胺培南的穩定性以及穩定劑的選擇亞胺培南系具碳青霉烯環的thienamycin類衍生物,其穩定性較好; 但在血漿中卻極不穩定,溫度對其穩定性影響較大，溫度升高，含量很快下降，其降解具有溫度依賴性。這種現象在 -內酰胺類抗生素中極少見。

26、需要加入穩定劑來增加其在血漿中的穩定性。檢索查閱國內外文獻報道，采用HPLC法測定人血漿中亞胺培南的藥物濃度所采用的穩定劑有2-嗎啉乙磺酸，3-嗎啉丙磺酸（MOPS），N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸( HEPES)等，結合本實驗所使用的色譜柱及色譜條件，選擇使用嗎啉乙磺酸作為本實驗的穩定劑，參考使用3-嗎啉丙磺酸作為穩定劑的文獻報道，將穩定劑嗎啉丙磺酸配制成0.5Mol/L的水溶液，用5Mol/L氫氧化鈉調pH至6.0，作為本實驗的穩定劑，穩定劑需在8冷藏，臨用時取出。第四章 臨床應用在臨床治療過程中，ICU重癥感染患者使用注射用亞胺培南西司他丁鈉第五章 結論 本實驗采用比阿培南作為內標物

27、，嗎啉乙磺酸作為穩定劑，建立了測定人血漿中亞胺培南的血藥濃度的高效液相色譜-紫外分光光度法，血漿樣品預處理步驟簡單，方法準確度好，靈敏度高，重復性好，線性范圍寬，選擇性好，可用于快速測定人血漿中亞胺培南的濃度。目前該方法已經應用于臨床上重癥感染患者亞胺培南治療藥物濃度監測，結果表明，該方法能夠滿足臨床亞胺培南血藥濃度的快速監測，為個體化給藥方案的制定提供技術檢測依據，指導臨床合理用藥，同時也為進行亞胺培南重癥感染患者的藥代動力學研究提供了實驗室依據。參考文獻1 黃榮飛,沈杰,王沛松. 碳青霉烯類抗生素的作用特點及研制開發背景J . 中國醫學研究與臨床,2003 ,1 (12) :46 - 48

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