1、第二章 遺傳物質及遺傳信息的傳遞除了少數的RNA病毒之外，DNA幾乎是所有生物遺傳信息的攜帶者。 DNA遺傳信息的傳遞中心法則遺傳信息從DNA到RNA轉錄遺傳信息從mRNA到蛋白質翻譯中醫藥研究常用分子生物學技術1第二章 遺傳物質及遺傳信息的傳遞除了少數的RNA病毒之外DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關系。中醫藥研究常用分子生物學技術2DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關系。中醫藥研第一節 DNA的變性、復性和DNA雜交一、變性(denaturation)在化學或物理因素的影響下，維系核酸二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA雙螺旋解旋成為單鏈的過程稱為變性。變性

2、可發生在整個DNA分子中，也可發生在局部的雙螺旋階段上 。DNA變性不涉及核苷酸中磷酸二酯鍵的斷裂。 引起DNA變性的因素有：酸、堿（PH=11.3）、熱、某些變性劑（如尿素、胍）和某些有機溶劑（如乙醇、丙酮）等。中醫藥研究常用分子生物學技術3第一節 DNA的變性、復性和DNA雜交一、變性(denat二、復性（renaturation）變性的DNA兩條互補單鏈，在適當條件下重新締合成雙鏈的過程稱為DNA復性或退火。 復性可分為兩個階段：首先是成核（nucleation），然后是拉鏈式(zippering)。復性開始時,兩條DNA單鏈隨機碰撞形成局部雙鏈， 如果是正確的互補區形成的堿基對，就成核

3、（1020bp）。如果不是正確的互補區，就解開，繼續碰撞。成核后，兩條單鏈的其余部分堿基就像“拉鏈”哪樣完成整個復性過程。 中醫藥研究常用分子生物學技術4二、復性（renaturation）變性的DNA兩條互補單DNA復性速度受多種因素影響： DNA大小與信息的多少 ：DNA片段小的比大的容易復性，反之亦然。信息含量少的比多的容易復性。 離子強度 ：通常增加鹽濃度，可加速兩條互補鏈重新結合的速度。所以，要保持單鏈DNA，鹽濃度低于0.01mol/L。 DNA濃度：DNA濃度越大兩條互補鏈彼此相遇的可能性越大，復性的速度也就越快。中醫藥研究常用分子生物學技術5DNA復性速度受多種因素影響： DN

4、A大小與信息的多少 ：D三、雜交上述復性DNA中，如果兩條鏈來源不同，這就叫做雜交分子。 雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基序列完全互補，只要有一定同源序性（不同來源）的單鏈彼此間有一定程度的互補序列就可以形成雜交鏈。 雜交分子可以在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸單鏈與RNA或DNA單鏈之間進行。中醫藥研究常用分子生物學技術6三、雜交上述復性DNA中，如果兩條鏈來源不同，這就叫做雜交 第二節 DNA的合成一、半保留復制DNA復制時，兩條鏈間的氫鍵破裂并使雙鏈解旋和分開，然后以每條鏈為模板、按堿基配對原則進行互補合成DNA，新形成的每個子代DNA的一條鏈來

5、自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制(semi conservation replication)。中醫藥研究常用分子生物學技術7 第二節 DNA的合成一、半保留復制中醫藥研究1、復制起點和復制子DNA復制在生物細胞中要從DNA分子上特定位置開始，這個特定的位置就稱為復制起點(Origin of replication)，用ori表示。DNA復制從起點開始雙向進行直到終點為止，每一個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元(replicon)。 復制起點在DNA內部原核生物只有一個復制子真核生物有多個復制子，每個復制子長約50-200kb。 中醫藥研究常用分子生物學技術8

6、1、復制起點和復制子DNA復制在生物細胞中要從DNA分子上特2、DNA復制的特點DNA復制的最主要特點（1）半保留復制 （2）半不連續復制(Semi-ondisctinuous replication)。 在復制起點兩條鏈解開形成復制泡(replication bubbles)，DNA向兩側復制形成兩個復制叉(replication forks)。 以復制叉移動的方向為基準 ，一條鏈連續復制，為先導鏈(leading strand) ；另一條鏈不連續復制，形成岡崎片段(Okaxaki fragments) ，是后隨鏈(lagging strand) 。中醫藥研究常用分子生物學技術92、DNA復

7、制的特點DNA復制的最主要特點（1）半保留復制二、參與DNA復制的有關物質模板DNA，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP，dCTP，dTTP)是DNA合成的原料。 還需要一些酶參與DNA合成(一)螺旋酶(Helicase)又稱為解旋酶，是一類特殊的蛋白質可以促使DNA在復制叉處打開雙鏈。 螺旋酶可以和單鏈DNA結合，并且與ATP結合，利用ATP分解成ADP時產生的能量沿DNA鏈向前運動促使DNA雙鏈打開。 中醫藥研究常用分子生物學技術10二、參與DNA復制的有關物質模板DNA，三磷酸核苷酸(dAT中醫藥研究常用分子生物學技術11中醫藥研究常用分子生物學技術11(二)單鏈DNA結合蛋白(SSBP)

8、單鏈DNA結合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和單鏈DNA結合，防止其重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。 中醫藥研究常用分子生物學技術12(二)單鏈DNA結合蛋白(SSBP)單鏈DNA結合蛋白(s(三)DNA拓撲異構酶(DNA Topisomerase)DNA拓撲酶催化同一DNA分子不同超螺旋狀態之間的轉變。 DNA拓撲異構酶有兩類 ：拓撲異構酶 ，如大腸桿菌的蛋白(MW-110000) ；拓撲異構酶 ，如大腸桿菌中的DNA旋轉酶(DNAgyrase) 中醫藥研究常用分子生物學技術13(三)DNA拓撲異構酶(DNA Topisom

9、erase)D螺旋與超螺旋由于強行分開雙螺旋末端而引發產生的超螺旋結構中醫藥研究常用分子生物學技術14螺旋與超螺旋由于強行分開雙螺旋末端而引發產生的超螺旋結構中醫(四)引發酶(Primase)和RNA聚合酶(RNA Polymerase)引發酶催化引物RNA分子的合成 。RNA聚合酶也是催化RNA分子的合成。人們認為后隨鏈前體片段的引物是由引發酶合成的，而先導鏈的引物是由RNA聚合酶合成的。 可能在大多數情況下，兩種類型的引物都是由引發酶合成的，而RNA聚合酶的主要作用就是通過轉錄過程而解開局部的DNA雙螺旋。這種作用就稱為轉錄激活(transcriptional activation)。中醫

10、藥研究常用分子生物學技術15(四)引發酶(Primase)和RNA聚合酶(RNA Pol（五）DNA聚合酶(DNA Polymerase)這類酶的共同性質是:1以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;2需要模板和引物的存在;3不能起始合成新的DNA鏈;4催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。 中醫藥研究常用分子生物學技術16（五）DNA聚合酶(DNA Polymerase)這類酶的1、大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol) 這是1956年由Arthur Kornberg首先發現的DNA聚合酶，又稱

11、Kornber酶。由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW為109KD。 經過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段，大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow片段，小片段的分子量為34KD。 中醫藥研究常用分子生物學技術171、大腸桿菌DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶(DNApoDNApol I的功能1聚合作用:在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。 235 外切酶活性校對作用：從35 方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。 35 3 外切酶活性切除修復作用：從5 3 方向水解DNA

12、生長鏈前方的DNA鏈，主要產生5-脫氧核苷酸。 中醫藥研究常用分子生物學技術18DNApol I的功能1聚合作用:在引物RNA-OH末中醫藥研究常用分子生物學技術19中醫藥研究常用分子生物學技術19中醫藥研究常用分子生物學技術20中醫藥研究常用分子生物學技術20大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol) 1970年發現了DNApol。此酶MW為120KD，每個細胞內約有100個酶分子，但活性只有DNApol的5%。該酶的催化特性如下：(1)聚合作用 (2)該酶也具有35 外切酶活性，但無5 3 外切酶活性。 (3)該酶對作用底物的選擇性較強 (4)該酶不是復制的主要聚合酶 中醫藥研究常用分子生物學技

13、術21大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol) 1970年發現了大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol) DNA pol 全酶由多種亞基組成 大腸桿菌每個細胞中只有10-20個酶分子 ，盡管該酶在細胞內存在的數量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速率分別是DNA聚合酶I、的15倍和30倍。 DNA聚合酶是細胞內DNA復制所必需的酶 有聚合作用： 從5 3 方向合成DNADNApol也有3 5 和5 3 外切酶活性 。中醫藥研究常用分子生物學技術22大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol) DNA pol DNA pol 酶的組成亞基 分子量(103) 其它名稱 生物功能140dnaE蛋白，polC蛋白

14、聚合功能和5 3 外切酶活性 253 5 外切酶活性 10 83保證 亞基 52dnaZ蛋白 作用的發揮 32dnaX蛋白 40dnaN蛋白，copol 中醫藥研究常用分子生物學技術23DNA pol 酶的組成亞基 分子量(103) 其它名稱2、真核生物的DNA聚合酶 真核生物中也具有幾種DNA聚合酶，但這些聚合酶都沒有3 5 或5 3 外切酶活性。主要的酶(占總量的80-90%)是DNA聚合酶，分子量為300KD，含有4個或5個亞基，主要負責染色體DNA的復制。DNA聚合酶，分子量為45KD，僅含有一條鏈，主要作用是修復核內DNA。DNA聚合酶，分子量為140KD，存在于線粒體內，負責催化線

15、粒體DNA的復制。 DNA聚合酶 ，具有3 5 核酸外切酶活性 。 中醫藥研究常用分子生物學技術242、真核生物的DNA聚合酶 真核生物中也具有幾種DNA聚合酶 分子量300KD45KD140KD？個數細胞20006000/cell聚合作用核內DNA復制修復核內DNA線粒體DNA復制與協同作用3 5 外切酶活性無無無有真核生物DNA聚合酶種類及作用中醫藥研究常用分子生物學技術25 分子量300KD45KD140KD？個數細胞2（六）DNA連接酶(DNA ligase )DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發現的。 它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的

16、5 -PO4與另一DNA鏈的3 -OH生成磷酸二酯鍵。 DNA連接酶在DNA復制、修復和重組中起著重要的作用 。真核生物細胞中的DNA連接酶有兩型 ：DNA連接酶分子量約為200KD，主要存在于生長旺盛細胞中，DNA連接酶分子量約85KD，主要存在于生長于不活躍的細胞中(resting cell)。 中醫藥研究常用分子生物學技術26（六）DNA連接酶(DNA ligase )DNA連接酶是三、DNA復制的過程DNA復制過程大致可以分為復制的引發，DNA鏈的延伸和DNA復制的終止三個階段。（一）DNA復制的引發1、前引發過程（1）解開雙鏈：兩種方法：螺旋酶在Ori處解開雙鏈通過轉錄激活解開雙鏈中

17、醫藥研究常用分子生物學技術27三、DNA復制的過程DNA復制過程大致可以分為復制的引發，轉錄激活：RNA聚合酶在Ori處轉錄一段RNA，將雙鏈分開，便于引發體與DNA結合，在先導鏈模板鏈上合成引物RNA，這一過程稱為轉錄激活。（2）引發前體（preprimosome)形成單鏈結合蛋白結合在被解開的雙鏈上。由復制因子X（n蛋白）、Y（n 蛋白）、n 蛋白、i蛋白、dnaB蛋白和dnaC蛋白六種蛋白質形成引發前體,并與單鏈DNA結合，這一過程叫前引發過程。中醫藥研究常用分子生物學技術28轉錄激活：RNA聚合酶在Ori處轉錄一段RNA，將雙鏈分開，2、引發體（primosome)形成引發前體與引發酶

18、(primase)組裝成引發體。引發體可在DNA上移動，在dnaB亞基的作用下，識別DNA復制起點位置。首先在先導鏈上合成一段RNA引物，然后引發體沿5 3 方向不斷移動，在一段距離上反復合成引物（primer)。中醫藥研究常用分子生物學技術292、引發體（primosome)形成引發前體與引發酶(pri（二）DNA鏈的延伸DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶所催化 。DNA聚合酶在引物3-OH端連上核苷酸，以使DNA新鏈得以延長。由螺旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈。DNA拓撲異構酶要以打開一條鏈，使正超螺旋狀態轉變成松弛狀態；而DNA拓撲異構酶(旋轉酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續將負超螺旋引

19、入雙鏈DNA。 在DNA復制叉處由兩套DNA聚合酶在同一時間分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈。中醫藥研究常用分子生物學技術30（二）DNA鏈的延伸DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶所催化引物的切除：DNA聚合酶I發揮5 3 外切酶活性，切去引物RNA并填補空缺（缺刻平移），留下的缺刻由DNA連接酶連上。中醫藥研究常用分子生物學技術31引物的切除：DNA聚合酶I發揮5 3 外切酶活性，(三)DNA復制的終止DNA復制在復制終止位點處終止 。1、環形DNA分子的終止在單向復制的環形DNA分子中，復制終止也即它的復制起點。在雙向復制的環形DNA分子中，有的有固定的終點，而大多數沒有固定的終點。中醫藥研

20、究常用分子生物學技術32(三)DNA復制的終止DNA復制在復制終止位點處終止 。中2、線性DNA復制的終止由于引物RNA的水解，兩個子代分子中，各有一個5 端缺少一段核苷酸，而沒有一個DNA聚合酶能填補。（1）T7DNA：形成連環分子（concatemer)T7DNA兩端各有一段重復的數百個核苷酸，這叫末端冗余（terminal redundancy)。所以，兩個子代DNA分子中的單鏈末端可以互補，多余的單鏈部分被DNAase除去，然后再由DNA連接酶連接起來形成連環分子。中醫藥研究常用分子生物學技術332、線性DNA復制的終止由于引物RNA的水解，兩個子代分子中2、線性DNA復制的終止（2）

21、 DNA的環化法 DNA進入宿主細胞內采用環化法，將線性分子連成環形。（3）真核細胞DNA末端復制依賴于端粒和能夠識別或結合端粒的端粒酶。首先在四膜蟲中發現。四膜蟲端粒中存在一種端粒酶（telomerase)，這種酶能將端粒結構中單鏈尾巴5 TTGGGG 3延長，延長部分仍是 5 TTGGGG 3 。各種端粒這種富含G的序列總是突出1216個核苷酸。中醫藥研究常用分子生物學技術342、線性DNA復制的終止（2） DNA的環化法中醫藥研究常端粒酶：端粒酶是一種核蛋白，由RNA和蛋白質構成。1990年，Blackburn等人證明了端粒酶中的RNA是富含G序列的模板。例如：游仆蟲的端粒酶RNA含有5

22、 CAAAACCCCAAAACC3 端粒酶實際上是一種逆轉錄酶，模板存在于酶分子中。端粒酶中的RNA可能還有別的作用。由端粒酶連上的富含G的尾巴彎起來，作為引物復制以填補5 空缺。中醫藥研究常用分子生物學技術35端粒酶：端粒酶是一種核蛋白，由RNA和蛋白質構成。中醫藥研究四、不需要RNA引物的DNA復制有些病毒的基因組是線性DNA，在原核細胞和真核細胞中復制時不需要RNA引物。 如：腺病毒DNA和枯草菌噬菌體29DNA復制從DNA的一端開始，而且對兩端無選擇性，各占50%的機率。 這些DNA復制時，從一端開始，只能利用一條DNA鏈作為模板，即以35鏈為模板。這樣，新合成的DNA鏈便將原來的親代

23、DNA鏈取代。原來的親代DNA鏈(從合成起始端看是53鏈)作為單鏈從雙螺旋中釋放出來。這條鏈自身的5和3可以互補配對，然后在3端開始以此鏈為模板重新合成另一條子鏈。 中醫藥研究常用分子生物學技術36四、不需要RNA引物的DNA復制有些病毒的基因組是線性DN第三節RNA的合成一、RNA合成的基本特征：1、 RNA的前體是四種核糖核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP。 2、RNA鏈的生長方向是5 3 ，核苷三磷酸加在新生鏈的3端，同時除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯鍵，焦磷酸又分解為無機磷酸，從而推動反應向聚合方向轉移。 中醫藥研究常用分子生物學技術37第三節RNA的合成一、RNA合成的基本特

24、征：中醫藥研究常用一、RNA合成的基本特征：3、 轉錄必須以一條DNA鏈為模板，按照堿基配對原則進行轉錄，因此DNA中的A、G、C、T將分別轉錄成U、C、G、A。在一個轉錄區內，一般只有一條DNA鏈可以轉錄。4、 RNA聚合酶能起始一條新鏈的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸，而且將在RNA鏈的5末端保持這一三磷酸基團。中醫藥研究常用分子生物學技術38一、RNA合成的基本特征：3、 轉錄必須以一條DNA鏈二、RNA聚合酶 （一）原核生物RNA聚合酶原核生物RNA聚合酶全酶為2全酶可結合約60個核苷酸，提示其形狀應為橢圓球形。亞基和其他肽鏈的結合不很牢固。當亞基脫離全酶后，剩下的2稱為核心酶

25、。核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成 。亞基的功能可能是識別其相應的啟動子。 中醫藥研究常用分子生物學技術39二、RNA聚合酶 （一）原核生物RNA聚合酶中醫藥研究常用分基因名稱基因圖位置多肽鏈分子量全酶中的數目功能RNA聚合酶的亞基rpoC89.51550001與DNA結合rpoB89.51510001聚合作用的催化位點rpoD66.5700001識別啟動子，起始轉錄rpoA72365002?110001?轉錄因子rho84.5460006轉錄終止nusAnusA65690001轉錄延長，終止E.coli RNA聚合酶的亞基和轉錄因子 中醫藥研究常用分子生物學技術40基因名稱基因圖位

26、置多肽鏈分子量全酶中的數目功能RNA聚合酶的RNA聚合酶可能的結構：中醫藥研究常用分子生物學技術41RNA聚合酶可能的結構：中醫藥研究常用分子生物學技術41（二）真核生物RNA聚合酶有三類：RNA聚合酶，存在于核仁，合成5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA。聚合酶，存在于核質，合成hnRNA（mRNA的前體）和snRNA。聚合酶，存在于核質，合成tRNA和5S rRNA以及轉錄Alu順序。中醫藥研究常用分子生物學技術42（二）真核生物RNA聚合酶有三類：中醫藥研究常用分子生物學技 三、啟動子（一）原核生物的啟動子對100個啟動子在轉錄上游10和35 處有兩個共同順序。Prib

27、now框：TATAAT六核苷酸序列稱之。位于10區，是RNA聚合酶牢固結合位點，簡稱結合位點。Sextama框：TTGACA六核苷酸序列稱之。位于35區，是RNA聚合酶初始結合位點，RNA聚合酶依靠亞基識別該位點，又叫RNA聚合酶識別位點中醫藥研究常用分子生物學技術43 三、啟動子（一）原核生物的啟動子中醫藥研究常用分子Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGfdG2 CTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA PL GGCGGGTGTTGACATAAATACCACTTGGCGGT

28、GATACTGAGCACATCA PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTAtRNATyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTSextama框pribnow+1T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T9617bp中醫藥研究常用分子生物學技術44Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTT（二）真核生物的啟動子比較了100個啟動子，發現真核生物啟動子是多部位結構（multipatide)主要有四個部位。1、帽子位點（cap site)：即轉錄起

29、始位點。其堿基大多數是A（非模板鏈）兩側各有若干個嘧啶核苷酸。A為轉錄起點。2、TATA框：又稱為Hogness框。位于25區附近其一致序列為：T82A97T93A85A63A83A50，基本上都是由A-T組成。在TATA框兩側有富含G-C堿基對的序列，這是TATA框發揮重要作用的因素之一。中醫藥研究常用分子生物學技術45（二）真核生物的啟動子比較了100個啟動子，發現真核生物啟動（二）真核生物的啟動子3、CAAT框：一般位于75區附近。一致序列為：GGCCAATCT，其頭兩個G的重要性并不亞于CAAT部分。作用：CAAT框控制著轉錄的頻率。4、增強子：一般在100區以上。單位置較靈活，也可以

30、位于下游或基因內部。作用：對轉錄有增強效用中醫藥研究常用分子生物學技術46（二）真核生物的啟動子3、CAAT框：一般位于75區附近。 四、轉錄過程轉錄的基本過程 無論是原核還是真核細胞，轉錄的基本過程都包括：模板識別 轉錄起始 通過啟動子 轉錄的延伸和終止。中醫藥研究常用分子生物學技術47 四、轉錄過程轉錄的基本過程中醫藥研究常用分子生物學技術47四、轉錄過程（一）RNA合成的起始和延伸1、二元復合物的形成（只有全酶和DNA）（1）封閉的啟動子復合物（2）開放性啟動子復合物2、三元復合物的形成（全酶DNARNA）中醫藥研究常用分子生物學技術48四、轉錄過程（一）RNA合成的起始和延伸中醫藥研究

31、常用分子生RNA合成起始中醫藥研究常用分子生物學技術49RNA合成起始中醫藥研究常用分子生物學技術49大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區中醫藥研究常用分子生物學技術50大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區中醫藥研究常用分子生RNA合成的延伸中醫藥研究常用分子生物學技術51RNA合成的延伸中醫藥研究常用分子生物學技術51由于基因轉錄所引起的DNA超螺旋結構變化中醫藥研究常用分子生物學技術52由于基因轉錄所引起的DNA超螺旋結構變化中醫藥研究常用分子生（二）RNA合成的終止轉錄終止信號存在于已轉錄的序列中。這種提供終止信號的序列稱為終止子（terminator)。終止子有兩類：（1）依賴

32、于蛋白質輔助因子才能實現終止作用，這種蛋白子因子稱為釋放因子，通常又稱為 因子。（2）不依賴蛋白質輔助因子就能實現終止作用。中醫藥研究常用分子生物學技術53（二）RNA合成的終止轉錄終止信號存在于已轉錄的序列中。這種1、不依賴 因子的終止子的特點：（1）在終止點前有一段反向重復序列（2）方向重復序列中富含G-C堿基對（3）在反向重復序列下游有68個A-T對中醫藥研究常用分子生物學技術541、不依賴 因子的終止子的特點：（1）在終止點前有一段反向2、依賴 的終止子的特點：（1）在終止點前有一段反向重復序列（2）方向重復序列中G-C含量較少（3）方向重復序列下游的序列沒有固定特征，其A-T含量較前

33、者低。中醫藥研究常用分子生物學技術552、依賴 的終止子的特點：中醫藥研究常用分子生物學技術55終止子終止轉錄的機制：1、不依賴 因子：（1）富含G-C對之后810堿基處，轉錄會出現跌宕。（2）反向重復序列形成發夾結構之后，阻礙了RNA鏈從三元復合物中釋放出來，使延宕時間延長。（3）一連串A轉錄出一連串U2、依賴 因子：（1）G-C含量低，（2）發夾結構缺乏U，所以只有 因子可終止轉錄。中醫藥研究常用分子生物學技術56終止子終止轉錄的機制：1、不依賴 因子：（1）富含G-C對五、轉錄后加工（一）轉錄產物的修飾1、帽子2、多聚（A）尾巴中醫藥研究常用分子生物學技術57五、轉錄后加工（一）轉錄產物

34、的修飾中醫藥研究常用分子生物學技真核生物mRNA的帽子結構中醫藥研究常用分子生物學技術58真核生物mRNA的帽子結構中醫藥研究常用分子生物學技術58（二）轉錄產物的剪接1、rRNA的剪接（1）E.coli的三種rRNA：5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA與tRNA基因混雜，需要剪切。（2）真核生物rRNA人rRNA轉錄初產物為45S，經過剪切成為18SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA。中醫藥研究常用分子生物學技術59（二）轉錄產物的剪接1、rRNA的剪接中醫藥研究常用分子生2、tRNA的剪接（1）E.coli tRNA轉錄單位是多基因的需要剪切（2）真核生物酵母約400個核

35、tRNA基因，有約40個基因中含有內含子，內含子長1446bp。需要切除內含子。3、hnRNA切除內含子內含子5 3 的拼接點序列為：GUAG。 snRNA參與了識別拼接點的作用。中醫藥研究常用分子生物學技術602、tRNA的剪接中醫藥研究常用分子生物學技術60真核生物hnRNA內含子剪切示意圖中醫藥研究常用分子生物學技術61真核生物hnRNA內含子剪切示意圖中醫藥研究常用分子生物學技第四節 蛋白質的合成蛋白質是生物信息通路上的終產物，一個活細胞在任何發育階段都需要數千種不同的蛋白質。因此，活細胞內時刻進行著各種蛋白質的合成、修飾、運轉和降解反應。中醫藥研究常用分子生物學技術62第四節 蛋白質

36、的合成蛋白質是生物信息通路上的終產物，一個活細遺傳密碼三聯子所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個特定的起始位點開始，按每3個核苷酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。這3個核苷酸就是一個密碼子。翻譯從起始密碼子AUG開始，沿mRNA 53 方向連續閱讀密碼子，直至終止密碼子為止，生成一條具有特定序列的多肽鏈蛋白質。中醫藥研究常用分子生物學技術63遺傳密碼三聯子中醫藥研究常用分子生物學技術63Crick關于tRNA分子破譯mRNA遺傳密碼三聯子的原始構想中醫藥研究常用分子生物學技術64Crick關于tRNA分子破譯mRNA遺傳密碼三聯子的原始構三聯子密碼及其破譯因為mRNA中只有

37、4種核苷酸，而蛋白質中有20種氨基酸，以一種核苷酸代表一種氨基酸是不可能的。若以兩種核苷酸作為一個氨基酸的密碼（二聯子），它們能代表的氨基酸也只有42=16種。若以3個核苷酸代表一個氨基酸，有43=64種密碼子，滿足了編碼20種氨基酸的需要。中醫藥研究常用分子生物學技術65三聯子密碼及其破譯中醫藥研究常用分子生物學技術65用核苷酸的插入或刪除實驗證明mRNA模板上每三個核苷酸組成一個密碼子中醫藥研究常用分子生物學技術66用核苷酸的插入或刪除實驗證明mRNA模板上每三個核苷酸組成一遺傳密碼的性質1. 密碼的簡并性 4種核苷酸可組成64個密碼子，現在已經知道其中61個是編碼氨基酸的密碼子，另外3個

38、即UAA、UGA和UAG并不代表任何氨基酸，它們是終止密碼子，不能與tRNA的反密碼子配對，但能被終止因子或釋放因子識別，終止肽鏈的合成。中醫藥研究常用分子生物學技術67遺傳密碼的性質中醫藥研究常用分子生物學技術67通用遺傳密碼及相應的氨基酸中醫藥研究常用分子生物學技術68通用遺傳密碼及相應的氨基酸中醫藥研究常用分子生物學技術68C亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）組氨酸（His，H）精氨酸（Arg，R）U亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）組氨酸（His，H）精氨酸（Arg，R）C亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（Arg，R）A亮氨酸（Leu，L

39、）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺（Gln，Q）精氨酸（Arg，R）G中醫藥研究常用分子生物學技術69C亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（Pro，P）組氨酸（His，HA異亮氨酸（Ile，I）蘇氨酸（Thr，T）天冬酰胺（Asn，N）絲氨酸（Ser，S）U異亮氨酸（Ile，I）蘇氨酸（Thr，T）天冬酰胺（Asn，N）絲氨酸（Ser，S）C異亮氨酸（Ile，I）蘇氨酸（Thr，T）賴氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）A甲硫氨酸（Met，M）蘇氨酸（Thr，T）賴氨酸（Lys，K）精氨酸（Arg，R）G中醫藥研究常用分子生物學技術70A異亮氨酸（Ile，I）蘇氨酸（Thr，T）天冬酰胺（AsnG纈氨酸

40、（Val，V）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（Gly，G）U纈氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（Gly，G）C纈氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（Gly，G）A纈氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（Glu，E）甘氨酸（Gly，G）G中醫藥研究常用分子生物學技術71G纈氨酸（Val，V）丙氨酸（Ala，A）天冬氨酸（Asn，除色氨酸（UGG）只有一個密碼子外，其他氨基酸都有一個以上的密碼子。9種氨基酸有2個密碼子，1種氨基酸有3個密碼子，5種氨基酸有4個密碼子，3種氨基酸有6個密碼子。由一種以上密碼子編

41、碼同一個氨基酸的現象稱為簡并（degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon）。AUG和GUG既是甲硫氨酸及纈氨酸的密碼子又是起始密碼子。中醫藥研究常用分子生物學技術72除色氨酸（UGG）只有一個密碼子外，其他氨基酸都有一個以上的 密碼子的兼并性中醫藥研究常用分子生物學技術73 密碼子的兼并性中醫藥研究常用分子生物學技術733. 密碼子與反密碼子的相互作用tRNA的反密碼子在核糖體內是通過堿基的反向配對與mRNA上的密碼子相互作用的。1966年，Crick提出擺動假說（wobble hypothesis），解釋了反密碼子中某些稀有成分（如I）的

42、配對，以及許多氨基酸有2個以上密碼子的問題。中醫藥研究常用分子生物學技術743. 密碼子與反密碼子的相互作用tRNA的反密碼子在核糖體內 mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子配對示意圖。a. 密碼子與tRNA反密碼子臂上相應序列配對；b. 當反密碼子第一位是I時，密碼子第三位可以是A、U或C。中醫藥研究常用分子生物學技術75 mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子配對示意圖。中醫藥tRNAtRNA不但為每個三聯密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了運送載體，所以，它又被稱為第二遺傳密碼。不同tRNA在結構上存在大量的共性，由小片段堿基互補配對形成三

43、葉草形分子結構，有4條根據結構或已知功能命名的手臂。最常見tRNA分子有76個堿基，相對分子質量約為2.5104，不同的tRNA分子可有7495個核苷酸不等。中醫藥研究常用分子生物學技術76tRNA中醫藥研究常用分子生物學技術76D臂中存在多至3個可變核苷酸位點，17：1及20：1、20：2。最常見的D臂缺失這3個核苷酸，而最小的D臂中第17位核苷酸也缺失了。 D臂是根據它含有二氫尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。受體臂（acceptor arm）由鏈兩端序列配對形成的桿狀結構和3端未配對的34個堿基所組成，其3端的最后3個堿基序列永遠是CCA，最后一個堿基的3或2自由羥基（OH）可

44、以被氨酰化。TC臂是根據3個核苷酸命名的，其中表示擬尿嘧啶；反密碼子臂是根據位于套索中央的三聯反密碼子命名的；中醫藥研究常用分子生物學技術77D臂中存在多至3個可變核苷酸位點，17：1及20：1、20：酵母tRNAphe的三級結構示意圖（根據X-射線衍射數據繪制）。a和b表示用不同方法構建的模型。中醫藥研究常用分子生物學技術78酵母tRNAphe的三級結構示意圖（根據X-射線衍射數據繪制tRNA的功能只有tRNA上的反密碼子能與mRNA上的密碼子相互識別并配對，而氨基酸本身不能識別密碼子，只有結合到tRNA上生成AA-tRNA，才能被帶到mRNA-核糖體復合物上，插入到正在合成的多肽鏈的適當位

45、置上。用14C標記的半胱氨酸與tRNACys結合后生成14C-半胱氨酸-tRNACys，經Ni催化可生成14C-Ala-tRNACys，再把14C-Ala-tRNACys加入到蛋白質合成系統中，發現14C-Ala-tRNACys插入了血紅蛋白分子中通常由半胱氨酸占據的位置上，表明起識別作用的是tRNA。中醫藥研究常用分子生物學技術79tRNA的功能中醫藥研究常用分子生物學技術79 AA-tRNA合成酶AA-tRNA合成酶是一類催化氨基酸與tRNA結合的特異性酶，其反應式如下： AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi 它實際上包括兩步反應： 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復

46、合物。 AA+ATP+酶（E）E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基轉移到tRNA 3 末端腺苷殘基的2 或3-羥基上。 E-AA-AMP+tRNAAA-tRNA+E+AMP中醫藥研究常用分子生物學技術80 AA-tRNA合成酶中醫藥研究常用分子生物學技術80 核糖體核糖體是由幾十種蛋白質和多種核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）所組成的亞細胞顆粒。一個細菌細胞內約有20 000個核糖體，而真核細胞內可達106個。這些顆粒既可以游離狀態存在于細胞內，也可與內質網結合，形成微粒體。核糖體蛋白約占原核細胞總蛋白量的9-10%，占細胞內總RNA量的70-80%。在真核細胞內，核糖體

47、所占的比重雖然有所下降，但仍然占總RNA的絕大部分，是細胞總蛋白的一個重要組成部分。中醫藥研究常用分子生物學技術81 核糖體中醫藥研究常用分子生物學技術81真核生物中，所有正在進行蛋白質合成的核糖體都不是在細胞質內自由漂浮，而是直接或間接與細胞骨架結構有關聯或者與內質網膜結構相連的。細菌核糖體大都通過與mRNA相互作用，被固定在核基因組上。 結合在內質網上的核糖體。左，電鏡下看到的胰腺細胞粗糙內質網；右，局部放大后的草圖。中醫藥研究常用分子生物學技術82真核生物中，所有正在進行蛋白質合成的核糖體都不是在細胞質內自核糖體的結構核糖體是一個致密的核糖核蛋白顆粒，可解離為兩個亞基，每個亞基都含有一個

48、相對分子質量較大的rRNA和許多不同的蛋白質分子。原核生物核糖體由約2/3的RNA及1/3的蛋白質組成。真核生物核糖體中RNA占3/5，蛋白質占2/5。原核生物、真核生物細胞質及細胞器中的核糖體存在著很大差異。中醫藥研究常用分子生物學技術83核糖體的結構中醫藥研究常用分子生物學技術83幾種不同生物核糖體及rRNA的組成中醫藥研究常用分子生物學技術84幾種不同生物核糖體及rRNA的組成中醫藥研究常用分子生物學技大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質組成，分別用S1S21表示，大亞基由36種蛋白質組成，分別用L1L36表示。真核生物細胞核糖體蛋白質中，大亞基含有49種蛋白質，小亞基有33種蛋白質，它們

49、的相對分子質量在81034.0104之間。中醫藥研究常用分子生物學技術85大腸桿菌核糖體小亞基由21種蛋白質組成，分別用S1S21核糖體結構模型及原核與真核細胞核糖體大小亞基比較中醫藥研究常用分子生物學技術86核糖體結構模型及原核與真核細胞核糖體大小亞基比較中醫藥研究常真核生物細胞中發現的多聚核糖體現象核糖體分子中可容納兩個tRNA和約40bp長的mRNA。中醫藥研究常用分子生物學技術87真核生物細胞中發現的多聚核糖體現象核糖體分子中可容納兩個tR核糖體的功能核糖體上至少有5個活性中心，即mRNA結合部位、結合或接受AA-tRNA部位（A位）、結合或接受肽基tRNA的部位、肽基轉移部位（P位）

50、及形成肽鍵的部位（轉肽酶中心）。此外，還應有負責肽鏈延伸的各種延伸因子的結合位點。核糖體小亞基負責對模板mRNA進行序列特異性識別，大亞基負責攜帶氨基酸及tRNA的功能，肽鍵的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的結合等，A位、P位、轉肽酶中心等主要在大亞基上。中醫藥研究常用分子生物學技術88核糖體的功能中醫藥研究常用分子生物學技術88 蛋白質合成的生物學機制核糖體是蛋白質合成的場所，mRNA是蛋白質合成的模板，轉移RNA是模板與氨基酸之間的接合體。蛋白質合成是一個需能反應。真核生物中可能有近300種生物大分子參與蛋白質的生物合成，這些組分約占細胞干重的35%。細胞用來進行合成代謝總能量的90

51、%消耗在蛋白質合成過程中。大腸桿菌只需要5-6秒鐘就能合成一條由100個氨基酸組成的多肽。蛋白質的生物合成包括氨基酸活化、肽鏈的起始、延伸、終止以及新合成多肽鏈的折疊和加工。中醫藥研究常用分子生物學技術89 蛋白質合成的生物學機制中醫藥研究常用分子生物學技術89 蛋白質合成各階段的主要成分簡表中醫藥研究常用分子生物學技術90 蛋白質合成各階段的主要成分簡表中醫藥研究常用分子生物學技術氨基酸的活化蛋白質合成的起始是指在模板mRNA編碼區5端形成核糖體-mRNA-起始tRNA復合物并將甲酰甲硫氨酸放入核糖體P位點。原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結合，再與fMet-tRNAfMet結合，

52、最后與50S大亞基結合。真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結合，再與模板mRNA結合，最后與60S大亞基結合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始復合物。起始復合物的生成除了GTP外，還需要Mg2+、NH4+及3個起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。中醫藥研究常用分子生物學技術91氨基酸的活化中醫藥研究常用分子生物學技術91翻譯的起始 翻譯起始復合物的形成第一步，30S小亞基與翻譯起始因子IF-1，IF-3結合，通過SD序列與mRNA模板相結合。第二步，fMet-tRNAfMet在IF-2的協同下進入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對

53、。第三步，帶有tRNA、mRNA、三個翻譯起始因子的小亞基復合物與50S大亞基結合，釋放翻譯起始因子。中醫藥研究常用分子生物學技術92翻譯的起始中醫藥研究常用分子生物學技術92 真核生物翻譯起始復合物的形成中醫藥研究常用分子生物學技術93 真核生物翻譯起始復合物的形成中醫藥研究常用分子生物學技術肽鏈的延伸生成起始復合物，第一個氨基酸（fMet/Met-tRNA）與核糖體結合以后，肽鏈開始伸長。按照mRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽鍵的方式被有序地結合上去。肽鏈延伸中的每個循環都包括AA-tRNA與核糖體結合、肽鍵的生成和移位三步。多肽鏈上肽鍵的形成縮合反應中醫藥研究常用分子生物學技術9

54、4肽鏈的延伸多肽鏈上肽鍵的形成縮合反應中醫藥研究常用分子生1后續AA-tRNA與核糖體結合細菌中肽鏈延伸的第一步反應：第二個氨基酰-tRNA的結合。 該氨基酰-tRNA首先與EF-Tu GTP形成復合物，進入核糖體的A位，水解產生GDP并在EF-Ts的作用下釋放GDP并使EF-Tu結合另一分子GTP，進入新一輪循環。由于EF-Tu只能與fMet-tRNA以外的其他AA-tRNA起反應，所以起始tRNA不會被結合到A位上，mRNA內部的AUG不會被起始tRNA讀出，肽鏈中間不會出現甲酰甲硫氨酸。中醫藥研究常用分子生物學技術951后續AA-tRNA與核糖體結合細菌中肽鏈延伸的第一步反應2肽鍵的生成

55、 細菌中肽鏈延伸的第二步反應：肽鍵的生成。在核糖體mRNAAA-tRNA復合物中，AA-tRNA占據A位，fMet-tRNAfMet占據P位。在肽基轉移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA轉移到P位，與fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽鍵。起始tRNA在完成使命后離開核糖體P位點，A位點準備接受新的AA-tRNA，開始下一輪合成反應。中醫藥研究常用分子生物學技術962肽鍵的生成在核糖體mRNAAA-tRNA復合物中，A3. 移位 肽鍵延伸的最后一步是移位，即核糖體向mRNA 3端方向移動一個密碼子。細菌中肽鏈延伸的第三步反應：移位。核糖體通過EF-G介導的GTP水解所提供的能量向mRNA模板3末端移動一個密碼子，使二肽基-tRNA完全進入P位,準備開