1、三、細胞生長狀況有關指標的檢測方法 細胞計數法 細胞生長曲線 細胞分裂指數 克隆形成率三、細胞生長狀況有關指標的檢測方法 細胞計數法1、細胞計數法 細胞計數法是用血細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度。 臺盼藍染色法用于檢測存活細胞數。 注：臺盼藍染色排除檢測法，由于死細胞的細胞膜通透性發生改變，染料可大量進入卻不能被排出，因而細胞被染色；而活細胞能拒染，因而不易著色。1、細胞計數法 細胞計數法是用血細胞計數板計Trypan blue staining of adult rat cardiac myocytes in primary culture. Live ce

2、lls exclude the blue dye, and so appear clear. Dead cells take up the dye and appear blue.Trypan blue staining of adult 細胞凋亡檢測課件細胞凋亡檢測課件結果分析細胞密度 細胞數/ml（4大格細胞數之和/ 4 ）104稀釋倍數細胞存活百分率 細胞活力（）未著色細胞數總細胞數100結果分析細胞凋亡檢測課件2、細胞生長曲線細胞生長曲線是細胞培養實驗中最基本的指標，是觀察同一代細胞的增殖過程。根據細胞生長曲線分析細胞增殖方法一：在同一規格的培養瓶中，接種同等量的同一代細胞，經培養后每

3、隔24 h取出幾瓶細胞進行計數，以培養時間為橫坐標，不同時刻的細胞數為縱坐標，即為該細胞的生長曲線。方法二：四氮唑鹽（MTT）比色法2、細胞生長曲線細胞生長曲線是細胞培養實驗中最基本的指標，是細胞凋亡檢測課件3、細胞分裂指數細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標；以被測1000個細胞中的分裂細胞數來計算。方法：染色后血細胞計數板計數 細胞分裂指數細胞分裂相數/細胞總數（1000）1003、細胞分裂指數細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標；以4、克隆形成率克隆形成率所計數的細胞必為貼壁和有增殖能力的細胞，反映細胞群體依賴性和增殖能力。各種細胞克隆形成率差別很大，一般初代細胞克隆形成率弱，傳

4、代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。方法 克隆形成率克隆數/接種細胞數100注意：細胞要分散好，不能有細胞團，接種密度不要過大。4、克隆形成率克隆形成率所計數的細胞必為貼壁和有增殖能力的細細胞凋亡檢測課件 四、細胞生物活性的化學檢測法 四氮唑鹽（MTT）比色法 細胞蛋白質含量測定法 細胞蛋白質合成的3H-亮氨酸摻入試驗 細胞DNA合成的3H-TdR摻入試驗 四、細胞生物活性的化學檢測法 四氮唑鹽（MTT）比色法1、四氮唑鹽（MTT）比色法原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶性的藍紫色結晶物，并沉積于細胞中，而死細胞無此功

5、能。二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS等均能溶解細胞中的紫藍色結晶物，用酶聯免疫檢測儀，在490，570 nm波長處測定其光吸收值（OD），可間接反映活細胞數量。在一定細胞數值范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。此法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、細胞毒性實驗、抗腫瘤藥物篩選和腫瘤放射敏感性測定等。1、四氮唑鹽（MTT）比色法原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫操作步驟（1）單細胞懸液接種于96孔培養板；103-104細胞/孔，每孔培養基總量200 l, 37、5CO2培養箱中培養一段時間（根據實驗目的決定培養時間）（2）加入2mgml的MTT液（50微升孔）；繼續培養3

6、小時。（3）吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150l孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長為490或570 nm）。記錄結果，繪制細胞生長曲線操作步驟細胞凋亡檢測課件2、細胞蛋白質含量測定法（考馬斯亮藍測定法）原理：考馬斯亮藍在酸性溶液與蛋白質結合后，在595nm波長處呈現最大吸收量，其吸光值與蛋白質含量呈正相關。此法主要用于測定酶、受體及細胞外代謝產物特異性活性的度量單位。2、細胞蛋白質含量測定法（考馬斯亮藍測定法）原理：考馬斯亮3、細胞蛋白質合成的3H-亮氨酸摻入實驗 原理：細胞在合成蛋白質時需攝取外源性氨基酸，用核素標記氨基酸，

7、如3H-亮氨酸，可以摻入細胞蛋白質合成代謝中，通過測定細胞的放射性強度，可了解細胞蛋白質合成代謝狀況。3、細胞蛋白質合成的3H-亮氨酸摻入實驗 原理4、細胞DNA合成的3H-TdR摻入實驗 原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質。用核苷3H標記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DNA的代謝及細胞增殖情況。4、細胞DNA合成的3H-TdR摻入實驗 原五、細胞凋亡檢測方法 （一）、凋亡概念： 細胞凋亡是細胞循自身程序結束其生命的主動死亡的過程，具有特征的形態和生化改變，是由基因控制的個別細胞發生

8、的自主有序的死亡。即是由基因控制細胞有目的，有選擇性的自我消亡過程，這種淘汰機制是保證生命進化的基礎。 五、細胞凋亡檢測方法 （一）、凋亡概念：細胞凋亡檢測課件a、凋亡概念的形成和形態學的研究(1972） 1965年發育生物學家Lockshin在研究硪發育過程中首次提出程序化死亡（programmed cell death ）概念。 1971年 澳大利亞生物學家Kerr用皺縮死亡來區別經典的細胞壞死。 1972年Kerr等在英國癌癥雜志發表論文，首次提出細胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。b、DNA的降解和內源性核酸內切酶的參與。(1987）c、蛋白質水解酶活

9、化的研究(1995)d、細胞膜的變化(1997)e、線粒體的變化和分子生物學的研究(1998-) 1) 相關基因及調控 2）信號轉導 3）各種分子及其相互作用及相互關系 4）疾病機制的闡明，以及新療法的探索及問世。（二）、凋亡的研究歷史Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7. a、凋亡概念的形成和形態學的研究(1972）（二）、凋亡的研細胞凋亡檢測課件似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計數的攻擊、誘導，輕啟著道道程序，逼細胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點一點擰淡;似秋葉的凋零，危難中的細胞啊，你沉穩不亂，DNA片片切

10、割，化云梯直通天堂；細胞體分團相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。 危難中的細胞啊，NormalApoptosisNecrosis（三）、凋亡與壞死NormalApoptosisNecrosis（三）、凋亡與 凋亡與壞死主要鑒別（形態學） 凋 亡壞 死細胞形態細胞膜出芽，冒泡但完整性 好，活組織中個別細胞死亡 細胞完整性破壞成片細胞死亡，破壞組織結構 過 程 固縮核，濃染胞漿，脫離。凋亡小體 細胞腫脹，核淡染，凝固性壞死，無膜性小體 細胞器 細胞器未遭破壞，胞漿濃縮 細胞器腫脹溶解 染色質 染色質致

11、密，凝集或邊集濃染 染色質疏松變性粗糙 染料排斥試驗 開始被排斥 染料摻入（膜破壞或通透性） DNA破壞機制核酸內切酶作用核酸DNA裂解為200bp或其倍數片斷（核孔裂開） 隨機降解彌漫ATP膜損傷， 氧自由基損傷 結局 凋亡小體可被同種或異種細胞識別吞噬 吞噬細胞吞噬細胞碎片，溶解組織反應不引起炎癥反應，迅速退 化，無整個組織瓦解，不誘發組織的再生與修復，細胞生長增殖凋亡 引起炎癥反應，繼發性組織損傷， 誘發組織再生與修復，形成疤痕， 壞死補償性增生細胞增殖 凋亡與壞死主要鑒別（形態學）凋 亡壞 死細細胞凋亡檢測課件接受凋亡信號凋亡調控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡

12、的級聯反應（四）、細胞凋亡的過程及機理接受凋亡信號（四）、細胞凋亡的過程及機理凋亡主要信號途徑凋亡主要信號途徑Model for caspase activation by mitochondria.osmotic disequilibrium leading to an expansion of the matrix space, organellar swelling, and subsequent rupture of the outer membranethe other envisions opening of channels in the outer membrane thus

13、releasing cyto c from the intermembrane space of mitochondria into the cytosol.Model for caspase activation bMultiple apoptotic pathways emanate from the mitochondria.chromatin condensation and fragmentationMultiple apoptotic pathways em（五）、 細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡的形態學檢測磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）線粒體膜勢能（mt）的檢測DNA片

14、斷化檢測 TUNEL法Caspase-3活性的檢測 WB檢測凋亡相關蛋白的表達和細胞定位分析 （五）、 細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡的形態學檢測Apoptosis AssaysApoptosis Assays 1.細胞凋亡的形態學檢測光學顯微鏡和倒置顯微鏡 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO ,Hoechst 33342;H

15、O, Hoechst 33258; DAPI。電子顯微鏡觀察 1.細胞凋亡的形態學檢測光學顯微鏡和倒置顯光學顯微鏡觀察光學顯微鏡觀察細胞凋亡檢測課件Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）Nuclear morphological changes 電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡期的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。 電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡期的細胞核內染色A、Normal cell B

16、、Apoptosis: Apoptotic bodiesA、Normal cell B、Apoptosis: Apo2.磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞

17、凋亡的發生。2.磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析磷脂酰絲氨酸（Phospha磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 不同凋亡階段的區分 PIAnnexinV細胞凋亡檢測DNA含量-PIAnnexin-VPIAnnexinV細胞凋亡檢測DNA含量-PIAnneAnnexin V-FITC FluorescencePI Fluorescence Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free mediumAnnexin V-FITC FluorescencePI 細胞凋亡檢

18、測課件Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PIApoptotic HeLa cells were stai 3.線粒體膜勢能（）的檢測 線粒體熒光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。 3.線粒體膜勢能（）的檢測 NIH 3T3 mouse fibroblasts exposure to hydrogen peroxideNIH 3T3 mouse fibroblasts expo線粒體膜勢能（ ）的檢測Health

19、y cellapoptotic cells線粒體膜勢能（ ）的檢測Healthyapopto4.DNA片段化分析 細胞凋亡時主要生物化學特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。4.DNA片段化分析 細胞凋亡時主要生物化學特征是細胞凋亡檢測課件5.DNA 末端斷裂分析5.DNA 末端斷裂分析細胞凋亡檢測課件細胞凋亡檢測課件6. 凋亡的效應分子檢測 細胞凋亡的分子機制雖然還不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上

20、是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程。 半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的詞頭) 6. 凋亡的效應分子檢測 細胞凋亡的分子機制雖然還不十分清Caspase家族的結構與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細胞來源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用； Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11 Caspase12，Caspase13， Caspase14。凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶：Caspas

21、e8， Caspase2， Caspase 9，Caspase10。凋亡效應亞類Caspase蛋白酶：Caspase3， Caspase6， Caspase7Caspase家族的結構與分類Caspase家族主要成員 序號 原名 功能底物特異性Caspase-1ICE輔助促炎癥WEHDCaspase-2ICE-1凋亡反應DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反應DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICE-2輔助促炎癥WEHDCaspase-5ICErel-III,TY輔助促炎癥WEHDCaspase-6Mch-3凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-7Mch3,ICE-LAP3,CMH-1凋亡反應DEXDCaspase-8MACH,FLICE,Mch5凋亡反應(I/L/V)EXDCaspase-9ICE-LAP6,Mch6凋亡反應(I/L/V)EXD