1、W海卷M彳身優畢業設計(論文)開題報告題 目：敬釗毒素-XI (JZTX-XI )及其突變體M5A-JZTX-XI的固相合成與氧化復性院 系：化學化工學院專 業：生物工程學生姓名： 賀娟 學 號： 200606030114指導教師：曾雄智 蔣開軍2010年4月8日畢業設計（論文）開題報告1.文獻綜述：結合畢業設計（論文）課題情況，根據所查閱的文獻資料, 每人撰寫-500字以上的文獻綜述，文后應列出所查閱的文獻資料。敬釗毒素-XI突變體M5A-JZTX-XI的化學合成與氧化復性的文獻綜述一、蜘蛛多肽毒素的研究進展自然界中很多動物會利用自身產生的多肽毒素來捕食獵物和防御天敵，如蜘蛛、蛇、芋螺、河豚

2、、蜜蜂、蝸等。蜘蛛就是利用自己的螯爪把毒液注射到獵物的體內，從而達 到麻痹或致死獵物的作用。而在動物毒液中，最為豐富也是研究最多的一類物質就是分 子量在100cgJ10000 Da的多肽類毒素。在這些毒素中，神經毒素又是多肽毒素中含量最 多的成分，其主要生物學功能是作用于靶細胞膜上的各種離子通道，如鉀、鈣、鈉、酸 敏感通道等1-5。有些多肽毒素呈現出作用單一性的特點，可以成為一種診斷試劑用于藥 理學研究。一些作用較強的毒素可以用來治療疾病，如 2004年被美國食品與藥品管理局 批準的治療慢性神經疼痛和癌癥病人疼痛的神經毒素 Conotoxin-MVIIA ,就是從海洋動物 芋螺中發現的6。以神

3、經毒素為先導分子研制出的某些藥物，也取得了巨大的成功。如 美國默克公司以非洲曼巴蛇神經毒素分子為模板制成的多肽新藥，可以有效地治療心肌 絞痛，多肽毒素研究已成為世界新藥研究的一個熱點 70我國的學者也從虎紋蜘蛛毒素 中發現了一種多肽毒素HWTX-XJ對于治療急性胰腺炎有良好的治療前景網。二、蜘蛛毒素的組成人們一般把蜘蛛毒素分子分為三大類：第一類是分子量 1 kDa以下的小分子物質。 第二類也是含量最豐富的一類，為分子量1到10 kDa之間的多肽類毒素。第三類是分子 量10 kDa以上的蛋白質類。毒蜘蛛是一個天然的蛋白質生產庫，蜘蛛所分泌的毒素中通 常是含多種毒素，我們可以通過分離、純化獲得我們

4、所需的毒素，然后測定其一級結構， 進行天然肽類毒素的人工全化學合成、建立蜘蛛毒素的蛋白質組圖譜、蜘蛛毒素的蛋白 質工程改造以及對其中多種在藥物學和神經生物學研究上有重要學術價值和應用前景 的毒素進行開發利用。目前研究較多的是虎紋捕鳥蛛、海南捕鳥蛛和廣西大疣蛛的毒素。 這些毒素主要是作用于動物細胞的離子通道，用以麻痹或殺死目標。三、 毒素中的小分子物質以前的研究探明，蜘蛛毒素中的小分子物質主要有無機鹽類 （Na+、K+、Ca2+、Cl-）、 氨基酸、核甘酸、有機堿、多胺類物質和神經遞質（如多巴、GABA、腎上腺素）等90目前，很多小分子物質的作用和意義還不清楚，有人認為小分子物質可能會加強毒素對

5、 獵物的傷害，還有人認為只是一些降解產物。在對小分子物質的研究中，對多胺類物質的研究已經呈現一個新的領域。Gerard P.Ahern等人認為一些多胺類是潛在的辣椒素受體。日本發現的多胺類小分子JSTX-3能阻斷突觸后膜的谷氨酸受體。通過對越來越多的多胺類物質結構的解析，發現多胺類的毒 素都有一些共同的特點，分子頭部通常是一個苯酚基團或是一個呷咪基團，分子尾部通 常是一個胺基或是一個胴基，中間是多胺構成的主鏈。通過對多胺類的了解深入，人們 開始意識到它們可以成為選擇性作用于離子通道的工具試劑，在醫藥和科研上發揮更大 的作用。四、蜘蛛毒素的蛋白質類成分蜘蛛蛋白質類成分富含多種活性酶，血藍蛋白，未

6、知蛋白，以及少量的毒素蛋白。酶類主要包括：（1）能量代謝相關酶類，如ATP合成酶、NADH脫氫酶、ATP-NAD 激酶、乙酰輔酶AS化酶、谷胱甘月*轉移酶等；（2）消化相關酶類，如淀粉酶等；（3） 脂類代謝相關酶類，如磷脂酶A1、阿樸脂蛋白酶等；（4）其他酶類，如過氧化物酶、 轉移酶等。血藍蛋白又稱血清素，是存在于某些軟體動物和節肢動物中的一種游離的藍色呼吸 色素12。血藍蛋白含兩個直接連接多肽鏈的銅離子，它易與氧結合，也易與氧解離，是 已知的惟一可與氧可逆結合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。它是在某些軟 體動物、節肢動物（甲殼蟲和蜘蛛）的血淋巴中發現的一種游離的藍色呼吸色素。血藍 蛋

7、白有多種催化作用，特別是變性后，在特定條件下具有多酚氧化酶、過氧化氫酶和脂 氧化酶等活性13。毒素相關蛋白中以黑寡婦蜘蛛中發現的 Latrotoxins （LTX）最著名。 它可以通過三種方式作用于細胞膜：一是它能通過鈣離子依賴的方式結合突觸前膜外生 蛋白，激活某種信號通路，從而釋放突觸小泡；二是它在其作用的細胞膜形成在一種非 特異性的孔道，使其允許鈣離子和一些谷氨酸、乙酰膽堿等小分子量物質通過，進而引 起對靶細胞的傷害；三是它可以與GS白藕聯受體2合，并通過GS白信號通路促使突觸 小泡大量釋放神經遞質14。五、蜘蛛毒素的多肽類成分蜘蛛毒液中含量最豐富也是研究最多最深入的一類就是分子量在100

8、0到10000 Da的多肽類成分，一般含有3對或是4對的二硫鍵。目前已有成百上千種蜘蛛多肽毒素被 研究，它們的主要生物學功能是能夠作用于靶體細胞膜上的各種離子通道，從而實現捕 食獵物和防御天敵的目的。六、多肽類蜘蛛毒素的研究現狀通過對多肽組學的研究，在任意兩種蜘蛛中沒有發現有同一分子量和相同序列的多 肽，也沒有在任意兩種蜘蛛毒液中通過基質輔助激光解析離子飛行時間質(MALDI-TOFMS)發現到相同分子量的肽段。蜘蛛多肽毒素呈現出多樣性，但是大多數的多肽類毒素 卻主要集中在1到6 kDa。以中國虎紋捕鳥蛛為例，其多肽毒素主要集中在3到6 kDa15。根據多肽毒素的生物學功能主要可以分為三大類：

9、一是作用于靶細胞膜上的各種離 子通道，通過堵塞或強化離子流來使獵物或天敵麻痹甚至死亡。一般的多肽通常會作用 于多種不同類型的離子通道，如敬釗蜘蛛毒素 -V能作用Nav1.8和Kv4.316。二是作用 于神經遞質受體，如芋螺毒素-GI能抑制乙酰膽堿與受體競爭性結合。三是作用于酶的 相關機制，如虎蛇可以分泌強烈的凝固劑、溶血素，被虎蛇咬后，除了傷口劇痛之外， 從傷口附近延伸的毒素更會令足部及頸部出現痛楚，身體感到麻痹、出汗，隨即開始呼 吸困難及局部肢體癱瘓。而蜘蛛毒素按照功能和作用又可以分為神經毒、壞死毒和混合毒三種，其中神經毒 素占三分之二以上17。蜘蛛毒素的毒素作用是通過毒素分子與靶體細胞受體

10、的相互作用 完成的，尤其是通過各種離子通道來完成的。毒素的三維核磁共振解析和蛋白結晶的 X-衍射證明了蜘蛛的多肽毒素大部分是門 控修飾而不是直接堵塞門孔的方式來作用于離子通道的。在三維結構圖上，毒素分子表 面大量的疏水性的氨基酸殘基所形成的疏水斑片，其周圍又分布著一些帶電荷氨基酸殘 基，這種特殊結構能與離子通道上的電壓敏感元件相互作用，影響電壓敏感元件的移動，從而影響離子通道的電流。七、作用于電壓門控鈉離子通道毒素電壓門控鈉通道(voltage-gated sodium channels VGSCs)是指在去極化電壓誘導下才能被激活的鈉通道。許多天然的鈉通道毒素，大多數都是電壓門控型毒素。VG

11、SCs廣泛存在于中央與外周神經系統的神經元、肌肉以及各種可興奮性細胞中，在各種神經 元的興奮中發揮著關鍵作用。電壓門控鈉離子通道毒素能有目的性地選擇和鈉通道a亞 基的不同部位結合，而引起通道的動力學特征發生改變，如易化激活、阻塞通道口、慢 失活、通道去失活等。這些毒素的化學本質都為多肽類或有機小分子類鈉通道毒素。其 中，多肽類鈉通道毒素具有專一性強、活性高等優點。在目前的研究中，在哺乳動物神 經元鈉通道上已經有六個部位能與上百種的毒素分子相結合。這些位點分布于細胞膜外 側、通道孔內和跨膜區域上。這些電壓門控鈉通道部位依次被命名為位點1-位點6(Sitel-Site6),而結合于這些位點的毒素則

12、相應分別稱之為位點1毒素(Site 1 toxin)-位點6毒素(site 6 toxin)。電壓門控鈉通道根據是否能被河豚毒素(TTX)阻斷，又可 分為兩大類：河豚毒素敏感型鈉通道(TTX-sensitive , TTX-S)和河豚毒素不敏感型鈉 通道(TTX-resistant, TTX-R )。八、作用于電壓門控鉀離子通道毒素鉀離子通道(voltage-gated potassium channels VGPCs)相對其他離子通道研究得 最早，也最為通徹。電壓門控性鉀離子通道在調節靜息電位、細胞膜的復極化等重要的 細胞生理過程有著重要的作用。鉀離子通道結構域相對簡單，它主要是由兩型功能域

13、組 成的：即由S5至S6跨膜螺旋片段通過四聚排列構成的中央孔域和由S1至S4跨膜螺旋片段構成的電壓敏感域。電壓門控鉀通道也可分為三種類型18：外向延遲整流鉀通道(Kr),瞬時外向鉀通道(KA),內向整流鉀通道(Kir)。目前在蜘蛛中發現的鉀離 子通道抑制劑主要作用在 Kv2( shab-related K+ channels) 和 Kv4( shab-related Kh channels)。 例如，最早從蜘蛛毒液中分離的hanatoxin-I (HaTx1)是一種可以抑制鉀離子通道多肽 毒素，它由35個氨基酸殘基折疊成抑制劑胱氨酸結構模體(ICK motif)。它對Kv2.1 鉀離子通道表現

14、出很高的親和性，而對 Kv1、Kv3鉀離子通道沒有作用，對于 Kv4只有 較弱的抑制作用。目前hanatoxin-I是研究Kv2.1離子通道的一個常用試劑。hanatoxin-I 能夠結合電壓敏感元件S3b-S4的跨膜螺旋所形成的電壓敏感漿葉結構，并形成穩態復 合體，它的持續作用時間比電壓敏感元件從負電位時的靜息狀態轉變成正電位時的活化 開放狀態的時間要長得多。通過定點突變技術證實了Kv2.1離子通道的I273、F274和E277很有可能是hanatoxin-I的結合位點19。鉀離子通道(尤其是電壓門控的鉀離子通道)的多樣性在調節神經細胞膜興奮和神 經可塑性中起著關鍵的作用。鉀離子可通過 K+

15、1道蛋白迅速地透過細胞膜，這一透過過 程包含了許多既是最基本又是較復雜的生物過程。鉀通道的門控特性 （通道孔的開閉雖 然不同，但是他們具有相似的通透性。所有鉀通道具有 k+r6c6的選擇性通透序列，對 小分子堿金屬nW與Li+的通透性更小。鉀通道的一個通透特性就是多離子電導機制 ，這 一機制可導致異名電導特性。九、已研究的敬釗毒素概況敬釗纓毛蛛（Chilobrachys jingzhao）是我國海南省瓊中縣發現的蜘蛛新種。從 2002 年起，廖智等人從毒素學的角度對敬釗蜘蛛毒素進行系統研究。他們從敬釗蜘蛛毒素的 多肽成分中，提取60種多肽進行了序列測定。其中有31條多肽測定了全序列，另外29條

16、 測得了 NS部分序列。通過質譜分析發現，在測得全序列的 31個多肽分子中，29條多肽 含有6個半胱氨酸，形成3對二硫鍵。另外兩個多肽則含有8個半胱氨酸，形成4對二硫鍵。 在這31條多肽中，其中有11個存在洲酰胺化修飾。后來陳金軍等人通過轉錄組學的方 法在敬釗纓毛蛛毒腺中發現了 104個富含二硫鍵白毒素序列和115個細胞功能相關蛋白。 通過轉錄組與多肽組的數據比較，其中有 34個毒素是都能鑒定到的。其他一些毒素不能 在兩個庫中同時存在的原因可能有：（1）兩種方法的取材不同。毒素組取材是同種蝴 蛛的混合毒素，而轉錄組的蜘蛛毒腺取材于基本上是年齡和狀態相近的八只蜘蛛。（2）核酸和蛋白質檢測的方法不

17、同。蜘蛛毒液中至少含有 200多個多肽毒素，目前利用傳統 的分離方法，只能得到一些豐度較高的多肽，相當多的豐度偏低的多肽在分離和純化的 過程中會損失殆盡。而核酸可以復制，根據 cDNAC庫的結果，可以發現更多的毒素的序 列數目和更多低豐度蛋白的信息。此外，在敬釗纓毛蛛毒液中還發現了與喋吟、多胺、 煙酰胺代謝相關的酶。參考文獻：1孔天翰主編.蝎與蟲曷毒M,鄭州:河南科技出版社,1995, 291.2蕭熙.動物藥的臨床應用J.中醫雜志,1986, 4: 15: 132.3劉崇銘，裴國強.東亞鉗蝎的鎮痛作用研究J. 1989, 3: 176.4王永奎，韓雪飛.蝎毒素-IV在大鼠脊髓中的鎮痛作用及其機

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23、毒素與虎紋捕鳥蛛非肽類毒素的結構與功能研究D.長沙：湖南師范大學,2003.23陳冉冉，王賢純，梁宋平.虎紋捕鳥蛛毒素-IV突變體 K27A-HWTX- IV的合成和復性及其生物學 活性的研究J.湖南師范大學自然科學學報，2003, 25: 115-117.24池宇朋，鄧梅春，曾雄智等.兩種敬釗蜘蛛毒素的結構與功能研究D.長沙：湖南師范大學2010.畢業設計（論文）開題報告2.開題報告：一、課題的目的與意義；二、課題發展現狀和前景展望；三、 課題主要內容和要求；四、研究方法、步驟和措施開題一報告一、課題的目的與意義目的：JZTX-XI是從敬釗纓毛蛛毒液中分離到的一種多肽毒素 ，是一種瞬時外向鉀

24、離 子通道抑制劑，可以強烈抑制 Kv2.1鉀離子流，同時對Nav1.5也有抑制作用，通過對敬釗 纓毛蛛天然毒素中分子JZTX-XI序列分析，我們已經知道其序列（ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF ）及其二硫鍵的配對方式， 所以可 以利用固相合成的方法合成一些某些氨基酸取代的突變體，再純化和氧化復性，并通過膜 片鉗電生理實驗鑒定其生物活性，找出影響其生物活性的關鍵殘基，從而闡明一級結構和 功能的關系。意義：多肽的合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應用價值。通過多肽 合成，可以解決科研過程中許多棘手的問題：多肽合成可以驗證一個新的多肽的結構；用 于研究結

25、構與功能的關系；設計新的多肽；為多肽生物合成反應機制提供重要信息；改造 多肽分子；合成新的多肽藥物等.通過人工合成JZTX-XI的突變體（M5A-JZTX-XI）,再純化 和氧化還原復性，再借助膜片鉗（patch clamp）測定該突變體的活性并與天然的JZTX-XI 進行比較，可以確定與生物活性相關的關鍵殘基，從而揭示其結構與功能關系。 二、課題發展現狀和前景展望JZTX-XI也是從敬釗纓毛蛛毒液中分離到的一種多肽毒素， 通過N-端Edman竄解法對 其測序，發現JZTX-XI是由34個氨基酸殘基組成，其中包含有6個半胱氨酸。它與鉀通道 毒素 Stromatoxin-1、Hanatoxin-

26、1 和 Heteroscodratoxin-1 有超過 70%勺同源性，與鈉通 道毒素Toxin CcoTx3和鈣通道毒素SNX-482有大約60%勺同源卜t （圖1-3 A） 33。JZTX-XI的cDNAff歹1J有468個堿基對，由3非翻譯序列，5非翻譯序列和編碼前體 分子的開放閱讀框構成。JZTX-XI的開放閱讀框編碼86個氨基酸殘基組成JZTX-XI前體。 JZTX-XI的成熟肽（34個氨基酸殘基）前含一段信號肽區（21個氨基酸殘基），以及一個 Pro區（29個氨基酸殘基），另外還有兩個額外的殘基（-GK）,而這額外的殘基能影響 多肽的翻譯后修飾，它們往往是多肽毒素C-末端酰胺化的信

27、號。通過核磁共振技術的結構解析，發現 JZTX-XI的N端和C端，以及部分帶電荷殘基和疏水性殘基的溶液可及性表面面積都在其氨基酸總面積的30犯上。6個Cys, Leu19,Gly20和Ala29九個殘基組成一個疏水性的核心位于空間結構的內部，它的溶液可及性表面小于10%（圖1-4 A） 。 JZTX-XI的6個Cys形成的三對二硫鍵，為1-4, 2-5, 3-6連接，三對 二硫鍵形成的節狀結構對穩定分子的空間結構有非常重要的作用。它的這種分子結構屬于典型的ICK模體結構。估計JZTX-XI與Kv2.1通道結合的關鍵殘基可能是 M5 F6, W30 R3和K22 JZTX-XI 還具有抑制急性分

28、離的大鼠心肌鈉通道電流的作用，IC50值為1.28以研hanatoxin1和SGTx1均未發現有鈉通道抑制活性，這可能是 JZTX-XI的N端分布有R3 K4 D12和D14 這幾個帶電荷的殘基。這幾個帶電荷的殘基在空間分布上與6-ACTX-Hv1affi6-ACTX-AUa （兩種鈉通道毒素）具有拓撲學上的相似性。大鼠心肌鈉通道主要是 Nav1.5 通道，故與Nav1.5通道結合的關鍵殘基可能是 R3 K4 D12和D1441。 三、課題主要內容通過同源模建預測JZTX-XI的第5, 24,26, 27位殘基為關鍵殘基，本次實驗分別選 取第5和24位作為突變位點，合成JZTX-XI的突變體M

29、5A-JZTX-XI和T24R-JZTX-XI;再通 過反相HPLCM化，質譜實驗顯示合成線性肽的分子量與理論分子量相符，證明合成是成 功的；將合成成功的線性分子，通過加入含有谷光甘肽的緩沖溶液進行氧化復性，探索了 氧化復性的最佳條件，通過質譜鑒定對復性好的突變體進行了確認。 四、實驗工藝流程與操作步驟1、實驗材料與實驗儀器 實驗材料9-方甲氧染基（FmoC氨基酸為Chemassist公司產品；Rink Resin樹脂在天津南開 和成公司購買；還原型谷胱甘肽（GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG、三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCL ）、6-氯苯并三氮唾-1, 1,3, 3-四甲基月尿六氟磷酸酯（HCTU、二琉基乙烷、苯甲硫醴