1、淺析CCL20在胸腺CD4+CD25+T細胞發育過程中的作用及其意義【摘要】目的:研究趨化因子L20對小鼠胸腺D4+D25+雙陽性T細胞發育的影響,為天然調節性T細胞調控的研究提供根底數據。方法:采用14.5d齡胚鼠胸腺進展體外培養,以流式細胞術FP0.001。結論:體外培養的D4+D25+雙陽性胸腺細胞數量和比例變化與體內發育變化趨勢一致,L20明顯下調胸腺D4+D25+的表達,這將為天然調節性T細胞的調控研究提供有效的參考根據。【關鍵詞】胸腺細胞D4+D25+L20體外胸腺器官培養Sakaguhi等1研究發現,給小鼠輸入D4+D25+T細胞,會下調免疫應答,研究者們進一步在動物模型和臨床病

2、例證實該細胞參與自身免疫病的發生、腫瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反響。隨后的研究證實了該群細胞為D4+D25+fxp3+調節性T細胞,小鼠體內輸注經同種抗原活化的D4+D25+T細胞,可引起特異性免疫耐受2,不僅如此,它在免疫系統發育、自身免疫、腫瘤逃逸等過程中均扮演重要的角色,成為當前免疫學研究的熱點。調節性T細胞分為天然調節性T細胞和誘導調節性T細胞,其中天然調節性T細胞對機體具有舉足輕重作用。目前就其來源、亞群、特點、轉歸及其在T細胞活化中的作用研究都有了長足的進展,但對這群細胞在胸腺發育中的變化及調控因素尚不清楚。而L20是亞家族的趨化因子3,該趨化因子的受體分布于未成熟的樹突狀細胞、

3、T細胞、B細胞上4-6,在固有免疫和獲得性免疫中都發揮著重要的作用7。人們對L20的研究顯示該趨化因子在胸腺中表達明顯8,其受體R6是調節性T細胞的標志之一9,但其在胸腺中存在的意義以及其是否參與胸腺D4+D25+T細胞的發育尚不清楚,因此本研究擬采用不同孕齡的胎鼠,以體外胸腺器官培養fetusthyusrganulture,FT技術在體外以L20對調節性T細胞進展干預實驗,對D4+D25+T細胞的體內外發育狀態進展比較研究,以期為該群細胞發育和調控的深化研究提供了根據。1材料和方法1.2方法參加1LRPI1640培養液含200L/LFBS。滅菌濾膜充分潮濕后覆蓋在明膠海綿上,吸棄0.5L培養

4、液,使24孔板中最終剩0.5L培養液。頸椎脫位處死孕鼠,從孕鼠子宮中取出胚鼠,置于加有PBS的100的平皿中,根據大小等特征再次判斷其胚齡。剪開胚鼠胸腔,取出胸腺小葉經PBS充分清洗,每孔加8個胸腺小葉,每組均為雙復孔進展培養。L20干預組在培養的第0、3天加趨化因子L20終濃度為4g/L。體內胸腺細胞發育過程的研究分別取不同孕齡的母鼠,按照以上步驟取出胸腺小葉后,制成單細胞懸液,計數、染色10。參加1LFIT標記D4和PE標記D25Ab10g/L,輕輕混勻,4,避光,靜置30in。PBS洗3次后,用500LPBS重懸,流式細胞術檢測。檢測體外培養胸腺時,將胸腺小葉從濾膜上取出,按照以上方法制

5、成懸液并染色,BDaliber機型檢測,ellquest軟件分析10。2結果2.1體外及體內胸腺細胞總數的變化系統反映存在于胸腺細胞中的D4+D25+雙陽性細胞的體內外發育狀況,首先觀察了整個胸腺細胞的數量變化。結果顯示:14.5d胚齡鼠的胸腺細胞為雙陰性時期或者稍有陽性,是進展胸腺細胞發育研究的最正確圖1。圖1胚鼠胸腺細胞數目的體內外動態變化略2.2D4+D25+雙陽性胸腺細胞的體內外發育進一步研究D4+D25+雙陽性胸腺細胞的體內外發育狀況顯示:在體內情況下,14.5d胚鼠的胸腺細胞中D4+D25+占全部胸腺細胞的比例為0.13%,17d增至峰值4.13%,而后降低至19d的2.03%圖2

6、A圖2B圖2圖2D。體外培養的胸腺細胞與體內胸腺細胞發育規律類似:體外培養1d時,胸腺細胞中D4+D25+的比例體內為1.87%,4d增至峰值10.85%,而后降低至6d的3.54%圖2A。D4+D25+細胞數在1d為0.01104,4d增加至4.31104,持續增至6d的4.89104圖2B。D4+D25+占D25+細胞的在1d比例為3.75%,持續增加至80.06%圖2D。僅D4+D25+占D4+細胞的比例與體內不同,在1d為58.29%,而后持續降低至6d的4.04%圖2。圖2胚鼠胸腺細胞中D4+D25+細胞的體內外動態變化略A:D4+D25+胸腺細胞百分比;B:D4+D25+胸腺細胞數;:D4+D25+/D4+百分比;D:D4+D25+/D25+百分比.2.3L20干預胸腺D4+D25+細胞的發育由于L20表達于胸腺中,為了研究L20是否對胸腺D4+D25+細胞的發育產生影響,以一定濃度的L20與胸腺細胞共培養,結果顯示在不同培養時間點均有不同程度的影響表1,在培養的第3、6天,D4+D25+胸腺細胞的比例明顯降低,進一步的實驗說明L20濃度的增加,D4+D25+胸腺細