1、原子力顯微鏡的原理及應用 北京大學生物醫學工程05 碩 喻敏 1985 年 Binnig 與斯坦福大學的 C. F. Quate 和 IBM 蘇黎士實驗室的 Christoph Gerber 合 作推出了原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，簡稱AFM） ,1這是一種不需要導電 試樣的掃描探針型顯微鏡。 這種顯微鏡通過其粗細只有一個原子大小的探針在非常近的距 離上探索物體表面的情況，便可以分辨出其他顯微鏡無法分辨的極小尺度上的表面細節與 特征。由于它的出現，直接觀測微觀世界的大門被打開了。這種顯微鏡能以空前的高分辨 率探測原子和分子的形狀，確定物體的電、磁與機械特性，甚

2、至能確定溫度變化的情況。 使 用這種顯微鏡時無需使試樣發生變化，也無需使試樣受破壞性的高能輻射作用。 總合起來講，原子力顯微鏡的工作原理就是將探針裝在一彈性微懸臂的一端，微懸臂 的另一端固定，當探針在樣品表面掃描時，探針與樣品表面原子間的排斥力會使得微懸臂 輕微變形，這樣，微懸臂的輕微變形就可以作為探針和樣品間排斥力的直接量度。一束激 光經微懸臂的背面反射到光電檢測器，可以精確測量微懸臂的微小變形，這樣就實現了通 過檢測樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結構。在原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）的系統中，可分成三個部分：力檢 測部分、位置

3、檢測部分、反饋系統 （見圖 1）。11在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，所要檢測的力是原子與原子之間的范德華力。所 以在本系統中是使用微小懸臂（cantilever）來檢測原子之間力的變化量。微懸臂通常由一 個一般100500p m長和大約500nm5p m厚的硅片或氮化硅片制成。微懸臂頂端有一個尖銳 針尖，用來檢測樣品針尖間的相互作用力。這微小懸臂有一定的規格，例如：長度、寬 度、彈性系數以及針尖的形狀，而這些規格的選擇是依照樣品的特性，以及操作模式的不 同，而選擇不同類型的探針。以下是一種典型的AFM懸臂和針尖：12在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，當針尖與樣品之間有了交互作用之后，會使得

4、懸 臂can tilever擺動，所以當激光照射在微懸臂的末端時，其反射光的位置也會因為懸臂擺動 而有所改變，這就造成偏移量的產生。在整個系統中是依靠激光光斑位置檢測器將偏移量 記錄下并轉換成電的信號，以供SPM控制器作信號處理。上圖是激光位置檢測器的示意圖。聚焦到微懸臂上面的激光反射到激光位置檢測器， 通過對落在檢測器四個象限的光強進行計算，可以得到由于表面形貌引起的微懸臂形變量 大小，從而得到樣品表面的不同信息。13在原子力顯微鏡（AFM）的系統中，將信號經由激光檢測器取入之后，在反饋系統中 會將此信號當作反饋信號，作為內部的調整信號，并驅使通常由壓電陶瓷管制作的掃描器 做適當的移動，以保

5、持樣品與針尖保持一定的作用力。AFM系統使用壓電陶瓷管制作的掃描器精確控制微小的掃描移動。壓電陶瓷是一種性 能奇特的材料，當在壓電陶瓷對稱的兩個端面加上電壓時，壓電陶瓷會按特定的方向伸長 或縮短。而伸長或縮短的尺寸與所加的電壓的大小成線性關系。也就是說，可以通過改變 電壓來控制壓電陶瓷的微小伸縮。通常把三個分別代表X，Y，Z方向的壓電陶瓷塊組成三 角架的形狀，通過控制X，Y方向伸縮達到驅動探針在樣品表面掃描的目的；通過控制Z方 向壓電陶瓷的伸縮達到控制探針與樣品之間距離的目的。原子力顯微鏡（AFM）便是結合以上三個部分來將樣品的表面特性呈現出來的：在原 子力顯微鏡(AFM)的系統中，使用微小懸

6、臂(cantilever)來感測針尖與樣品之間的相互 作用，這作用力會使微懸臂擺動，再利用激光將光照射在懸臂的末端，當擺動形成時，會 使反射光的位置改變而造成偏移量，此時激光檢測器會記錄此偏移量，也會把此時的信號 給反饋系統，以利于系統做適當的調整，最后再將樣品的表面特性以影像的方式給呈現出 來。2 原子力顯微鏡的工作模式是以針尖與樣品之間的作用力的形式來分類的。主要有以下 3 種操 作模式:接觸模式(con tac tmode)，非接觸模式(non-con tact mode)和敲擊模式(t apping mode) 。21從概念上來理解，接觸模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那

7、樣，AFM 在整個掃描成像過程之中，探針針尖始終與樣品表面保持親密的接觸，而相互作用力是排 斥力。 掃描時，懸臂施加在針尖上的力有可能破壞試樣的表面結構，因此力的大小范圍在10 - 1010 - 6 N。 若樣品表面柔嫩而不能承受這樣的力，便不宜選用接觸模式對樣品表面進 行成像。22非接觸模式探測試樣表面時懸臂在距離試樣表面上方510 nm 的距離處振蕩。 這時，樣 品與針尖之間的相互作用由范德華力控制，通常為10 - 12 N，樣品不會被破壞，而且針尖也 不會被污染，特別適合于研究柔嫩物體的表面。 這種操作模式的不利之處在于要在室溫大 氣環境下實現這種模式十分困難。因為樣品表面不可避免地會積

8、聚薄薄的一層水，它會在 樣品與針尖之間搭起一小小的毛細橋，將針尖與表面吸在一起，從而增加尖端對表面的壓 力。23敲擊模式介于接觸模式和非接觸模式之間，是一個雜化的概念。 懸臂在試樣表面上方 以其共振頻率振蕩，針尖僅僅是周期性地短暫地接觸/ 敲擊樣品表面。 這就意味著針尖接 觸樣品時所產生的側向力被明顯地減小了。因此當檢測柔嫩的樣品時，AFM的敲擊模式是 最好的選擇之一。一旦AFM開始對樣品進行成像掃描，裝置隨即將有關數據輸入系統，如 表面粗糙度、平均高度、峰谷峰頂之間的最大距離等，用于物體表面分析。 同時， AFM 還 可以完成力的測量工作，測量懸臂的彎曲程度來確定針尖與樣品之間的作用力大小。

9、 接觸模式(Con tac t Mode)：優點：掃描速度快，是唯一能夠獲得“原子分辨率”圖像的AFM垂直方向上有明顯變化的 質硬樣品，有時更適于用Con tact Mode掃描成像。缺點：橫向力影響圖像質量在空氣中，因為樣品表面吸附液層的毛細作用使針尖與樣 品之間的粘這力很大橫向力與粘著力的合力導致圖像空間分辨率降低，而且針尖掛擦樣品 會損壞軟質樣品(如生物樣品，聚合體等)。非接觸模式(Non-Con tac t Mode)： 優點：沒有力作用于樣品表面。 缺點：由于針尖與樣品分離，橫向分辨率低；為了避免接觸吸附層而導致針尖膠粘， 其掃描速度低于Tapping Mode和Con tact M

10、ode AFM。通常僅用于非常怕水的樣品，吸附液 層必須薄，如果太厚，針尖會陷入液層，引起反饋不穩，刮擦樣品。由于上述缺點， on-contact Mode 的使用受到限制。輕敲模式(Tapping Mode)：優點：很好的消除了橫向力的影響。降低了由吸附液層引起的力，圖像分辨率高，適 于觀測軟、易碎、或膠粘性樣品，不會損傷其表面。缺點：比Contact Mode AFM的掃描速度慢。3、AFM在生物學研究中的應用 一般認為 ，AFM 能夠在自然環境中直接觀測生物樣品的表面結構，而且避免復雜的制備過 程，以及電子束輻射所帶來的樣品損傷。但實際情況并非完全如此AFM對生物醫學樣品制 備，同樣也有

11、一定的要求。包括:表面平整，高度起伏W10 20p m;表面有一定的硬度;基底 面平滑，如用新鮮解離的云母片等;對于較大的顆粒、細胞，可用蓋玻片、塑料片等;樣 品在基底表面要求相對均勻、分散等。客觀地講，相對于電鏡復雜的生物樣品制備過程來 說，原子力顯微鏡的生物樣品制備過程要簡單一些。但遺憾的是，沒有一種普遍適用的方 法，能夠解決原子力顯微鏡所有的生物醫學樣品的制備問題。因此，一般情況下，都需要 科研人員自己動手制備符合AFM技術要求的樣品，以獲得滿意的觀察效果。游離細胞樣品制 備過程大致步驟如下:首先提取細胞， 2.5%戊二醛固定;同時制備新鮮解離的云母片，用雙 面膠固定于基底表面; 然后將

12、固定細胞滴加于云母表面，用氮氣吹干并展平; 最后用接觸式 或輕敲式進行細胞的表面形態觀測。活的培養細胞樣品制備過程大致步驟如下:事先將培養 皿或蓋玻片用多聚賴氨酸進行處理，然后將細胞培養于培養皿或蓋玻片上，檢查前將培養 皿或蓋玻片制成小于lxlcm的小片;將指甲油滴加于AFM液體池底部，小片的無細胞面沾到指 甲油上，而小片的有細胞面上滴加培養液;待指甲油干后，液體池中充人培養液，置于AFM 的掃描器上，即可進行細胞表面形態的成像觀測。AFM對活體細胞的成像效果還很不理想， 這主要是因為細胞膜表面比較柔軟，與基底的固定較弱，探針的壓力會使探針和細胞表面 的接觸面積大大增加，從而損傷細胞或造成細胞

13、的漂移。OReily等利用AFM對一定數量的 血紅細胞表面形態及三維結構進行了觀測和圖像分析，從而得出細胞的厚度、寬度、表面 積以及體積等量化數。對于活細胞，也可以在AFM的液體池中進行動態的觀察。通過液體池 的進液孔可隨時注入不同的化合物溶液，改變活細胞的液體環境（如離子濃度、 pH 值、溫度、 濕度等）進行動態的觀測。Jena等“利用AFM對感染病毒后細胞表面形態的改變、造骨細胞 在加人底物（鉆鉻、欽、欽釩等）后細胞形態和細胞彈性的變化、GTP對胰腺外分泌細胞囊泡 高度的影響進行研究。黃益民等7利用原子力顯微鏡對自由基損傷的紅細胞膜表面精細結構 研究，直接觀察到了自由基的損傷，以及加女貞子

14、保護后，對紅細胞膜分子形貌學的影響。 如果 要 對一些生物醫學組織樣品進行AFM表面形態成像觀測，樣品制備過程大致如下:選 取組織表面較為平整的部位，剪成0.5 x 0.5 cm小塊，觀測面朝上，展平后貼在蓋玻片上; 滴加固定液于樣品表面上，靜置30min左右;用三蒸水沖洗去固定液中的溶質所形成的結晶; 將蓋玻片置于AFM的掃描器上，進行成像觀測。一般來說，組織樣品進行AFM的表面形態成 像效果還比較滿意。AFM觀察細胞表面形態結構分辨率還不夠理想。這主要是由于細胞膜表 面太軟，探針的壓力（無論是接觸式，還是輕敲式）會使探針和樣品表面的接觸面積增大， 從而使分辨率降低。AFM觀察細胞表面形態結

15、構的分辨率一般只能維持在nm到p m之 間。如果樣品制備不好，儀器狀況調整不佳，操作人員技術不夠熟練，那么AFM的分辨率還 要低一些。原子力顯微鏡目前已廣泛應用于蛋白質、核酸、DNA，磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及 有機化合物在空氣或溶液中的形態觀測研究。張英鴿等“用AFM對乙酞膽堿醋酶分子進行顯 微成像。林璋、白春禮等6用AFM進行亞精胺誘導DNA凝聚有序性的研究。Rief等7用AFM 研究了不同大小的力對單個葡聚糖分子的影響，其中可逆的構象變化已經得到分子動力學 計算的證實。胡鈞等進行了人工操縱病毒的原子力顯微鏡研究，首次實現了復雜的體系 一種線性噬菌體病毒的人工拉直與定向，并利用原子力

16、顯微鏡對拉直前后的病毒進行了觀 察與測量。用AFM對生物大分子進行形態結構觀察時，樣品制備也很重要。蛋白質樣品制備 過程有兩種方法，一種是蛋白質吸附固定法:首先將云母裁成lxlcm的小片，用雙面膠固定 于 AFM 基底上，制備新鮮裂解的云母表面;將一定濃度的蛋白溶液滴加于云母表面，用氮氣 將其展平，吹干，蛋白便可吸附于云母表面;將液體池置于AFM的掃描器上，即可進行細胞 表面形態的成像觀測。該方法簡便易行，可滿足一般成像的要求。缺點是蛋白質固定不一 定牢固，可能會出現脫落或拖動現象。另一種是蛋白質共價固定法:利用蛋白質分子上的氨 基與疏基丙酸的狡基形成膚鍵連接的原理，進行蛋白質的固定。該方法固

17、定比較牢固。缺 點是方法復雜，費時費力。固定好的樣品置于AFM的掃描器上，即可進行生物大分子表面形 態結構的成像觀測。如果是DNA類的樣品，其制備過程大致如下:首先將根據實驗目的，稀釋原液;然后取適量稀 釋液滴加于新鮮裂解云母表面，氮氣展平，吹干。固定好的樣品置于AFM的掃描器上， 即可進行生物大分子表面形態結構的成像觀測。目前AFM已廣泛應用于對生理生化反應中 蛋白質、核酸等生物大分子的形態或功能的動態研究。在此基礎上還可以進行分子水平的 熱力學和動力學的研究。研究生物大分子的生理生化過程，是目前AFM在生命科學中應用最 多的領域之一。配備了環境氣氛箱的AFM可以在樣品箱內進行氣氛控制，樣品

18、調整以及樣品 觀察。這樣可以對生物大分子在各種不同的氣氛（包括大氣、低真空、各種氣體置換、不同 濕度和溫度等條件）下的形態結構等進行研究。在這個領域里研究較多的主要有:蛋白的聚 合、纖維組裝的過程8、膠原的超微結構和組裝、蛋白三維晶體增長的研究、生物膜的結 構和生物物理特性的變化9,DNA的裝配過程以及生物大分子之間的交互作用10等。3.3 原子力顯微鏡對生物分子之間力譜曲線的觀測用 AFM 對生物大分子進行形態結構觀察的同時，還可對大分子的其它性質進行研究，如 配體一受體之間作用力11，抗原一抗體之間的作用力等。對生物分子表面的各種相互作 用力進行測量是原子力顯微鏡的一個十分重要的功能。這對

19、于了解生物分子的結構和物理 特性是非常有意義的，因為這種作用力決定兩種分子的相互吸引或者排斥，接近或者離開， 化學鍵的形成或者斷裂，生物分子立體構象的維持或者改變等等。在分子間作用力的支配 下,還同時支配著生物體內的各種生理現象、生化現象、藥物藥理現象，以及離子通道的開 放或關閉，受體與配體的結合或去結合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子間作 用力的研究，在某種意義上說，就是對生命體功能活動中最根本原理的研究。這也為人們 理解生命原理提供一個新的研究手段和工具，12將兩種分子分別固定于AFM的基底和探針 尖端上。然后使帶有一種分子的探針尖端在垂直方向上不斷地接近和離開基底上的另一種 分子

20、。這時，兩種分子間的相互作用力，就是二者間的相對距離的函數。這種力與距離間 的函數關系曲線，稱之為力譜曲線。對于作用力的測定，AFM對生物醫學樣品的制備，同樣 也有一定的要求或必須具備一定的特點。即需要將研究的兩種分子分別固定于基底和探針 尖端表面，而且還要求固定相對牢固。因此，樣品制備的難度比其他的要大的多。以鏈抗 生物素對尖端進行功能化處理為例，其過程大致如下:將AFM懸臂浸入乙酮5 min，然后紫外 線照射15 min;在37C的濕潤孵化器中，懸臂浸人一滴50KL生物素一 BSA（牛血清白蛋），孵 育過夜;用PBS磷酸緩沖液（州7.4）洗三次，除去非結合蛋白;室溫下懸臂浸入一滴501AL

21、鏈 抗生物素中，孵育10 min，在堿性環境中，使BSA吸附于懸臂;懸臂使用前，用PBS再沖洗三 次 即可。總之，將特定的配體或者受體固定于懸臂探針表面，將與之對應的 受體或者配體固定于基底表面，在懸臂探針表面與基底表面相接近或者分離的過程中，懸 臂受到偏折，從而測得兩個功能化表面之間的作用力，即配體-受體之間的作用力。通過對 AFM探針進行功能化修飾，使針尖的表面帶有特殊的官能團，用以識別存在于同一表面內的 不同官能團，進行表面組分成像。它可以實現納米范圍內化學反應特性的研究。AFM還可以實現同時對生物分子表面結構、作用力等的動態 實時觀測。如生物大分子的彈力、細胞壁的膨脹壓力以及各種微粒之

22、間的各種相互作用力 等。近年來，在AFM基礎上各種掃描力顯微術發展很快，主要有靜電力、摩擦力、磁力、剪 切力等顯微術。力對樣品的表面性質很敏感，根據檢測力的變化可以獲得樣品表面豐富的 信息。 4、 1近年來國內外研究表明，原子力顯微鏡在生醫學研究中的應用具有很大潛力，它是在納 米分辨率下研究生命科學的一個有力工具。如果我們將細胞學、免疫學、生物化學、分子 生物學、生物物理學等與原子力顯微技術有機地結合起來，將AFM和其他儀器設備(如透射 電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、生物質譜、核磁共振、 X 射線晶體 衍射等)有機地結合起來，相互補充、取長補短，一定會獲得很好的研究結果。可

23、以預見， 在不久的將來，AFM作為一項獨立的研究方法將日臻成熟，應用范圍也將日漸擴大，并將對 生命科學的發展做出重大的貢獻。參考文獻 1。 Binnig G， Quate C F， Gerber C 。 Atomicforce microscope。 Phys Rev Lett, 1986, 56; 930 9342 候萌，基于原子力顯微鏡應用的生物醫學的發展 . 3 張亦奕，牟建勛，邵志峰等.原 子力顯微鏡在結構生物學中的應用，電子顯微學報，1996,15(2-4):314一328 4 張德添，何昆，張颯等.原子力顯微鏡發展近況及其應用 ， 現代儀器， 2002,(3):6一9 5 黃益民，李稼，白春禮等.原子力顯微鏡對自由基損傷的紅 細胞膜表面精細結構的研究，北京生物醫學工程， 1999,18(1):18一23林璋，王深，白春禮等.亞精胺誘導DNA凝聚的有序性的AFM研究J),電子顯微學報， 1999,18(1):106