1、免疫學檢測技術 的基本原理免疫學檢測技術的基本原理免疫學檢測技術 的基本原理免疫學檢測技術的基本原理 免疫學診斷抗原或抗體的檢測淋巴細胞的測定免疫學檢測方法的應用免疫學檢測技術的基本原理 免疫學診斷抗原或抗體的檢測淋巴細胞的測定免疫學檢測方 目的要求1.掌握：凝集反應、沉淀反應、免疫 標記技術的概念；凝集反應、沉淀 反應、免疫標記技術的常用方法及 實際應用. 2.熟悉：細胞免疫檢測法的基本原理 及實際應用;3.了解：其他免疫學檢測方法及其應用 免疫學檢測技術的基本原理 目的要求1.掌握：凝集反應、沉淀反應、免疫免疫學(一)抗原抗體反應的特點 1.抗原抗體反應的特異性 2.抗原抗體反應的可逆性

2、4.抗原抗體反應的階段性： 特異性結合階段、肉眼可見階段 3.抗原抗體反應的可見性一、抗原抗體結合反應的特點及影響因素 免疫學檢測技術的基本原理(一)抗原抗體反應的特點 1.抗原抗體反應的特異性 2.抗原Ab 過剩Ag 過剩比例適當，交聯成網絡Ag-Ab反應的可見性免疫學檢測技術的基本原理Ab 過剩Ag 過剩比例適當，交聯成網絡Ag-Ab反應的可見（二）抗原抗體反應的影響因素電解質 抗原抗體（等電點pH3-5和pH5-6）在中性或弱堿性條件下帶有負電荷，需適當濃度的電解質（如0.85%NaCl）才會結合；溫度 通常為37酸堿度 最適pH值在6-8之間。pH值接近等電點時，抗原抗體多帶正負電荷相

3、等，由于自身吸引而出現凝集，導致非特異性反應。免疫學檢測技術的基本原理（二）抗原抗體反應的影響因素免疫學檢測技術的基本原理二、抗原或抗體的體外檢測方法免疫學檢測技術的基本原理二、抗原或抗體的體外檢測方法免疫學檢測技術的基本原理1.凝集反應直接凝集反應間接凝集反應 細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后形成凝集團塊稱凝集反應。免疫學檢測技術的基本原理1.凝集反應直接凝集反應間接凝集反應 細菌、紅細胞直接凝集反應的作法及應用玻片法：定性試驗,主要用于細菌與人類ABO血型的鑒定。試管法：半定量試驗.常用于檢測抗體的滴度或效價，臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗免疫學檢

4、測技術的基本原理直接凝集反應的作法及應用玻片法：定性試驗,主要用于細菌與人 1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:16 玻片法試管法直接凝集反應免疫學檢測技術的基本原理 1:2稀釋待測血清 1:4 間接凝集反應的應用常用的載體顆粒：人O型血紅細胞和 聚苯乙烯乳膠顆粒應用：鏈球菌O抗體的檢測實驗; 類風濕因子的檢測.Coombs試驗免疫學檢測技術的基本原理 間接凝集反應的應用常用的載體顆粒：人O型血紅細胞和 聚苯2.沉淀反應 可溶性抗原與相應抗體結合后出現沉淀物稱沉淀反應。單向免疫擴散免疫比濁法雙向免疫擴散免疫電泳 抗原或抗體的檢測免疫學檢測技術的基本原理2.沉淀反應 可溶性抗原與相應抗體結合

5、后出現沉單向免疫擴散的應用應用：測定血清中IgG、IgM、IgA 與補體C3的含量.缺點:12天才出結果。雙向免疫擴散的應用應用：根據沉淀線的數目和形狀可對抗原或抗體進行定性檢測、組分分析等。免疫學檢測技術的基本原理單向免疫擴散的應用應用：測定血清中IgG、IgM、IgA 對流免疫電泳可檢測： 血液中的HBsAg和AFP 免疫比濁法主要用于： 血清蛋白及抗體成分的分析研究免疫學檢測技術的基本原理對流免疫電泳可檢測：免疫比濁法主要用于：免疫學檢測技術的3.免疫標記技術 抗原或抗體的檢測 用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原用以測定相應抗原或抗體的技術稱為免疫標記技術。特點：敏感、特異、快速，能定

6、性、定量、定位。免疫學檢測技術的基本原理3.免疫標記技術 抗原或抗體的檢測 用熒光素、酶免疫印跡法免疫膠體金技術 放射免疫測定法免疫熒光技術化學發光免疫技術 免疫標記技術常用方法酶免疫測定法ELISA免疫學檢測技術的基本原理免疫印跡法免疫膠體金技術 放射免疫測定法免疫熒光技術(1)酶免疫測定法（ELISA） ： 1971年瑞典學者Engvail和Perlman-nn,荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯免疫吸附試驗。免疫學檢測技術的基本原理(1)酶免疫測定法（ELISA） ：免疫學檢測技術的基本原理 抗原或抗體的檢

7、測間接法: 常用于檢測血清中的抗體。將已知抗原包被于固相載體，加入待檢標本，若標本中有相應的抗體，則可與抗原結合，再加入酶標二抗，洗滌后加底物，底物受酶的催化發生化學反應產生有色物質。 免疫學檢測技術的基本原理 抗原或抗體的檢測間接法:免疫學檢測技術的基本原理此法是測定抗體最常用的方法。 間接法已知抗原待測抗體酶標抗體免疫學檢測技術的基本原理此法是測定抗體最常用的方法。 間接法已知抗原待測 抗原或抗體的檢測雙抗體夾心法: 常用于檢測標本中的抗原。將已知抗體包被在固相載體上，加入待測標本，使其中的抗原與抗體結合，洗去未結合的抗原，加入已知的酶標抗體與標本中抗原結合，再洗去未結合的酶標抗體，加入底

8、物，底物受酶的催化發生化學反應產生有色物質。 免疫學檢測技術的基本原理 抗原或抗體的檢測雙抗體夾心法:免疫學檢測技術的基本原雙抗體夾心法抗體待測抗原酶標抗體底物免疫學檢測技術的基本原理雙抗體夾心法抗體待測抗原酶標抗體底物免疫學檢測技術的基本原理BAS-ELISA:可用來檢測細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。 生物素與抗生物素有極高的親和力，利用抗生物素為橋梁，聯結生物素化的抗體及生物素化過氧化物酶，可獲得極高的敏感性（多級放大系統）。 -Ab+待測Ag+ Ab-生物素化+抗生物素（四價）+ 生物素化E+底物免疫學檢測技術的基本原理BAS-ELISA:可用來檢測細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等 BA

9、S-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗體以及DNA、RNA的檢測。卵白及某些微生物中的蛋白質免疫學檢測技術的基本原理 BAS-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗體以及DN 抗原或抗體的檢測微粒捕獲酶免疫分析技術 常用于檢測腫瘤標志物(CEA、AFP)性激素、甲狀腺素（T3、T4）、HCG等微量可溶性抗原 。將已知抗體致敏的微粒與生物素親和素酶放大系統結合，最后酶作用于熒光底物，通過檢測熒光強度來判斷未知抗原的含量。 免疫學檢測技術的基本原理 抗原或抗體的檢測微粒捕獲酶免疫分析技術 免疫學檢測磁性微粒子固相：直徑2.8微米，粒子小，懸 液類似液相；包被面積大；磁吸引分離方便。免疫學檢測技

10、術的基本原理磁性微粒子固相：直徑2.8微米，粒子小，懸免疫學檢測技術的基 抗原或抗體的檢測免疫組化技術：指帶顯色劑（酶）標記的特異性抗體或抗原在組織細胞原位發生抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原或抗體進行定位、定性、定量檢測的技術。 免疫學檢測技術的基本原理 抗原或抗體的檢測免疫組化技術：指帶顯色劑（酶）標記的免疫組化技術免疫學檢測技術的基本原理免疫組化技術免疫學檢測技術的基本原理(2)免疫熒光技術 是用熒光素標記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白等.免疫學檢測技術的基本原理(2)免疫熒光技術免疫學檢測技術的基本原理直接熒光法：檢測不同的抗

11、原，需要不同的特異性熒光抗體間接熒光法：用一抗與樣本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。此方法既可檢測抗原又可檢測抗體。若查抗原，一抗為已知的；若查抗體，抗原是已知的。一種熒光抗體可用于多種不同抗原的檢測免疫學檢測技術的基本原理直接熒光法：檢測不同的抗原，需要不同的特異性熒光抗體免疫學檢(3)放射免疫測定法(RIA）：是用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結合的特異性結合起來，具有重復性好、準確性高等優點. 用于激素、藥物等微量物質的檢測，敏感性可達到pg/ml水平。常用的放射性核素有131I和125I等。免疫學檢測技術的基本原理(3)放射免疫測定法(RIA

12、）：是用放射性核素標記抗原或抗體(3)化學發光免疫技術（CLIA）： 將化學發光（如魯米諾）分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。 特點：靈敏度高、特異性強 分離簡便、自動化分析。免疫學檢測技術的基本原理(3)化學發光免疫技術（CLIA）：免疫學檢測技術的基本原理（4）免疫膠體金技術（ICS）： 用膠體金顆粒標記抗體或抗原，以檢測未知抗原或抗體的方法稱免疫膠體金技術。 免疫學檢測技術的基本原理（4）免疫膠體金技術（ICS）：免疫學檢測技術的基本原理（5）免疫印跡技術 又稱Western blotting，是將十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離得到的蛋白轉移到

13、固相載體膜上，再用標記的特異性抗血清或單克隆抗體對蛋白質進行定性及定量分析的技術。敏感性為15ng。免疫學檢測技術的基本原理（5）免疫印跡技術免疫學檢測技術的基本原理4、蛋白質芯片技術 常用于微生物感染的檢測。其原理是將各種蛋白質固定于載體上制成芯片，再用熒光標記抗體與芯片作用，洗去未結合的抗體后，用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術測定芯片上各點熒光強度，以此檢測熒光對應的抗體及其相互結合的程度。免疫學檢測技術的基本原理4、蛋白質芯片技術免疫學檢測技術的基本原理三、免疫細胞的測定人的免疫細胞測定：外周血動物的免疫細胞測定： 外周血、胸腺、脾臟與其他組織。免疫學檢測技術的基本原理三、免疫細胞的測定

14、人的免疫細胞測定：外周血動物的免疫細胞測定常用的方法：葡萄糖-泛影葡胺密 度梯度離心法。 外周血單個核細胞的分離 淋巴細胞及其亞群的分離1.免疫吸附分離法:獲得不同的T細胞亞群2.免疫磁珠分離法：獲得不同表面標志的 活T細胞亞群. 3.免疫磁珠法4.抗原肽-MHC分子四聚體技術 免疫學檢測技術的基本原理常用的方法：葡萄糖-泛影葡胺密 外周血單個核細胞的分離 免疫吸附分離法： 將已知抗淋巴細胞表面標志的抗體包被聚苯乙烯培養板，加入淋巴細胞懸液，表達相應細胞表面標志的淋巴細胞可被吸附在培養板上，即可與其他細胞分開。 免疫學檢測技術的基本原理免疫吸附分離法：免疫學檢測技術的基本原理免疫吸附分離法加入

15、淋巴細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清免疫學檢測技術的基本原理免疫吸附分離法加入淋巴anti-CD4anti-CD4ant免疫磁珠法:應用較廣泛 是一種特異性分離所需淋巴細胞的方法。首先將特異性抗體（如抗CD3、抗CD4或抗CD8等）吸附在磁性微珠上，與待測細胞懸液中的相應細胞特異性結合后,再將磁珠結合細胞與未結合磁珠細胞分開，即可獲得純度高的所需細胞。 免疫學檢測技術的基本原理免疫磁珠法:應用較廣泛免疫學檢測技術的基本原理磁珠分離法免疫學檢測技術的基本原理磁珠分離法免疫學檢測技術的基本原理熒光激活細胞分選儀分離法： （流式細胞術分離法） 是一種集光學、流體力學、電

16、力學和計算機技術于一體，可對細胞進行多參數定量測定和綜合分析方法. 定量分析活細胞表面表達的特異分子 免疫細胞分析和細胞計數。 白血病和淋巴瘤的免疫學分型。 細胞周期和細胞凋亡檢測。免疫學檢測技術的基本原理熒光激活細胞分選儀分離法：免疫學檢測技術的基本原理流式細胞術熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器免疫學檢測技術的基本原理流式細胞術熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液細胞分選器熒光檢抗原肽-MHC分子四聚體技術 將特異性抗原肽段、可溶性MHC-類分子重鏈及2微球蛋白在體外正確折疊，在親和素存在下構建四聚體，并結合流式細胞儀定量檢測外周血及組織中抗原特

17、異性CTL的比率。 免疫學檢測技術的基本原理抗原肽-MHC分子四聚體技術免疫學檢測技術的基本原理淋巴細胞及其亞群的分離免疫細胞功能測定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術肽MHC四聚體技術T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發型超敏反應的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法（三）淋巴細胞功能的測定免疫學檢測技術的基本原理淋巴細胞及其亞群的分離免疫細胞磁珠分離法免疫吸附分離法流式細1.T淋巴細胞功能的測定 形態學方法：T淋巴母細胞轉化試驗. 3H-TdR

18、摻入法:靈敏性高,但有放射污染. MTT法：靈敏性不及3H-TdR摻入法,但 無放射污染.（4）遲發型超敏反應（DTH）的檢測 免疫學檢測技術的基本原理1.T淋巴細胞功能的測定（4）遲發型超敏反應（DTH）的檢測形態學方法：T淋巴母細胞轉化試驗 T淋巴細胞在體外培養時，在有絲分裂原刺激下,可轉化為T淋巴母細胞(體積增大、細胞形態不規則、胞質增多、細胞核松散及出現較多核仁)。通過觀察培養細胞的數量，了解其細胞的增殖變化。免疫學檢測技術的基本原理形態學方法：T淋巴母細胞轉化試驗 免疫學檢測技術的3H-TdR摻入法: T細胞增殖過程中DNA和RNA合成會增加。在細胞培養液中加入氚標記的胸腺嘧啶核苷(

19、3H-TdR）或125I標記的尿嘧啶核苷（125-UdR），則會被摻入細胞核中。培養結束后收集細胞，用液體閃爍儀測定樣本中放射性活性，可反映細胞的增殖水平。 靈敏性高, 有放射污染。免疫學檢測技術的基本原理3H-TdR摻入法:免疫學檢測技術的基本原理放射性測定3H-TdR絲裂原刺激淋巴細胞轉化試驗原理示意免疫學檢測技術的基本原理放射性測定3H-TdR絲裂原刺激淋巴細胞轉化試驗原理示意免疫 MTT法：靈敏性不及3H-TdR摻入法 但無放射污染. T細胞增殖時，線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為紫褐色的甲臜顆粒，該顆粒被隨后加入的異丙醇或二甲基亞砜溶解。用酶標儀測定細胞培養上清液中溶解紫褐色甲臜

20、的OD值，即反映細胞的增殖水平。 （ MTT一種噻唑鹽，二苯基溴化四唑，淡黃色可溶性物質）。免疫學檢測技術的基本原理 MTT法：靈敏性不及3H-TdR摻入法 免疫學檢測技遲發型超敏反應（DTH） 體內檢測細胞免疫功能的皮試方法原理：被抗原已致敏的機體，再用相同的抗原作皮試可導致遲發型超敏反應， 72小時后局部充血、滲出、紅腫和硬結。細胞免疫正常者出現陽性反應，細胞免疫低下者則呈弱陽性或陰性反應。 免疫學檢測技術的基本原理遲發型超敏反應（DTH）免疫學檢測技術的基本原理常用于檢測某些微生物感染免疫學檢測技術的基本原理常用于檢測某些微生物感染免疫學檢測技術的基本原理 2.B淋巴細胞增殖試驗 (1)

21、利用前面介紹的抗原抗體檢測方法 測定標本中抗體含量。 (2)抗體形成細胞測定試驗： 又稱溶血空斑形成細胞試驗,可 檢測產生抗體的B細胞數量。 3.細胞毒試驗:是檢測CTL、NK等細胞殺傷靶細胞活性的細胞學技術。主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應和病毒感染等方面的研究。 免疫學檢測技術的基本原理 2.B淋巴細胞增殖試驗3.細胞毒試驗:是檢測CTL、NK等4.吞噬細胞功能測定 顯微鏡測定法 吞噬率（）=（吞噬細菌的吞噬細胞數 200個吞噬細胞）100 吞噬指數=（200個吞噬細胞中所吞噬的細菌 總數 200個吞噬細菌的吞噬細胞） 100 免疫學檢測技術的基本原理4.吞噬細胞功能測定 顯微鏡測定法免疫學

22、檢測技術的基本原5細胞因子的測定 細胞因子的檢測有助于了解其在免疫調節中的作用，監測細胞免疫功能。常檢測的細胞因子有IL-2、IL-4、IL-10、IFN-等。常用的方法主要有生物活性檢測法、ELISA法等。免疫學檢測技術的基本原理5細胞因子的測定 免疫學檢測技術的基本原理三、免疫學檢測的應用（一）協助診斷感染性疾病（三）協助診斷免疫系統疾病（四）進行免疫學監測（二）協助診斷腫瘤免疫學檢測技術的基本原理三、免疫學檢測的應用（一）協助診斷感染性疾病（三）協助診斷免思考題1.解釋名詞 凝集反應 沉淀反應 免疫標記技術2.可用哪些方法定量檢測血液標本中的抗原？3.可用哪些方法檢測組織中的抗原？4.H

23、IV、HBV感染者的診斷和病情監測可用哪些方法?免疫學檢測技術的基本原理思考題1.解釋名詞免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（一）免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（一）免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（二）免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（二）免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（三）免疫學檢測技術的基本原理凝集反應原理圖解（三）免疫學檢測技術的基本原理 單向瓊脂擴散試驗免疫學檢測技術的基本原理 單向瓊脂擴散試驗免疫學檢測技術的基本原 雙向瓊脂擴散試驗免疫學檢測技術的基本原理 雙向瓊脂擴散試驗免疫學檢測技術的基免疫電泳(immunoelectrophoresi

24、s)免疫學檢測技術的基本原理免疫電泳(immunoelectrophoresis)免疫學 對流免疫電泳免疫學檢測技術的基本原理 對流免疫電泳 火箭電泳免疫學檢測技術的基本原理 火箭電泳免疫測吸光度抗體抗原免疫復合物的濃度與透射光的衰減呈正相關。免疫比濁法原理免疫學檢測技術的基本原理測吸光度抗體抗原免疫復合物的濃度與透射光的衰減呈正相關。免疫 免疫熒光技術免疫學檢測技術的基本原理 免疫熒光技術免疫學檢測技 酶聯免疫吸附試驗(ELISA-間接法)免疫學檢測技術的基本原理 酶聯免疫吸附試驗(ELISA-間接法)免疫學檢測斑點金免疫層析試驗膠體金：氯金酸（HAuCl4）在還原劑的作用下，可聚合成特定大

25、小的金顆粒，因其在靜電作用下而呈穩定的膠體狀態，故稱膠體金。免疫學檢測技術的基本原理斑點金免疫層析試驗膠體金：氯金酸（HAuCl4）在還原劑的作斑點金免疫層析試驗 用膠體金作為標記物來檢測抗原或抗體的方法。膠體金顆粒聚集后呈紅色，可用于標記多種大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。免疫學檢測技術的基本原理斑點金免疫層析試驗 用膠體金作為標記物來檢測抗原或抗體 兔抗鼠IgG鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線 手持端斑點金免疫層析試驗（一）免疫學檢測技術的基本原理 兔抗鼠IgG鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線斑點金免疫層析試驗（二）尿樣

26、陽性弱陽性陰性無效免疫學檢測技術的基本原理斑點金免疫層析試驗（二）尿樣陽性弱陽性陰性無效免疫學檢測技術免疫印跡法圖解裂解病毒聚丙酰胺凝膠電泳-+ 95 68 45 12KD電轉印至NC膜上置待測血清中，漂洗；加酶標抗抗體，漂洗；加底物 顯色120 41 24KD十二烷基磺酸鈉SDS免疫學檢測技術的基本原理免疫印跡法圖解裂解病毒聚丙酰胺凝膠電泳-+ 9 T細胞亞群的檢測免疫學檢測技術的基本原理 T細胞亞群的檢測免疫學檢測技術的基本原理抗凝血 分層液 抗凝血血漿 白膜層 紅細胞離心淋巴細胞的分離免疫學檢測技術的基本原理抗凝血 分層液 抗凝血血漿 白膜層 紅細胞離心淋巴細胞的分離 T細胞亞群的檢測花

27、環法（一）免疫學檢測技術的基本原理 T細胞亞群的檢測花環法（一）免疫學檢測技術的 T細胞亞群的檢測花環法（二）免疫學檢測技術的基本原理 T細胞亞群的檢測花環法（二）免疫學檢測技術的基PHA淋巴母細胞轉化試驗示意圖細胞淋巴母細胞免疫學檢測技術的基本原理PHA淋巴母細胞轉化試驗示意圖細胞淋巴母細胞免淋轉（標本片）淋巴母細胞免疫學檢測技術的基本原理淋轉（標本片）淋巴母細胞免疫學檢測技術的基本原理淋轉（標本片）免疫學檢測技術的基本原理淋轉（標本片）免疫學檢測技術的基本原理淋轉（標本片）免疫學檢測技術的基本原理淋轉（標本片）免疫學檢測技術的基本原理操作流程1.制備抗體包被板（試劑盒中所帶） 2.加待測標本及對照品；加酶標記物 3.溫育，37 30min 4.漂洗（磷酸緩沖鹽水） ,20s*5次 5.加底物(四甲基聯苯胺)、顯色劑(H2O2)37 5min 6.結果測定EEEEEEEE底物系統抗AFP抗體AFP酶標抗體雙抗體夾心復合物免疫學檢測技術的基本原理操作流程1.制備抗體包被板（試劑盒中所帶） 2.加待測標本及4.蛋白質芯片技術免疫學檢測技術的基本原理4.蛋白質芯片技術免疫學檢測技術的基本原理抗原肽-MHC四聚體分離技術親和素抗原肽MHC I生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD