1、第二十一章基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療能夠在比較短的時間從理論設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實，主要是由于分子生物學(xué)的理論及技術(shù)方法，特別是重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，使人們可以在實驗室構(gòu)建各種載體、克隆及分析目標基因。所以對疾病能夠深入至分子水平的研究，并已取得了重大的進展。因此在20世紀70年代末誕生了基因診斷(genediagnosis)；隨后于1990年美國實施了第一個基因治療(genetherapy)的臨床試驗方案。可見，基因診斷和基因治療是現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合的范例。第一節(jié)基因診斷基因診斷的含義傳統(tǒng)對疾病的診斷主要是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，如患者的癥狀、血尿各項指標的變化，或物

2、理檢查的異常結(jié)果，然而表型的改變在許多情況下不是特異的，而且是在疾病發(fā)生的一定時間后才出現(xiàn)，因此常不能及時作出明確的診斷。現(xiàn)知各種表型的改變是由基因異常造成的，也就是說基因的改變是引起疾病的根本原因。基因診斷是指采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)(DNA水平)或功能(RNA水平)是否異常，以此來對相應(yīng)的疾病進行診斷。基因診斷有時也稱為分子診斷或DNA診斷(DNAdiagnosis)。基因診斷是病因的診斷，既特異又靈敏，可以揭示尚未出現(xiàn)癥狀時與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，從而可以對表型正常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預(yù)測，特別對確定有遺傳疾病家族史的個體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶

3、致病基因的檢測具有指導(dǎo)意義。基因診斷的原理及方法一)基因診斷的原理疾病的發(fā)生不僅與基因結(jié)構(gòu)的變異有關(guān)，而且與其表達功能異常有關(guān)。基因診斷的基本原理就是檢測相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常。由于DNA的突變、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)變異，因此，可以直接檢測上述的變化或利用連鎖方法進行分析，這就是DNA診斷。對表達產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量變化的分析為RNA診斷(RNAdiagnosis)。(二)基因診斷的方法基因診斷是以核酸分子雜交(nucleicacidmolecularhybridization)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為核心發(fā)展起來的多種方法，同時配合DN

4、A序列分析，近年新興的基因芯片可能會發(fā)展成為一種很有用的基因診斷方法。DNA診斷常用檢測致病基因結(jié)構(gòu)異常的方法有下列幾種。斑點雜交：根據(jù)待測DNA樣本與標記的DNA探針雜交的圖譜，可以判斷目標基因或相關(guān)的DNA片段是否存在，根據(jù)雜交點的強度可以了解待測基因的數(shù)量。等位基因特異的寡核苷酸探針(allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe)雜交：是一種檢測基因點突變的方法，根據(jù)點突變位點上下游核苷酸序列，人工合成約19個核苷酸長度的片段，突變的堿基位于當中，經(jīng)放射性核素或地高辛標記后可作為探針，在嚴格雜交條件下，只有該點突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點，即

5、使只有一個堿基不配對，也不可能形成雜交點。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作為正常探針。如果受檢的DNA樣本只能與突變ASO探針，不與正常ASO探針雜交，說明受檢二條染色體上的基因都發(fā)生這種突變，為突變純合子；如果既能與突變ASO探針又能與正常ASO探針雜交,說明一條染色體上的基因發(fā)生突變，另一條染色體上為正常基因，為這種突變基因的雜合子；如果只能與正常ASO探針雜交，不能與突變ASO雜交，說明受檢者不存在該種突變基因，如圖21-1所示。若與PCR方法聯(lián)合應(yīng)用，即PCR/ASO探針雜交法(PCR/ASOprobehybridization)，是一種檢測基因點突變的簡便方法，先

6、用PCR方法擴增突變點上下游的序列，擴增產(chǎn)物再與ASO探針雜交，可明確診斷突變的純合子和雜合子。此法對一些已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙酮尿癥等純合子和雜合子的診斷很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的點突變。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)分析相同長度的單鏈DNA因其序列不同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不盡相同，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時速度就不同，若單鏈DNA用放射性核素標記，顯影后即可區(qū)分電泳條帶。一般先設(shè)計引物對突變點所在外顯子進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性成單鏈后進行電泳分析。PCR/SS

7、CP方法，能快速、靈敏、有效地檢測DNA突變點，如圖21-2，此法可用檢測點突變的遺傳疾病，如苯丙酮尿癥、血友病等，以及點突變的癌基因和抑癌基因。限制性內(nèi)切酶圖譜(restrietionmap)分析，如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內(nèi)切酶的識別位點，使原來某一識別位點消失，或形成了新的識別位點，那么相應(yīng)限制性內(nèi)切酶片段的長度和數(shù)目會發(fā)生改變。一般基因組DNA經(jīng)該種限制性內(nèi)切酶水解，再做Southern印跡，根據(jù)雜交片段的圖譜，可診斷該點突變，如圖21-3所示。如果用PCR擴增該突變點的外顯子，PCR產(chǎn)物經(jīng)該種酶消化后，進行瓊脂糖電泳，溴乙錠染色后可直接觀察片段的大小及數(shù)目。此法可用于檢測有

8、些限制性內(nèi)切酶識別位點消失的遺傳疾病，如鐮狀細胞貧血。或基因缺失的疾病如a地中海貧血癥，單純性生長激素缺乏癥等。限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)遺傳連鎖分析人群中個體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計每100-200個核苷酸中便有1個發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。有些DNA多態(tài)性可改變某一限制性內(nèi)切酶的識別位點，因而產(chǎn)生了DNA限制性片段長度多態(tài)性。RFLP按孟德爾方式遺傳，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因與特定的多態(tài)性片段連鎖，可以遺傳給子代，因此這一多態(tài)性片段可作為遺傳標記，來判斷該家庭成員或胎兒的基因組中是

9、否攜帶該致病基因，見圖21-4，此法可用于診斷甲型血友病、苯丙酮尿癥、享延頓舞蹈病等。(6)DNA序列分析對致病有關(guān)的DNA片段進行序列測定，是診斷基因異常(已知和未知)最直接和準確的方法。RNA診斷RNA診斷主要是分析基因的表達功能，檢測轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)和量，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小。(l)RNA印跡(Northernblot)RNA印跡是檢測基因是否表達，表達產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強度，可以判斷基因表達的效率。RT-PCR是一種檢測基因表達產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結(jié)合可對RT-PCR產(chǎn)物量進行準確測定。基因診斷的應(yīng)用遺傳疾病現(xiàn)知遺傳疾病有

10、數(shù)千種，但多數(shù)遺傳疾病屬少見病例，有些遺傳疾病在不同民族，不同地區(qū)的人群中發(fā)病率不同，例如鐮狀細胞貧血(sicklecellanemia),非洲黑色人種發(fā)病率高，而囊性纖維化癥(cysticfibrosis)常見于美國白色人種，這二種遺傳疾病在我國為罕見病例。中國較常見的遺傳疾病有地中海貧血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿癥、杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)、葡萄糖-6磷酸脫氫酶(G-6PD)缺乏癥、唐氏綜合癥(Downssyndrome)等。根據(jù)不同遺傳疾病的分子基礎(chǔ)，可采用不同的技術(shù)方法進行診斷，不但可對有癥狀患者進行檢測，而且對遺傳疾病家族中未發(fā)病的成員乃至胎兒甚至胚胎著床前(preimpl

11、antation)進行診斷是否攜帶有異常基因，這對婚育具有指導(dǎo)意義。地中海貧血(地貧)是世界上最常見和發(fā)生率最高的一種單基因遺傳疾病(monogenicdisease)，由于一種或幾種珠蛋白合成障礙導(dǎo)致a類與B類珠蛋白不平衡造成的，臨床以貧血、黃疸、肝脾腫大及特殊外貌為特征，地貧最常見的有兩類：a地貧和B地貧。a地貧(a-thalassemias)的分子基礎(chǔ)主要為a珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于堿基突變造成的。可采用限制性內(nèi)切酶圖譜方法檢測a珠蛋白基因的缺失。人a珠蛋白基因簇位于16號染色體，長度29kb,包含7個連鎖的a類基因或假基因。a基因(al及a2編碼序列相同，僅非編碼序列稍有差別

12、，產(chǎn)物相同),該基因簇上有2個EcoRI識別位點，經(jīng)EcoRI酶解，進行Southern印跡，用標記的a基因片段作探針，得到一條23kb的雜交條帶，BamHI識別位點有4個，但只有14kb片段能與mRNA基因探針雜交，見圖21-5。HbBarts胎兒水腫綜合征：由于該病患兒二條16號染色體的4個a珠蛋白基因均缺失，不能合成a鏈，胎兒全身水腫、肝脾腫大、四肢短小，常于妊娠3040周死亡或早產(chǎn)后半小時內(nèi)死亡。樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析不能顯示a珠蛋白基因區(qū)帶，RNA診斷也測定不出有a珠蛋白基因的mRNA。缺失型HBH病：由于一條16號染色體上的兩個a珠蛋白基因均缺失，另一條16號染色體上則缺

13、失一個a珠蛋白基因，并缺失kb長度的DNA片段（右側(cè)缺失型）或kb片段（左側(cè)缺失型），DNA診斷只產(chǎn)生19kb長度的EcoRI片段，或10kbBamHI片段。標準型a地貧：一條16號染色體上2個a珠蛋白基因全部缺失。而另一條16號染色體上具有2個正常的a珠蛋白基因，DNA診斷結(jié)果，EcoRI和BamHI都出現(xiàn)與正常一樣的23kb或14kb的條帶，但雜交條帶的放射性自顯影較正常人淺。B地貧（B-thalassemias）的基因診斷：B地貧的分子基礎(chǔ)不同于a地貧，B珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因點突變或個別堿基的插入或缺失。每一民族和人群B珠蛋白基因點突變部位不盡相同，都有特定的類型譜。（二

14、）感染性疾病過去對感染性疾病（infectiousdiseases）的診斷，一是直接分離檢查病原體，或者對患者血清學(xué)或生物化學(xué)的分析。有些病原體不容易分離，有些需經(jīng)過長期培養(yǎng)才能獲得。血清學(xué)對病原體抗體的檢測雖然很方便，但是病原體感染人體后需要間隔一段時間后才出現(xiàn)抗體，并且血清學(xué)檢查只能確定是否接觸過該種病原體，但不能確定是否有現(xiàn)行感染，對潛伏病原體的檢查有困難。對感染性疾病的基因診斷具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點。80年代建立的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對病原體的檢測。一般根據(jù)各病原體特異和保守的序列設(shè)計引物，有的還合成ASO探針，對病原體的DNA可用PCR技術(shù)直接檢查，而對RNA病毒，則采用RT-

15、PCR。現(xiàn)在市場已經(jīng)有許多種病原體的測定藥盒供應(yīng)，每一盒包含擴增某種病原體的特異引物，所需的酶以及配妥的各種反應(yīng)試劑，并附有可行的操作方法步驟。病毒性感染：多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測相應(yīng)的病原體，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)類病毒、腺病毒、EB病毒、皰疹病毒、人巨細胞病毒、乳頭狀病毒等。最近新發(fā)現(xiàn)的SARS冠狀病毒，在基因組（RNA）序列確定后，便很快建立了RT-PCR的基因診斷法。細菌性感染：可應(yīng)用基因診斷檢測多種致病性的細菌，如結(jié)核分枝桿菌、痢疾性大腸桿菌霍亂弧菌、淋球菌、綠膿桿菌等。寄生蟲：惡性瘧原蟲、克魯斯錐蟲、利什曼原蟲、血吸蟲、弓形

16、蟲等都有基因診斷的方法其它:如衣原體、支原體、真菌性感染也均用基因診斷。（三）惡性腫瘤分析一些原癌基因的點突變、插入突變、基因擴增、染色體易位和抑癌基因的丟失或突變，可以了解惡性腫瘤的分子機制，有助于對惡性腫瘤的診斷，對腫瘤治療及預(yù)后有指導(dǎo)意義。（四）法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用對生物個體識別和親子鑒定傳統(tǒng)的方法有血型、血清蛋白型、紅細胞酶型和白細胞膜抗原（HLA）等，但這些方法都存在著一些不確定的因素。近年來對人基因結(jié)構(gòu)的深入研究發(fā)現(xiàn)，有些具有個體特征的遺傳標記可用于個體識別和親子鑒定。DNA指紋分析(DNAfingerprinting)近年研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中許多位點存在著一種可變串聯(lián)重復(fù)序列(var

17、iablenumberoftandemrepeat,VNTR)。這種VNTR主要存在于基因的非編碼區(qū)，重復(fù)序列是頭對尾串聯(lián)排列著。人類某些?VNTR是由20-50個重復(fù)單位組成，每個單位含15-100bp，DNA的長度為1kb至5kb，較普通衛(wèi)星DNA(約100kb)小，所以稱為小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VNTR有高度的多態(tài)性，在人群中的分布表現(xiàn)高度的個體特異性，甚至同一個體同源染色體的等位VNTR的重復(fù)單位數(shù)也不同，等位基因按孟德爾方式遺傳。VNTR區(qū)的重復(fù)單位數(shù)目不同，所以該區(qū)的DNA長度不同。但每一位點VNTR的核心序列卻有高度的保守性，因此可認為VNT

18、R是一種判斷個體的遺傳標記。1985年，Jeffreys根據(jù)VNTR的特點，選擇某些核心序列作為探針，并選用核心序列無切割位點的限制性內(nèi)切酶如Hinfl,對DNA樣品進行酶解，然后作Southern印跡。圖譜顯示不同個體具有不同條帶，如同人的指紋具有高度的個體特異性一樣，因此把這種Southern印跡圖稱作DNA指紋圖譜(DNAfingerprint)，如圖21-6所示。實驗證明，除同卵雙生子有相同的圖譜外，兩個人不可能有完全相同的圖譜，所以這種方法對個體識別，親子鑒定，嫌疑罪犯的判斷準確可靠。圖21-7是引自文獻報道的結(jié)果。可是Sourthern印跡技術(shù)操作繁瑣，所需時間長，需要DNA量較大

19、，若DNA降解還會影響對結(jié)果的判斷。所以，Jeffreys又根據(jù)每一VNTR區(qū)翼側(cè)保守序列設(shè)計引物，用PCR方法對該區(qū)進行擴增，因VNTR長度不同，所以產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，染色后，根據(jù)條帶的不同，可以判斷結(jié)果。這種方法既方便又省時，對部分酶解DNA也適用，對單根毛發(fā)，血斑，皮屑和精跡都可進行分析。但有些VNTR重復(fù)片斷較長，PCR難以擴增。短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat,STR)多態(tài)性分析90年代初，發(fā)現(xiàn)人基因組中存在著數(shù)量眾多的STR,STR的重復(fù)單元較短，核心序列含2-4bp，DNA片段長度為100-500bp，故稱為微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA).與

20、VNTR相同，有不少的微衛(wèi)星DNA存在著個體間重復(fù)單元數(shù)目不同的多態(tài)性，所以是一種應(yīng)用價值很高的遺傳標記。又因為微衛(wèi)星DNA較短，易進行PCR操作，也能適用于降解的DNA分析。目前，STR-PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已占主導(dǎo)地位。VNTR和STR除在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用外，還用于遺傳作圖，基因定位及遺傳疾病的診斷等。第二節(jié)基因治療基因治療的慨念基因治療的定義從基因角度可以理解為對缺陷的基因進行修復(fù)或?qū)⒄Ｓ泄δ艿幕蛑脫Q或增補缺陷基因的方法。若從治療角度可以廣義地說是一種基于導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以改變患者細胞的基因表達從而達到治療或預(yù)防疾病的目標的新措施。導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因相對應(yīng)的有功能的同源基因或

21、與缺陷基因無關(guān)的治療基因。基因治療有兩種形式，一種是改變體細胞的基因表達，即體細胞基因治療(somaticgenetherapy)，另一種是改變生殖細胞的基因表達，即種系基因治療(germlinegenetherapy)，從理論上講，若對缺陷的生殖細胞進行矯正，不但當代可以得到根治，而且可以將正常的基因傳給子代。但生殖的生物學(xué)極其復(fù)雜且尚未清楚，一旦發(fā)生差錯將給人類帶來不可想象的后果，涉及一系列倫理學(xué)的問題，目前還不能用于人類。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于體細胞，基因型的改變只限于某一類體細胞，其影響只限于某個體的當代。二）基因治療的方式基因治療的方式（typeofgenetherapy）主

22、要有3類，一類為基因矯正或置換，即對缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復(fù)，或以正常基因原位置換異常基因，因此不涉及基因組的任何改變，目前尚無體內(nèi)成功的報道。另一類為基因增補，不去除異常基因，而是通過外源基因的導(dǎo)入，使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因的功能。再有一類為基因封閉，有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌（decoy）轉(zhuǎn)錄因子來封閉或消除這些有害基因的表達。除上述3大類外，近日發(fā)展其它多種形式，如導(dǎo)入病毒或細菌來源的所謂“自殺基因”或經(jīng)過改造的條件性復(fù)制病毒，只能在p53缺陷的腫瘤細胞繁殖以達到溶解腫瘤細胞。（三）導(dǎo)入的方式導(dǎo)入

23、基因有兩種方式，一種是體外導(dǎo)入（exvivo）,即在體外將基因?qū)爰毎麅?nèi)，再將這種基因修飾過的細胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細胞在體內(nèi)表達，從而達到治療或預(yù)防的目的。被用于修飾的細胞可以是自體，同種異體或異種的體細胞。合適的細胞應(yīng)易于從體內(nèi)取出和回輸，能在體外增殖，經(jīng)得起體外實驗操作，能夠高效表達外源基因，且能在體內(nèi)長期存活。目前常用的細胞有淋巴細胞、骨髓干細胞、內(nèi)皮細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、肌細胞、角朊細胞（keratinocyte）、多種腫瘤細胞等。另一種是體內(nèi)導(dǎo)入（invivo），即將外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進入相應(yīng)的細胞并進行表達。外源治療基因無論是exvi

24、vo或invivo導(dǎo)入基因的方式，首先要選擇合適的能達到治療或預(yù)防用的目的基因。如導(dǎo)入遺傳疾病所缺陷的基因或增強機體免疫的細胞因子基因。目前用于臨床試驗的治療基因主要為該基因的cDNA。一些臨床試驗用的基因見表21-1作為外源治療基因的條件：基因的大小要根據(jù)所用載體（vector）能夠運載的容量；若為分泌性產(chǎn)物需含信號肽序列；cDNA序列應(yīng)正確無誤；翻譯時要求有起始密碼子及終止密碼子。載體系統(tǒng)要有效將治療基因?qū)肴梭w細胞內(nèi)需要靠合適的運送基因的工具，即載體（vector），載體有兩類：一類為病毒載體（viralvector）,另一類為非病毒載體（non-viralvector）目前臨床636個

25、基因治療方案所用的載體列于表21-2目前臨床試驗用的載體仍然以病毒載體居多，占70%以上，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體約占所用全部載體的1/3。非病毒載體以脂質(zhì)體居多，而裸質(zhì)粒DNA的應(yīng)用有逐漸上升的趨勢。目前所用的載體尚不盡人意，有些是存在著安全性問題，有些則為效率不高等缺點。下面將討論幾類常用載體的構(gòu)建極其優(yōu)點。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）屬RNA病毒，通過其本身逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，形成雙鏈DNA原病毒，然后整合于宿主細胞染色體中，詳細的基因結(jié)構(gòu)及生活史見第十三章。構(gòu)建載體時以DNA原病毒為基礎(chǔ)，將野生型病毒的3類結(jié)構(gòu)基因gag，pol和env刪除，以供外源基

26、因的插入，但是要保存病毒的包裝序列（血）和雙側(cè)的長末端重復(fù)（LTR）,LTR含有啟動子、增強子、整合信號及polyA信號等多種元件。插入的基因一般為兩種或兩種以上，一種為標記基因（markergene）供陽性篩選,常用的為原核細胞的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II（NPTII,neoR基因），該酶能破壞抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳動物細胞在含G418的培養(yǎng)液中不能生長,若含有neoR基因能產(chǎn)生NPTII,即能在含有G418的培養(yǎng)液中生長，故便于篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的細胞。另一種為供治療用的基因,治療基因和標記基因可識別受控于不同啟動子,其中一種受逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR調(diào)控,另一種常需連接另外的啟動子序

27、列,或者連接一種稱為內(nèi)核糖體進入位點序列（IRES）,使轉(zhuǎn)錄成一條多順反子mRNA,在翻譯過程中IRES具有內(nèi)啟動作用，能啟動蛋白質(zhì)的合成，所以同一分子mRNA能合成2種或2種以上不同的蛋白質(zhì)。如何包裝成含有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒供治療用的呢？因為載體本身的3類結(jié)構(gòu)基因已被刪除，因此包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，需要靠一種所謂的包裝細胞，如PA317,提供，這種細胞含有一種缺失包裝信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒，只能產(chǎn)生包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，但本身的病毒RNA因缺失包裝信號,所以不會被包裝成病毒顆粒，這對治療的安全性很重要，可避免產(chǎn)生有復(fù)制潛能的逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）。將上述所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317,可產(chǎn)生供

28、治療用的含有治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒,見圖21-8,這種病毒能高效感染細胞,使治療基因能夠整合至細胞的染色體中,從而能長期表達基因產(chǎn)物,以達到治療目的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的優(yōu)缺點最大的優(yōu)點為能準確整合于宿主細胞的染色體中,所攜帶的外源目的基因及有關(guān)序列不會發(fā)生重排,因而能長期穩(wěn)定表達。感染細胞范圍較廣,感染率比較高,由于結(jié)構(gòu)基因均被刪除,因此免疫原性較低。對感染細胞無毒性作用。可附加不同的調(diào)控元件來提高外源基因的表達效率，并對之進行調(diào)控。局限性：逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在核膜尚未形成時，才能進入核內(nèi)，因此它只能將外源基因轉(zhuǎn)移至增殖分裂的細胞，而對靜止細胞轉(zhuǎn)錄效果不佳。由于該病毒基因本身不大，故能容納外源基因

29、的大小有限，應(yīng)小于8kb。逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定性較差，難耐受體外的操作，在純化或濃縮過程常使其感染性降低。病毒顆粒能迅速被補體破壞。因為是隨機整合，所以具有插入突變的危險，特別是病毒制劑中污染著RCR。其他病毒載體腺病毒感染人的腺病毒(adenovirus)有50余種血清型，能感染多種組織器官，產(chǎn)生類似感冒或類似流感癥狀，目前多數(shù)采用無致病性的5型及2型腺病毒作為載體。構(gòu)建載體時ITR及包裝信號應(yīng)保存，其余的部分有些可刪除，供外源基因的插入,插入片段的大小可達8kb。腺病毒載體較穩(wěn)定，能耐受純化濃縮等操作，可獲得高滴度的病毒顆粒，感染宿主細胞范圍較廣，感染效率高，既能感染分裂相細胞，也能感染非分裂相

30、細胞，但腺病毒不整合于宿主細胞染色體，故只能短暫表達外源基因，最大的缺點為引起機體的免疫反應(yīng)和毒副作用。腺相關(guān)病毒屬微小病毒科，不致病，為單鏈DNA約kb，腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus)，作為載體最大的優(yōu)點能感染分裂相和非分裂相細胞，并整合于宿主細胞染色體，能長期穩(wěn)定表達，無不良反應(yīng)，適合于一些遺傳性疾病如甲型和乙型血友病的基因治療。但腺相關(guān)病毒載體的制備因需要輔助病毒的參與，有污染的可能性。其他慢病毒（如HIV）、I型單純性皰疹病毒、痘病毒和桿狀病毒等都被研究發(fā)展作為轉(zhuǎn)移基因的載體。（三）脂質(zhì)體上述病毒載體最大的特點是能高效轉(zhuǎn)移外源目的基因，但是也存在著許多的局限性

31、，特別是免疫原性強和可能造成細胞突變危險。因此發(fā)展非病毒載體倍受基因治療研究者的注意。借助物理、化學(xué)方法或直接將外源基因?qū)胨拗骷毎麅?nèi)。脂質(zhì)體（liposome）主要是由天然磷脂和膽固醇類衍生物組成類似生物膜的脂質(zhì)雙分子層包圍水相形成的閉合囊泡。脂質(zhì)體有兩類：一類為陽離子脂質(zhì)體，表面帶正電荷，由于DNA帶負電，因此借正電荷的作用，可以濃集和縮合DNA，形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物（lipoplex）可攜帶的基因不受DNA大小的限制，見圖21-9O目前基因治療所用的脂質(zhì)體都是陽離子脂質(zhì)體。另一類為帶負電脂質(zhì)體，表面帶負電，DNA或其他藥物被包埋在內(nèi)部水相中。由于脂質(zhì)體具有類似生物膜的性質(zhì)，因此當脂質(zhì)體

32、DNA復(fù)合物與細胞膜接觸后，通過胞吞作用（endocytosis）而進入胞內(nèi)。脂質(zhì)體載體除上述介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移不受大小限制外，最大的優(yōu)點為無生物源性，無毒性，更安全可靠。但是轉(zhuǎn)染效率很低，而且是短暫表達。（四）裸DNA裸DNA（nakedDNA），即將外源基因構(gòu)建于真核表達質(zhì)粒，借助物理的或機械方法直接將其導(dǎo)入宿主組織細胞內(nèi)。橫紋肌和心肌攝取裸DNA的效率較高。若外源基因表達產(chǎn)物可激發(fā)機體免疫反應(yīng)，以防治某些疾病，可稱為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種非常有希望的新型疫苗。直接注射裸DNA轉(zhuǎn)染效率不高，常借助一些物理方法。基因槍(genegun)，通過高壓放電產(chǎn)生強烈的沖擊波(sho

33、ckwave)，作用于被金包埋的DNA微粒，使DNA微粒加速運動，即顆粒轟擊(particlebombardment)而穿透組織細胞，此法不但可用于體外轉(zhuǎn)移基因，而且已用于臨床將表達IL-12質(zhì)粒導(dǎo)入淺表腫瘤組織。矩形波電穿孔儀(squareelectroporator)這種儀器能產(chǎn)生低電壓的矩形波,使細胞穿孔，讓DNA進入，因為產(chǎn)生的僅是使細胞穿孔的矩形波，可避免一般電穿孔儀產(chǎn)生的高電壓造成細胞損傷的缺點，電壓的范圍為5-500V，加壓間隔為100毫秒-1秒。這種儀器可用于體外基因轉(zhuǎn)移，也可用于體內(nèi)組織器官的基因轉(zhuǎn)移，據(jù)報道對肌肉組織的轉(zhuǎn)移效率比直接注射DNA高2個數(shù)量級以上，是一種很有前景

34、的基因轉(zhuǎn)移方法。基因治療的臨床試驗?zāi)壳芭R床基因治療試驗的方案已達9百多個，受治療的患者已有數(shù)千例表21-3可見當前臨床基因治療(genetherapy)或廣義地稱基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)試驗，有三種類型，即治療性、基因標記及非治療性試驗。后者將腺病毒載體注射于健康自愿者的體內(nèi)，觀察機體對腺病毒載體的反應(yīng)。這些方案的臨床試驗期(trialphases)極大多數(shù)為I期臨床試驗，III期者僅僅4個方案。說明基因治療臨床試驗尚處于未成熟階段。基因標記目前常用的基因標記方法是將含neoR基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，然后回輸至病人體內(nèi)，可以很方便地跟蹤這種標記細胞的命運，用來研究許

35、多其他方法不能回答的體細胞移植的生物學(xué)問題。美國第一個被批準基因標記的臨床研究計劃是NIH的Rosenberg等的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltratinglymphocytes,TIL）基因標記實驗。他將惡性黑色素瘤組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)制成單細胞懸液，在IL-2的作用下淋巴細胞可成倍增殖而腫瘤細胞及其他類型細胞則死亡。這種TIL能特異殺傷腫瘤細胞。先在體外將含有neoR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL，該載體能整合至TIL的基因組，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培養(yǎng)液中生長，便于篩選；也可用PCR檢測neoR基因是否存在，以跟蹤回輸體內(nèi)的TIL的去處。將這種基

36、因修飾過的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在體內(nèi)各組織器官、血循環(huán)細胞、淋巴結(jié)、腫瘤組織的分布情況；特別感興趣的是觀察TIL是否能靶向腫瘤組織；同時也可以研究TIL在體內(nèi)存活期的長短；以及了解這種體外基因修飾過的TIL是否會自主生長和惡變？注射后對人體是否有害？這些問題的闡明可為基因治療打基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因修飾過的TIL在體外不會自主增殖，說明沒有惡變。在注射后的頭3周，用PCR可測出外周血存在著含有neoR基因的單核細胞，有的長至60d尚可測出。在注射后3d活檢的腫瘤組織也可測出有基因修飾過的TIL的存在。有人對其他細胞如骨髓細胞、肝細胞和細胞毒淋巴細胞等進行標記研究。（二）單基因疾

37、病遺傳性單基因疾病（monogenicdiseases）是基因治療的理想侯選對象，設(shè)計治療方案時應(yīng)考慮下列幾點因素：對造成該疾病有關(guān)的基因應(yīng)有較詳細的了解，并能在實驗室克隆適合真核細胞表達的有關(guān)基因的cDNA序列，供轉(zhuǎn)導(dǎo)用。經(jīng)有功能基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體細胞，只要產(chǎn)生較少量原來缺少的基因產(chǎn)物就能矯正疾病。例如腺苷脫氨酶（ADA）缺乏的嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID），由于淋巴細胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆積，可破壞免疫功能，患兒很少活至成年。若淋巴細胞ADA恢復(fù)至正常水平的5%10%即能維持免疫系統(tǒng)的功能，對病人癥狀就有改善，這是第一個基因臨床治療的方案。血友病B,是由于凝血因子IX缺乏所致。現(xiàn)知

38、只要因子IX水平達到正常的10%20%就能緩解嚴重的血友病。對血友病A而言，只要因子伽達正常水平的5%就能緩解癥狀，血友病已開始基因治療臨床試驗。即使導(dǎo)入基因過度表達，對機體應(yīng)無不良作用。有些遺傳疾病是某些特殊細胞基因缺損造成的，但那有關(guān)的細胞不易取出供體外基因工程操作用。例如Parkinson癥是腦黑質(zhì)細胞(substantianigra)的酪氨酸羥化酶缺乏，不能產(chǎn)生多巴胺(dopamine),給病人注射多巴胺可減輕癥狀。動物模型試驗表明，將酪胺酸羥化酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)成纖維細胞，再移植至腦內(nèi)，可以減輕動物模型的異常行為。現(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來增補體內(nèi)的缺乏基因，因此要求增補的基因在病人

39、壽命期間能穩(wěn)定表達，或重復(fù)治療，所以應(yīng)考慮構(gòu)建能長期持續(xù)穩(wěn)定表達外源基因的載體，并考慮將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細胞，如造血干細胞以望回輸體內(nèi)后其子代細胞也含有外源基因。目前應(yīng)用基因治療的單基因疾病已有二十多種。惡性腫瘤惡性腫瘤屬復(fù)雜基因疾病(complexgeneticdiseases)，可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過程是多步驟的，至今雖有不少有關(guān)的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機制尚未清楚，因此治療時應(yīng)選擇何種靶基因不明確，多數(shù)是根據(jù)不同的環(huán)節(jié)，設(shè)計不同的治療策略，目前臨床惡性腫瘤的基因治療策略有十余種之多。見表21-4。1.免疫基因治療(immunogenetheray)分體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)二種。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)將一些能刺激免疫反應(yīng)的細胞因子基因，如IL-2、IL-12、IFN-Y等轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細胞作為基因工程“瘤苗”，給腫瘤患者注射，宗旨為提高腫瘤細胞的免疫原性，有利于被機體免疫系統(tǒng)識別及排斥；由于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞因子基因的腫瘤細