1、鏈霉素發酵工藝驗證方案目的：確認鏈霉素發酵系統工藝流程，確認種子工藝、小小罐工藝、小罐工藝、中罐工藝、大罐發酵工藝，驗證該發酵系統工藝的穩定性和牢靠性及制備 的發酵液能否到達中間體規格要求。范圍：50驗證地點：403驗證對象：原斜面代 、代 斜面12母瓶子瓶小小罐小罐中罐大罐驗證步驟：確定驗證方案，確定驗證打算，內容、步驟，以便準確驗證鏈霉素發酵系統。驗證措施概要：生產記錄：原斜面：冷藏期10外觀無菌外觀集落:白色飽滿、正常代 或代1142外觀無菌外觀集落：白色飽滿、正常母瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲681700u/ml963500u/ml 6700u/ml冷藏期5菌

2、絲IIIII子瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲120小時7000u/ml144 小時7500u/ml冷藏期7 天 菌絲IIIII小小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌PH7.5小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌1200u/m3.5g/100m PH7.5中罐：菌絲IIIII鏡檢無菌1800u/m3.5g/100m PH7.5大罐：放罐殘糖2.0 克/100毫升放罐殘氮120毫克/100毫升放罐透光度40%放罐效價14000u/ml原材料：生產過程中所用的各種原材料及其規格見原材料一覽表設備：生產鏈霉素所及設備見設備一覽表。以上所及設備的每一局部，必需在本次驗證前確保經過適當鑒定IQ/O

3、，并且任何相關的測試裝置經過校正。人員培訓，作為驗證爭辯的一局部，涉及生產鏈霉素發酵的每位職工均經GMP及有關崗位SOP培訓。生產程序和流程表：生產過程的描述：我廠用于生物合成鏈霉素的生產菌種為灰色鏈霉菌，為了保持菌種的24冰庫內，或者將孢子制成牛奶懸濁液，密閉冷藏于196液氮中。每年對生產菌株進展兩次自然分別，把握菌落變異率5%，并進展菌絲八代遺傳穩定性考察，考察其母、子代謝及效價單位的穩定性。挖取清潔海灘細沙不能污染各種有機物100 吸盡砂內鐵屑備用，挖取郊區地面二尺深處的黃土不能污染各種有機物120 目篩子過篩,用磁鐵充分吸盡土內鐵屑備用。以上處理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分裝

4、于玻璃試管12100m，每支裝1g，用紗布棉塞塞緊置于小銅線筐中，放消毒鍋消毒，間歇滅菌三次，每次壓力0.12MP122111 120、45 小時，外說明批號、日期備用，使用前為確保無菌起見，應按以上要求再消毒烘干一次。取符合質量要求的孢子斜面一支，在無菌操作下,參加 0.85%氯化1ml 1#棒將外表孢子輕輕刮下防止用力過重劃破瓊脂1ml 割頭無菌吸管吸出，準確認真地在每支無菌空白砂土管內加 0.1ml 孢子液參加時應留意將吸管伸至接近沙土處，但又不能接觸沙土，也不能使吸管口接觸沙土管口及內壁。塞緊棉塞，將沙土敲松攤開，放在真空枯燥器內枯燥器內放置氯化鈣枯燥劑0.10MPa4 4 5 支或以

5、上時，抽干時間酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有無水24冰庫中保存備用。使用時承受2 年。市售穎牛奶離心三次，3000rpm,15分鐘棄去上層脂肪,將脫脂牛 分鐘消毒。121，60 分鐘，間隙滅菌三次，待用。2#棒輕輕將孢子刮下，用無菌吸管吸孢子牛奶懸濁液置滅菌珠子瓶，10 分鐘,1ml 無菌吸管將珠子瓶內的孢子牛奶懸濁液參加無菌安培管中，0.3ml/5年。100 級，每三個月對塵埃粒子0.5u 的塵埃3.5 /1L空氣、風速0.35m/、無菌定點開啟雙碟分鐘1 個/碟進展測定。尋常每次操作定點放置定點開啟雙碟30 分鐘，把握雜菌菌落1 個/碟。每天用前紫外光消毒一小時，每三個月調換消

6、毒劑1/600潔爾滅、75%酒精。孢子斜面：取生產用之孢子沙土管或孢子冷凍管在無菌室內，用操作棒勺取適量27167 天，該生長成之孢子斜面稱為原斜面，僅作孢子傳代使用，不能制備母瓶，液氮冷凍孢子接出原斜面。依據質量2410 天。斜面外觀除了個別不正常集落以外，應大部份為白色，飽滿梅花型， 饅頭型、圓型之集落，將原斜面孢子，選擇23 只正常集落點種第一代，用第一代傳代斜面同樣點種其次代傳代斜面，第一其次代孢子斜27l67 天，第一、其次代斜面14 天，均可制作母瓶，孢子斜面傳到其次代為止，不再傳第三代，挖塊制作過母瓶之剩余孢子斜面，應保存在冷藏庫中一個月，以備檢用。斜面培育基配制法：名稱配比 %

7、葡萄糖注射用0.81.2蛋白胨0.30.6氯化鈉0.40.6豌豆浸出液1216瓊脂海燕牌2.02.8pH7.07.4C (g/100ml)C (g/100ml)N (mg/100ml)P (ug/ml)pH0.9-1.232-3860-906.8-7.5豌豆浸出液制備：豌 豆： 30 克氯 仿： 0.5%二次1000ml1M H SO ：調pH用2430 克豌豆洗凈瀝干，參加1000ml1M H SO pH至244.50.5蓋緊放置于 371MH2SO4 調整PH 值維持在 4.24.50.5%371 6 天，粗濾20 去除氯仿750ml 搖瓶中，每瓶裝量約200ml0.09Mpa、11812

8、020分鐘，冷卻后放入冰箱中備用。同時抽樣送化驗，檢驗質量，在使用該批豌豆浸出液時，必需再送一次樣品，測定氨氮含量與第一次相接近時可按后一次樣含量計算使用，如其次次含量與第一次不符，須再抽樣復試，以最終一次化驗數據為準進展計算使用。豌豆浸出液質量：工程工程外觀氨氮NH -N24無菌狀況磷(PO )規格澄清液170200mg/100ml600ug/100ml左右無雜菌4.1.4母瓶：用符合質量標準的同支孢子斜面冷藏期不超過14 天在無菌室內用挖塊法分別將孢子接種到已預備好之二只搖瓶中，編號為母I 母 II， 接種后送至溫度 27l23020r mm搖瓶機上，5064II 一IIII 用牛皮紙包扎

9、存放于24II 連續培育作質量檢查，做無菌試驗二支，分別進展2737培育。68 PH、uml24 小時取一次樣測定上述工程，共計三次68 小時， 96 小時，120小時三次如母瓶質量符合要求，則母瓶可以進罐使用，5 天。制得的母瓶應菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒、米黃色、無異味不化稀無菌正常。效價：120 小時6700uml。接子瓶的母瓶制備法，用無菌操作挖一塊斜面，接入一只母瓶，在搖瓶5064 顆粒狀菌絲的母瓶，作為接子瓶用，接種子瓶的母瓶不冷藏。遇特別5天。母瓶原材料及配比方下：原材料葡萄糖配比%3.55.5黃豆餅粉碳酸鈣硫酸銨3.04.50.50.80.50.8氯化鈉磷酸二氫鉀0.250.5

10、0.040.07消后質量規格：CC(g/ml)N(mg/100ml)P(ug/100ml)3.84.8130155130155子瓶：取符合種子質量標準之母瓶，在無菌操作條件下，用吸管接入已預備吸管做無菌試驗斜面一支，在37恒溫室培育，接種后子瓶送 27l3044 IIIII 初，長好后，留120 144 小時分別取樣測定效價，一瓶測粘度及氨氮，一瓶接無菌斜面二支作無菌試驗分別培育于273恒溫室及觀看菌絲形態菌株要加測C及P247 天，如在保存期間覺察有化稀現象或有染菌嫌疑，即停頓使用，改用其他批號種子，放搖23 批瓶存備用。制得的子瓶應菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒，米黃色，無異味。不化 子瓶原材

11、料及配比方下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黃豆餅粉2.33.5碳酸鈣0.20.7硫酸銨0.50.7氯化鈉00.2磷酸二氫鉀0.0450.07豆油1L玉米漿00.2消后質量規格：N(mg/100ml)160180P(ug/100ml)155180C(g/ml)C(g/ml)6.04.8在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內的沖洗及閥墊的更換檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及15 分鐘并檢查過濾器有無培育基倒流。培育基實行實消：0.160.19MPa 進展投料實消。先加水至攪拌處，然后投入已配好的培育基，攪拌成勻漿0.070.12MPa 時20 115124，完畢后

12、保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。28 0.1m3小時流0.5m323 只小罐作種子用。接4 8 PH C 和效價，25 8 NII III 初階2 小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培育條件：271，35030rmin，4668h，0.5m3/分，假設種子罐生長過程中pH 量，調整配方等工藝調整措施，以期使各級種子罐質量符合種子質量要求。小小罐原材料及配比方下：原材料名稱葡萄糖 黃豆餅粉硫酸銨 碳酸鈣小小罐120L配比3.55.52.53.50.50.70.20.7小小罐(500L)配比磷酸二氫鉀玉米漿0.0450.070.10.2(機動)豆油1L/罐批氯化鈉配料體積100L0.10

13、.2250L消后體積100L250L消后規格如下小小罐小小罐pH6.08.0C2.84.4N115170P120200小小罐把握規格：消后CNP 必需符合質量要求，假設不符合則重投料、消毒。中間把握溫度必需在271，超過30時間較長則不能作為種子。染菌罐不能作種子用。氨氮在中間代謝中必需漸漸利用，假設后期上升則不作種子用。5放罐把握：殘糖3.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價800uml。IIIII 初為主。2 3 瓶以上。小罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內的沖洗及閥墊的更換，檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接15 分鐘并檢查過

14、濾器有無培育基倒流。培育基實行連消：經清洗，檢查嚴密后的罐批方可進展空消，空消時0.160.19MPa 時，排出罐內冷凝水后再開頭計算4045 1251300.080.1MPa 時導入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態。連消時總蒸汽壓力不低于 0.25MPa，按生產進度把各類罐空消完畢， 0.20.25MPa，45 分鐘后可進入連消連消時通過泵把培育基輸入消毒維持罐0.2MPa，126135、56噸h。消入罐中，冷卻培育基至近培育溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。0.160.19MPa 壓力跌 0MPa 進展投料實消。則先加水至攪拌處，然后投入已配好的培育基，攪拌成勻漿狀加熱。翻開各支

15、路蒸汽，關閉罐蓋待壓力上升0.070.12MPa2025分鐘，消毒溫度為115124，完畢后保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。0.2m3分，5 lm3分，一只小罐種子通常移入一只中罐，特別狀況時一只小罐種子可移入二只中罐。4 8 PH C 和效價，25 8 小時測N，種子罐移種標準菌絲呈IIIII 初階2 小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培育條件：271，33020rmin，4060h，1m3/分。假設種子罐生長過程中遇代謝過快時可適時降溫培育，遇代謝慢種子罐PH 上升，可削減通氣量，小罐原材料及配比方下：原材料名稱原材料名稱小罐(500L)配比葡萄糖4.55.5黃豆餅粉2.53.5

16、硫酸銨0.50.7碳酸鈣0.20.7磷酸二氫鉀0.050.07玉米漿0.10.2(機動)豆油1L/罐批氯化鈉0.10.2配料體積250L消后體積250L消后質量規格如下：小 罐小 罐pH6.08.0C3.55.5N120180P130190小罐把握規格：消后P必需符合質量要求，假設不符合指差距較大接種前必需訂正。271。染菌罐不能作種子用。4放罐把握：殘糖3.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價1200uml。IIIII 4048 小時。中間代謝中，氨氮必需逐步利用。2 只小罐。一只小小罐可全部接入中罐作種子用。中罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內的沖洗及閥墊的

17、更換，檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及閥門等，如15 分鐘并檢查過濾器有無培育基倒流。0.160.19MPa 時，排出罐內冷凝水后再開頭計算4045 125130罐壓維持在 0.080.1MPa 時導入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態。連消時總蒸汽壓力不低于 0.25MPa， 按生產進度把各類罐空消完畢，同時各所用管路也必需經蒸汽消毒，壓力 0.20.25MPa，45 分鐘后可進入連消，連消時通過泵把培育基輸入消毒維持罐，連消條件為0.2MPa，126135、56 噸h。消入罐中，冷卻培育基至近培育溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。中罐由小罐移入種子

18、或整只小小罐移入，開頭加空氣流量，前5 小360m3h，每二只中罐可移入一只大罐。各級罐壓出種子前均先用被接種罐內培育基壓到壓出罐接種管進展冷卻管道，防止燙傷種子。4 8 PH C 和效價，25 8 小時測N，種子罐移種標準菌絲呈IIIII 初階2 小時須將種子液涂片鏡檢什菌狀況。培育條件：271，18020rmin，3560h，6 m3/分，假設種子罐生PH 削減通氣量，調整配方等工藝調整措施，以期使各級種子罐質量符合種子質量要求。原材料葡萄糖原材料葡萄糖 黃豆餅粉硫酸銨 氯化鈉 碳酸鈣 玉米漿 豆油硫酸二氫鉀配料體積消后體積配比%4.55.52.53.50.50.70.102(機動)0.2

19、0.70.10.2(機動)8L/罐0.050.073.23.5M3.03.2M消后質量規格如下：PHPH消 后 C消后N消后 P6.08.0(g/100ml)3.55.5(mg/100ml)120180(r/l)130190中罐把握規格：CNP 必需符合質量要求，假設不符合指差距較大在接種前必需實行措施訂正。中間把握溫度必需在271，超過30時間較長則不能作為種子用。染菌罐不能作種子用。氨氮在中間代謝中必需漸漸利用。菌齡必需以把握菌絲階段IIIII 3050 小時。接種量一只小罐接一只中罐，或一只小小罐可接一只中罐。7放罐把握：殘糖3.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，

20、效價1800uml。8小小罐、小罐、中罐遇到氨氮消耗快時可將罐溫調整到26 0. 5培育。大罐：大罐放罐后，降罐壓至零磅，開蓋用水沖洗，將沖洗后的殘留發酵液，壓入提煉承接桶內，再翻開罐蓋，進罐內去除積垢后，檢查攪拌，空 氣分布管，葉子及上下婆司是否松，同時進展閥墊及填料的更換和檢 修工作。然后蓋好罐蓋，通入空氣，進展各連接處法蘭等、閥門、配 根、罐蓋、氨水、空氣等嚴密度檢查。待檢查完畢后，蓋緊罐蓋、準 備下次空罐消毒。如遇染菌，可下去敲鏟，去除積垢，空消時延長消 30 分鐘。罐空消：0.160.19MPa 進展壓水后進展45 0.080.1MPa 保壓，假設上一罐批染菌，則金屬過濾器進展消毒。

21、發酵罐培育基消毒：0.3MPa，用泵將已配制的氮源餅粉等碳源糖水依次分別進入消毒塔、維持罐消0.2MPa58分鐘。 2 噸自來水，最終可酌情消入自來水補足體積。發酵罐原材料及配比方下：原材料原材料黃豆餅粉葡萄糖硫酸銨配比1.82.24.06.00.20.7氯化鈉碳酸鈣 磷酸二氫鉀豆油 玉米漿 氯化鈷 配料體積消后體積00.20.20.70.060.091030L0.10.20.23440M2537M消后質量規格如下：pHC(g/100ml)大于6.24.56.5消后 N (mg/100ml)130160消后 P(r/ml) 2002603040M378分鐘后，004006MPa，開啟入罐閥接入

22、培育基，當培育基遇到蛇形管、即開冷卻水冷卻。當接料完畢，關閉入罐閥，進空氣，保持罐壓 008009MPa，待溫度冷至29預備接種。消后測PH要求 62 以上，如低則加NaOH 調整。接種前、接種后取樣測C、N、P、PH并做無菌測驗。發酵罐大罐接種和培育，發酵工藝。發酵罐接種：01MPa 以上，保持發酵罐之0.030.05MPa，翻開接種入罐閥，種子罐中罐或倒動身酵罐菌液借壓力差流入發酵大罐內，接完后關罐入罐閥，開入適量空氣流量在 10m3分以上，保持罐壓先將罐內培育基壓到壓出種子罐接種管道進展管道冷卻，防止燙傷種子。發酵罐培育和工藝接種：發酵大罐由2348110hr35t。各級罐壓出種子前均先

23、用被接種罐罐內培育基壓到接種罐進展冷卻管道，防止燙傷種子。IIIII2液涂片鏡檢什菌狀況.培育條件罐溫:2630，一般把握在29，罐溫測定用電阻溫度計量來2527培育，后期代謝慢的罐批30培育數小時至放罐。罐壓:。空氣流量:10m分以上，不開攪拌，以后逐級增加流2530m/4555。如遇發酵后期反響劇烈，可適當降低空氣流量和提高罐壓。攪拌轉速:大罐正常轉速在 110120rmin，亦可依據生長代謝進展調速。前期70時，攪拌全開，中后期攪拌全開。培育時間:16010中間取樣:8214pH，2010081002440814000uml，透光度40%。發酵大罐中間把握消沫：前期或后期發酵猛烈時可少量

24、屢次加油，中期由于補糖量增加液面上升也可酌情加油，假設加油無效可放提煉假設干噸。補糖：30504060，203046反常罐可酌情減量補入。第一次把握殘糖含量缺乏部份添加至4.85.2%其次次把握殘糖含量4.85.0%第三次把握殘糖含量4.04.5%第四次把握殘糖含量2.52.8%第五次把握殘糖含量1.72.0%特別狀況一次補糖量3.0時以分二次補入為宜，第三、四、五次補0.5則第五次糖可以不補。后期把握補糖量應與氮耗相調，防止發酵液化稀。補氮：補氮可用15的無菌過濾氨水或NHSO4241依據殘氮用量計算通氨量參考控氮水平。3參考代謝及濃度。204035l35l次通氨為流加，生長期最適pH6.56.9，氨氮水平可在90120mg100m40PH把握在6.87.，80100mg100mlpH7.10NHSO424替氨水，以調低 pH SO0.l20mg100ml NHN。硫4242酸氨把握補入量0.11401207585mg10