1、溫莪術內生真菌的別離及其分類鑒定【摘要】目的對溫莪術不同部位內生真菌進別離和分類鑒定。方法采用內生菌常規別離法對安康溫莪術根、莖和葉的內生真菌進展了別離和鑒定。結果從溫莪術中別離得到了99株內生真菌，經鑒定為21屬，其中根部42株涉及11屬，莖部12株涉及4屬，葉部45株涉及12屬。結論溫莪術的不同部位內生真菌的數量、分布和種群存在差異?！娟P鍵詞】內生真菌；別離；鑒定；溫莪術IslatinandIdentifiatinfEndphytiFungifruruaaratiaSalisbAbstrat：bjetiveTislateandidentifytheendphytifungifdiffere

2、ntpsitinsinuruaaratiaSalisb.ethdsEndphytifungiereislatedfrhealthyrts,stesandleavesfuruaaratialSalisbandidentifiedithnventinalethd.ResultsNinty-ninestrainsfendphytifungibelngt21genusereislatedandrhplgiallyidentifiedfruruaaratiaSalisb.Frty-tstrainsf11generaereislatedinrts,12strainsf4generainstes,and45

3、strainsf12generainleaves.nlusinThequantity,ppulatinanddistributinftheendphytifungiarevariusindifferentpsitinfuruaaratiaSalisb.Keyrds：Endphytifungi；Islatin；Identifiatin；uruaaratiaSalisb植物內生真菌(EndphytiFungi)是存在于安康植物組織、器官內，并不引起明顯病害病癥的一類真菌1。植物與真菌的共生現象在生物進化過程中歷史悠久而又極其普遍。雖然人們很早就知道內生真菌的存在，但直到1977年才對其重要性有所認

4、識2。通過二十多年的研究，人們發現，作為地球上一類古老而又普遍的共生生物，植物內生真菌不僅可以提供人類豐富的藥用性次生代謝產物3，而且有可能從整體上參與和協調植物與環境因子(包括病原微生物)的互作過程，從而對植物的抗逆性和環境適應性產生積極的影響4。溫莪術為姜科植物溫郁金uruaenyujinY.H.henet.Ling的枯燥根莖,其味辛、苦,性溫。具有行氣破血、消積止痛的作用5。含有莪術油、姜黃素、多糖、木脂素類、脂肪酸類及微量元素等多種不同生物活性的化學成分6?，F代藥理研究說明,溫莪術具有抗腫瘤、抗血栓、抗菌、抗病毒等作用,對呼吸系統、消化系統、泌尿生殖系統、循環系統疾病和皮膚潰瘍都有較好

5、的療效7。由此，人們對它的關注也由來已久。但至今對溫莪術內生真菌的研究報道還很少，假如能在溫莪術內生真菌中可以發現類似的活性物質，無疑找到了一種可替代溫莪術植物的新型生物資源，為此本實驗對溫莪術內生真菌進展了系統的研究?，F將溫莪術內生真菌的別離鑒定結果及種群分布報道如下。1材料1.1材料別離所用植物材料為溫莪術根、莖、葉，采自溫州醫學院莪術種植基地不同生長時期的溫莪術，無病蟲害。1.2培養基內生真菌別離培養基為PDA培養基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000l)和A抗生素培養基(瓊脂20g，氨芐青霉素200g，鏈霉素200g，水1000l)；純化鑒定培養基為PDA培養基和查氏

6、培養基蔗糖30g，NaN32g，Kl0.5g，gS47H20.5g，FeS40.01g，K2HP41g，瓊脂1520g，水1000l。2方法2.1內生真菌的別離取溫莪術的根、莖、葉，用刀切成23的小塊，按以下步驟進展外表消毒：自來水沖洗干凈，75%的酒精漂洗12in，無菌水沖洗3in，0.1%的升汞漂洗1020s，無菌水沖洗45次。上述處理過的樣品，在無菌狀態下切割成約0.50.5的小塊(片),分別置于已倒好的A抗生素平板培養基和PDA平板培養基上，放置在28條件下。2.2內生真菌的純化接種物培養37d后，觀察皿中材料切口處長出菌絲(菌落)，挑取切口處菌絲尖端轉接到新的PDA平板上，待長成菌落

7、后，根據菌落形態、顏色的差異及長出時間的不同，分別挑取其邊緣的菌絲進展別離培養，觀察菌落的形態及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應記錄。采用菌絲頂端純化法如此反復純化后，轉入PDA斜面培養基上，于28培養箱中培養57d后，對菌株進展編號，并放入4冰箱保存。2.3菌種的鑒定采用直接挑取制片法和插片培養法，觀測菌種在培養過程中菌絲、個體發育、產孢構造和孢子形態等特征，對別離得到的內生真菌進展顯微形態觀察、分類鑒定811。3結果3.1別離方法的比擬本實驗過程中嘗試了組織研磨涂平板和組織切片別離兩種方法。結果說明研磨法的優點是能獲得較多菌株，但外表消毒驗證效果不佳，且菌株不易純化；而組織切片培養的方法操作

8、簡單，外表消毒驗證效果可靠，菌株易純化。為此本研究最終選擇了外表消毒后組織別離培養的方法。轉貼于論文聯盟.ll.3.2溫莪術內生真菌的別離及分類鑒定結果從溫莪術根、莖、葉組織別離中,共獲得內生真菌99株。結果見表1。表1溫莪術內生真菌的別離鑒定結果略從表1可看出，植物組織的部位不同,別離獲得的內生真菌種類不同。從分布上來看，99株內生真菌中，根局部布42株內生真菌，占總菌株數的42%，11個屬，占21個屬的52%；莖局部布12株0內生真菌，占總菌株數的12%，4個屬，占21個屬的19%；葉局部布45株內生真菌，占總菌株數的45%，12個屬，占21個屬的57%。由此可見，溫莪術內生真菌主要存在于

9、植株的根和葉中，莖部相對較少。3.3溫莪術內生真菌的種群組成從溫莪術不同組織中別離得到的99株內生真菌，經顯微形態觀察，初步鑒定為5目、6科、21屬，另外，還有9株不產孢，為無孢菌群見表2。表2溫莪術內生真菌的種群組成略由表2可知，溫莪術內生真菌以鐮孢霉屬為優勢種群，約占總數的13%；其次為曲霉屬和青霉屬，約占總數的10%；此外，無孢菌群在其內生真菌中也占有較大的比例。從表中可見溫莪術內生真菌最明顯的特征是在種類組成上具有多樣性。4討論在內生菌的別離過程中，進展外表消毒時,0.1%升汞的漂洗時間不能長,尤其是對于幼嫩的葉片消毒時間要比根莖更短,否那么別離到的菌落少,甚至會把內生菌全部殺死。所別

10、離的真菌在查氏培養基上一般生長較緩慢,在馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)上生長較快,許多真菌在PDA上有色素產生,而在查氏培養基上無色素產生。PDA營養比擬齊全,所以培養效果好,生長快,這主要是營養條件決定的,因此，我們培養真菌一般用營養條件好的PDA,而在鑒定時一般用查氏培養基,因查氏培養基成分清楚,干擾小,在其上生長時真菌的各種鑒定的特性更易顯現出來。從溫莪術根、根狀莖、莖、葉等部位別離到99株內生真菌,說明該植物體內伴生微生物的多樣性比擬豐富,植物內生真菌一方面表現出能與植物互相協調生活與植物形成共生關系,另一方面有些真菌也為植物病原菌,平時不引起植物發病,但它們對于無病癥寄主而言仍存在一定

11、威脅性,不同的微生物能互相作用,并建立一種平衡,在植物體內形成一種相對穩定的真菌菌群,其中一些是別離頻率高,數量大的優勢菌種,而另一些屬于稀有菌種。通過對溫莪術不同部位的內生真菌的別離,發現植物組織和部位不同,別離獲得的內生真菌種類不同。溫莪術不同組織別離內生真菌的頻率順序為葉片根莖,說明內生真菌在溫莪術不同部位的分布不同。研究結果說明,對于別離率較高的鐮孢霉屬和曲霉屬在根莖葉中都可以別離出，顯示它們可以系統性分布于宿主中，而頂毛單胞霉屬和星刺殼孢屬僅分布在莖部，其余各屬均分布在根和葉部。這一結果說明一些內生真菌可能具有一定的組織專一性。植物內生真菌和其宿主之間存在復雜的生物化學互相作用,植物

12、形成的某些次生代謝產物可能就是內生真菌轉化宿主組織中的前體物質所形成,本研究為進一步討論植物與內生真菌的互相關系提供了重要的資料?！緟⒖嘉墨I】1尹建雯，陳有為，李治瀅，等.蘆薈植物內生真菌的研究抗菌活性初探J.微生物學雜志，2022，24(2)：30.2陳暉奇，徐焰平，謝麗華,等.茶樹內生真菌的別離及其在寄主組織中的分布特征J.萊陽農學院學報(自然科學版)，2022，23(4)：250.3鄒文欣，譚仁祥.植物內生真菌研究新進展J.植物學報，2001，43(9)：881.4RdriguezRJ,RedanRSandHensnJTherleffungalsybisesintheadaptatinfplantsthighstressenvirnentsJ.itigatinandAdaptatinStrategiesfrGlbalhange，2022，9：2615國家藥典委員會中國藥典,部S.北京:化學工業出版社，2022：194.6胡潤淮,邵清松.溫郁金化學成分研究進展J.時珍國醫國藥，2022，187：1773.7李國棟，許付，沈愛軍.莪