1、第二章生物大分子的純化方法蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題達到足夠純度的生物大分子的制備工作作為前題 。概 述 沉淀法（包括：鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀等）離心吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。常用的分離純化方法和技術有：沉淀法沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。基本原理：溶解度的不同不同溶解度的產生的原因：親和力的差異溶解度的大小與下列因素有關：溶質和溶劑的化學性質及結構加入某些沉淀劑溶液的pH值、離子強度和極性中性鹽沉淀法（鹽析法）有機溶劑沉淀法蛋白質沉淀法有機聚合物沉淀選擇性沉淀法（熱

2、變性沉淀和酸堿變性沉淀）結晶沉淀法 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：中性鹽沉淀（鹽析法）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。在蛋白質領域應用最廣，其突出的優點： 成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡單、安全。 對許多生物活性物質具有穩定作用。 中性鹽沉淀蛋白質的基本原理 鹽分級沉淀：多次鹽析的應用中性鹽的選擇： 常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：1) 溶解度大： 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9

3、 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012) 分離效果好3) 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的作用 4) 價格便宜，廢液不污染環境缺點：需要一定時間脫鹽鹽析的操作方法：固體法、飽和溶液法、透析法最常用的是固體硫酸銨加入法原則：緩慢均勻少量 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄（p24-25）中查出。鹽析曲線的制作如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉淀該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：取待分離樣品溶液(已定量測定蛋白質或酶的活性與濃度)，冷至05，調至該蛋白

4、質穩定的pH值，分610次分別加入不同量的硫酸銨第一次加硫酸銨至蛋白質溶液剛剛開始出現沉淀時，記下所加硫酸銨的量，這是鹽析曲線的起點繼續加硫酸銨至溶液微微混濁時，靜止一段時間，離心得到第一個沉淀級分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個級分，如此連續可得到610個級分按照每次加入硫酸銨的量，在附錄中查出相應的硫酸銨飽和度。將每一級分沉淀物分別溶解在一定體積的適宜的pH緩沖液中，測定其蛋白質含量和酶活力以每個級分的蛋白質含量和酶活力對硫酸銨飽和度作圖，即可得到鹽析曲線 蛋白質量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽和度 1) 蛋白質的濃度： 較適中

5、的濃度0.2 % 2.0%2) pH值對鹽析的影響：pI 3) 溫度的影響：離子強度 04 鹽析的影響因素：主要鹽析常數Ks常用方法：凝膠過濾法和透析法透析法：脫鹽基本原理降低水溶液的介電常數，使溶劑的極性減小有機溶劑脫水作用有機溶劑沉淀法 分辨能力比鹽析法高 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行 有機溶劑沉淀法的優點是：有機溶劑的選擇和濃度的計算與水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。進行沉淀操作時，欲使溶液達到一定的有機溶劑濃度，需要加入的有機溶劑的濃度和體積可按下式計算： V = V0 (S2 S1) (100S2)溫度： 一般規律是溫

6、度越低，得到的蛋白質活性越高 樣品濃度：蛋白質初濃度： 5mg/mL20mg/mLpH值：pI附近離子強度：鹽濃度5%，V2倍有機溶劑沉淀的影響因素僅對一類或一種蛋白質沉淀起作用堿性蛋白質、凝集素、種金屬蛋白質沉淀法聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4)(Polyethylene Glycol , PEG )親水性強，溶于水和許多有機溶劑對熱穩定有廣范圍的分子量在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為400 6000 的 PEG 有機聚合物沉淀法本方法的優點：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子沉淀后有機聚合物容易去除

7、原理：利用理化性質等方面的差異 熱變性 表面活性劑和有機溶劑變性 選擇性酸堿變性 選擇性變性沉淀法在特定的條件下，改變溶解度產生沉淀的方法。不等同于等電點沉淀法結晶沉淀法：透析自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有近150年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一作用:除鹽除少量有機溶劑除去生物小分子雜質濃縮樣品半透膜：纖維素將半透膜制成袋狀袋內外兩邊的濃度達到平衡為止 “保留液”“滲出液”或“透析液” MwCO擴散壓(透析的動力) 透析的速度: 膜的厚度 溶質的濃度梯度 膜的面積 溫度檢查透析效果的方法是：用 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用 AgN

8、O3 檢查NaCl、KCl等制備核酸DNA-蛋白質(DNP)RNA-蛋白質(RNP)去污劑有機溶劑蛋白水解酶DNPRNP復合物的解聚十二烷基硫酸鈉(SDS)或Tween40 乙酸鉀溶液 離心除去沉淀物上清液即為初步純化的核酸制品(1)去污劑苯酚、氯仿 上層水相(含核酸)和下層有機相界面：變性凝聚蛋白 收集水相(2)有機溶劑 水相和有機相的位置充分接觸，速度適當苯酚重新蒸餾異戊醇混合液 注意點 ：溶菌酶蛋白酶K 蛋白酶E (需滅活DNase)(3)蛋白水解酶雜質的消除(1)多糖 體內的糖原和淀粉自然分解選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，適用于酸性多糖)(2)DNA與RNA的分離 鹽析法 DNA和RNA在NaCl溶液中溶解度不同 1-2mol/L; 0.14mol/L 酶水解法 DNase和RNase核酸沉淀(1)有機溶劑 乙醇-鹽溶液 DNA片段1kb或核酸溶液濃度1kb的核酸溶液，置室